專利名稱：人類組織因子途徑抑制因子突變基因m的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及組織因子途徑抑制因子突變基因、含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌及其表達(dá)的蛋白。
背景技術(shù)：
人類組織因子途徑抑制因子(Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI)是組織因子途徑的重要抑制因子，作為TFFVIIa復(fù)合物的生理抑制劑對(duì)凝血過程有重要的影響作用。TFPI能抑制血栓形成及血管平滑肌細(xì)胞增殖等，因此，對(duì)血管再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞等的發(fā)生與發(fā)展有減緩作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，人類TFPI重組蛋白(hrTFPI)對(duì)血栓形成、感染性休克、血管再狹窄、內(nèi)毒素血癥和DIC(彌散性血管內(nèi)凝血)等有防治作用。因此，TFPI有巨大的藥用價(jià)值，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。
目前，國內(nèi)外已有多個(gè)公司和實(shí)驗(yàn)室利用不同表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行TFPI重組蛋白的制備，且中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室已用畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)出成本較低的高比活性TFPI重組蛋白。
但是，由于TFPI在血循環(huán)中被快速清除，需要大劑量(約20mg/kg/d)才能達(dá)到臨床治療目的，用藥不便和高昂的費(fèi)用極大限制了其在臨床上的應(yīng)用和治療效果(Palmier MO，Hall LJ，Reisch CM，et al.Clearance of recombinant tissue factor pathway inhibitor(TFPI)in rabbits.Thromb Haemost，1992.68(1)33-36.Warshawsky I，Bu G，Mast A，et al.The carboxy terminus of tissue factor pathway inhibitor is required forinteracting with hepatoma cells in vitro and in vivo.J Clin Invest，1995.95(4)1773-1781.Ho G，Narita M，Broze GJ，Jr.，et al.Recombinant full-length tissuefactor pathway inhibitor fails to bind to the cell surfaceimplications forcatabolism in vitro and in vivo.Blood，2000.95(6)1973-1978.Bai H，Ma D，ZhangYG，et al.Molecular design and characterization of recombinant long half-lifemutants of human tissue factor pathway inhibitor.Thromb Haemost，2005.93(6)1055-1060.)。
因此延長TFPI重組蛋白在血循環(huán)中的代謝時(shí)間，將大大降低治療費(fèi)用，對(duì)促進(jìn)其在臨床上的應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為延長TFPI重組蛋白在血循環(huán)中的代謝時(shí)間，提供一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種由人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI編碼的多肽。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種包括有人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種利用人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一種由人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI編碼的多肽，它具有序列表中SEQID No.2所述的氨基酸序列。
一種包含人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體，它是將人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI DNA用XhoI和EcoRI消化的片段與pPIC9載體，加入T4連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，制成m0TFPI-pPIC9。
一種利用人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌，它是將含有人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體導(dǎo)入宿主畢赤酵母菌GS115，成為GS115/m0TFPI-pPIC9。
本發(fā)明中的人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI特點(diǎn)在于在其他已經(jīng)報(bào)道的TFPI多核苷酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分核苷酸序列的改變；其編碼的部分羧基端氨基酸序列與野生型的TFPI不同；在血循環(huán)中的代謝時(shí)間比野生型TFPI(mTFPI)長1.5倍，且其在體外、內(nèi)抑制FXa的活性、與肝素的協(xié)同能力未出現(xiàn)明顯減弱。
在本發(fā)明完成的基礎(chǔ)上，可以延長TFPI重組蛋白在血循環(huán)中的代謝時(shí)間，同時(shí)，盡量保持其生物學(xué)特性，如抗凝血活性，與肝素的結(jié)合能力等。從而可以大大減少TFPI的給藥次數(shù)，降低治療費(fèi)用，促進(jìn)TFPI重組蛋白在臨床上的應(yīng)用。


圖1為m0TFPI-cDNA構(gòu)建策略圖；圖2為一種含有m0TFPI-cDNA重組(克隆)載體及含該重組載體的宿主細(xì)胞的構(gòu)建策略圖；圖3為m0TFPI重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；
圖4為不同濃度m0TFPI重組蛋白對(duì)FXa的抑制作用；圖5為不同溫育時(shí)間m0TFPI對(duì)FXa的抑制作用；圖6為不同溫育時(shí)間m0TFPI對(duì)FXa的抑制作用(肝素鈉存在時(shí))；圖7為肝素對(duì)m0TFPI重組蛋白抑制FXa作用的影響；圖8為不同濃度肝素對(duì)m0TFPI重組蛋白抑制FXa的影響；圖9為m0TFPI重組蛋白在血漿中的代謝含量活性比。
具體實(shí)施例方式
制備本發(fā)明的一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI、重組載體、重組宿主菌及重組蛋白突變體(m0TFPI)的方法包括如下步驟1.以mTFPI-pPIC9質(zhì)粒DNA(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)為模板，用PCR法對(duì)mTFPI的部分DNA序列進(jìn)行突變，重新連接到pPIC9載體上形成m0TFPI-pPIC9，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1。
2.提取m0TFPI-pPIC9質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶將其線性化后，轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115中，獲得重組酵母菌GS115/m0TFPI-pPIC9。
3.在可使TFPI突變基因(m0TFPI)表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌，用底物發(fā)色法測(cè)定TFPI蛋白的活性；并經(jīng)SDS-PAGE分析，證明TFPI蛋白大量表達(dá)。
4.用同位素標(biāo)記后，測(cè)定TFPI蛋白突變體m1TFPI在動(dòng)物體內(nèi)的代謝情況，證明TFPI蛋白突變體m0TFPI在血循環(huán)中的代謝時(shí)間比野生型TFPI延長1.5倍。
5.用底物發(fā)色法測(cè)定TFPI蛋白突變體m0TFPI的活性，證明其活性與野生型TFPI相比，未出現(xiàn)明顯降低。
TFPI突變基因m0TFPI核苷酸序列見SEQ ID No.1。TFPI突變基因m0TFPI全長828bp，和其他野生型的TFPI基因比較，除與mTFPI基因有相同的突變位點(diǎn)外，還在其羧基端發(fā)生了部分序列突變。
根據(jù)核苷酸序列SEQ ID No.1，推測(cè)表達(dá)的m1TFPI蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.2。該m0TFPI的氨基酸序列由276個(gè)氨基酸組成，分子量為42Da。通過對(duì)本發(fā)明涉及的mTFPI突變基因m0TFPI推導(dǎo)的氨基酸序列與其他野生型TFPI蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明其羧基端部分氨基酸序列突變(參見Thomas JG，Roger E，Robin LW，et al.Structure ofthe human lipoprotein-associated coagulation inhibitor gene.The Journal ofBiological Chemistry.1991.226(8)5036-5041.)。從而使其在基本保持生物學(xué)特性的同時(shí)，延長了血漿代謝時(shí)間。
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解的是，所述的實(shí)施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1mTFPI-pPIC9質(zhì)粒DNA的提取100ul新鮮菌液TB1(含mTFPI-pPIC9質(zhì)粒)接種于10ml LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm過夜培養(yǎng)；取10個(gè)250ml的三角瓶，每瓶加入100ml培養(yǎng)基，并接種1ml上述菌液，37℃，250rpm過夜培養(yǎng)；離心取沉淀，用120mlGTE緩沖液重懸沉淀，并加入240mg溶解酶，劇烈震蕩混勻，30℃水浴30min；加入240ml裂解液(0.2N NaOH 1％SDS新鮮制備)輕柔顛倒混勻，靜置5min；加入180ml 5M的乙酸鉀溶液(pH 5.5；3M乙酸鉀，2M乙酸)，顛倒混勻，冰浴10min。8000rpm離心15min，用兩層紗布過濾，取上清，并加入等體積的異丙醇，混勻后8000rpm離心20min，取沉淀；用4ml TE緩沖液重懸沉淀，等體積的酚-氯仿混合液(酚∶氯仿＝24∶1)抽提一次；加入1/2體積的7.5M乙酸銨溶液，混勻后冰浴20min，離心后取上清，加入2.5倍體積的冰冷的乙醇，混勻-20℃靜置2h以上；4000rpm離心20min，取沉淀，并用0.6mlTNE(STE)緩沖液重懸，加入10ul 10mg/ml的RNaseA溶液，混勻后37℃水浴30min；依次用酚，酚-氯仿混合液，氯仿各抽提一次；加入等體積的PEG溶液(13％PEG 8000，0.8M NaCl)混勻，4℃靜置30min，13000rpm離心20min，沉淀用冰冷的70％的乙醇漂洗兩次，溶于適量TE緩沖液中(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0)。
實(shí)施例2構(gòu)建含TFPI突變基因(m0TFPI)的載體以質(zhì)粒DNA mTFPI-pPIC9(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程所基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)為模板，以突變引物m0(5’AAA GGA GGC CTAATTGAT GAC GAT GACAAA AGA AAG AAG CAG AGA 3’)，3’Aox(5’GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC 3’)；為正反引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)純化PCR產(chǎn)物。仍以質(zhì)粒DNA mTFPI-pPIC9為模板，以上述PCR產(chǎn)物及5’Aox(5’GCAAAT GGC ATT CTG ACA TCC 3’)為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增(見圖1，圖中m0，m1，m2為突變引物，含突變位點(diǎn)。5’Aox和3’Aox為畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9的通用引物?！霰硎就蛔兾稽c(diǎn))。用上述方法純化PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI不完全消化PCR產(chǎn)物及pPIC9載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用上述試劑盒回收后，取200ng pPIC9回收產(chǎn)物，與200ng回收的PCR產(chǎn)物，在20μL連接體系在16℃條件下過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系含1ul連接緩沖液，1ulT4DNA連接酶，17ul水。取連接產(chǎn)物CaCl2轉(zhuǎn)化到E.coli(大腸桿菌)TB1中，涂布在LB培養(yǎng)基平板上。
實(shí)施例3構(gòu)建及鑒定重組酵母菌GS115取50ug提取的質(zhì)粒DNA(m0TFPI-pPIC9)用50u Sacl酶切1小時(shí)。將質(zhì)粒用無水乙醇沉淀后，溶于20ul無菌水中。用PEG1000法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。將50ug DNA直接加入尚處于冷凍狀態(tài)的感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃水浴5分鐘，然后加入1.2mlPEG溶液(40％PEG 1000，0.2M Bicine，pH 8.35)，30℃水浴1h。離心，用1.5ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mM Bicine，pH 8.35)重懸菌體。再次離心，用0.2ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mMBicine，pH 8.35)重懸菌體后涂布于RDB選擇平板上，30℃孵育4-6日(見圖2)。從RDB選擇平板上挑取克隆接種于10ml YPD培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)18-24小時(shí)。用玻璃珠裂解法提取酵母基因組DNA。取5ul酵母基因組DNA作為摸板，5`Aox和3`Aox.作為正，反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并根據(jù)擴(kuò)增片段的大小來判斷m0TFPI-pPIC9質(zhì)粒是否插入酵母宿主菌基因組中。篩選m0TFPI-pPIC9質(zhì)粒已插入的重組酵母菌GS115。
實(shí)施例4m0TFPI重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將陽性克隆接種到10ml YPD培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)18h；取100ul菌液接種于10mlBMGY培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)至OD600≈3(約16-18h)；離心收集細(xì)胞，重懸于30ml BMMY培養(yǎng)基中。30℃250rpm，加100％的甲醇至終濃度為0.5％培養(yǎng)36h，并每隔12h加甲醇至終濃度為0.5％。并取上清進(jìn)行生物活性分析及SDS-PAGE電泳(見圖3，圖中1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)2.mTFPI重組蛋白3.m0TFPI重組蛋白4.m1TFPI重組蛋白5.m2TFPI重組蛋白6.pPIC9空白質(zhì)粒蛋白)。
實(shí)施例5m0TFPI重組蛋白在動(dòng)物體內(nèi)代謝將純化的m0TFPI重組蛋白用125I標(biāo)記后，注射入SD大鼠尾靜脈，于注射后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0min從眼眶靜脈叢取血離心(1000g，15min)得血漿，各取血漿100ul進(jìn)行125I放射性計(jì)數(shù)，測(cè)定m0TFPI重組蛋白在血漿中的代謝含量(見表1)。
實(shí)施例6m0TFPI重組蛋白體外活性測(cè)定將FXa用TBSA(0.5％BSA，100mM NaCl，50mM Tris-HCl PH 7.8)配成2nM的溶液；將pPIC9(空白對(duì)照)、mTFPI(陽性對(duì)照)、m0TFPI用TBS(100mM NaCl，50mM Tris-HClPH 7.8)稀釋成0.5-2.0nM不同濃度，取其各100ul與100ul FXa混合，置于96孔板37℃水浴30min；然后加入15ul 1mM S-2222混勻后于37℃水浴30min，其間用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值。證明較野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m0TFPI重組蛋白在體外的活性未出現(xiàn)明顯降低，具有良好活性(見圖4、5)。
實(shí)施例7 肝素對(duì)m0TFPI重組蛋白體外活性影響的測(cè)定取1.0nM pPIC9、mTFPI、m0TFPI各100ul與100ul FXa混合，并加入肝素鈉至終濃度為0.05-0.5U/ml，37℃水浴30min；然后加入15ul 1mM S-2222混勻后于37℃水浴30min，其間用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值。證明較野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m0TFPI重組蛋白與肝素的結(jié)合力也未明顯降低，肝素仍明顯提高m0TFPI重組蛋白對(duì)FXa的抑制能力(見圖6-8)。
實(shí)施例8m0TFPI重組蛋白體內(nèi)活性測(cè)定將24只SD大鼠(180-220g)隨機(jī)分為四組(每組6只)，注射mTFPI、m0TFPI入SD大鼠尾靜脈；于注射前、注射后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0min從眼眶靜脈叢取血；血樣離心(1000g，15min)得血漿，用上述測(cè)定體外活性的方法測(cè)定體內(nèi)活性。證明較野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m0TFPI重組蛋白在體內(nèi)的活性未出現(xiàn)明顯降低，在體內(nèi)代謝過程中仍保持良好活性(見圖9)。
表1 大鼠體內(nèi)125I-rTFPI血漿代謝含量(％)

SEQ ID No.1828gattctgagg aagatgaaga acacacaatt atcacagata cggagttgcc accactgaaa 60cttatgcatt cattttgtgc attcaaggcg gatgatggcc catgtaaagc aatcatgaaa 120agatttttct tcaatatttt cactcgacag tgcgaagaat ttatatatgg gggatgtgaa 180ggaaatcaga atcgatttga aagtctggaa gagtgcaaaa aaatgtgtac aagagataat 240gcaaacagga ttataaagac aacattgcaa caagaaaagc cagatttctg ctttttggaa 300gaagatcctg gaatatgtcg aggttatatt accaggtact tctacaacaa tcagacaaaa 360cagtgtgaac gtttcaagta tggtggatgc ctgggcaata tgaacaattt tgagacactg 420gaagaatgca agaacatttg tgaagatggt ccgaatggtt tccaggtgga taattatgga 480acccagctca atgctgtgaa taactccctg actccgcaat caaccaaggt tcccagcctt 540tttgaatttc acggtccctc atggtgtctc actccagcag acagaggatt gtgtcgtgcc 600aatgagaaca gattctacta caattcagtc attgggaaat gccgcccatt taagtacagt 660ggatgtgggg gaaatgaaaa caattttact tccaaacaag aatgtctgag ggcatgtaaa 720aaaggtttca tccaaagaat atcaaaagga ggcctaattg atgacgatga caaaagaaag 780aagcagagag tgaaaatagc atatgaagaa atttttgtta aaaatatg 828
SEQ ID No.2276AspSerGluGluAsp GluGluHisThrIle IleThrAspThrGlu LeuProProLeuLys15 10 1520LeuMetHisSerPhe CysAlaPheLysAla AspAspGlyProCys LysAlaIleMetLys25 30 35 40ArgPhePhePheAsn IlePheThrArgGln CysGluGluPheIle TyrGlyGlyCysGlu45 50 55 60GlyAsnGlnAsnArg PheGluSerLeuGlu GluCysLysLysMet CysThrArgAspAsn65 70 75 80AlaAsnArgIleIle LysThrThrLeuGln GlnGluLysProAsp PheCysPheLeuGlu85 90 95 100GluAspProGlyIle CysArgGlyTyrIle ThrArgTyrPheTyr AsnAsnGlnThrLys105110 115120GlnCysGluArgPhe LysTyrGlyGlyCys LeuGlyAsnMetAsn AsnPheGluThrLeu125130 135 140GluGluCysLysAsn IleCysGluAspGly ProAsnGlyPheGln VlaAspAsnTyrGly145150 155 160ThrGlnLeuAsnAla VlaAsnAsnSerLeu ThrProGlnSerThr LvsVlaProSerLeu165170 175 180PheGluPheHisGly ProSerTrpCysLeu ThrProAlaAspArg GlyLeuCysArgAla185190 195 200AsnGluAsnArgPhe TyrTyrAsnSerVla IleGlyLysCysArg ProPheLysTyrSer205 210 215 220GlyCysGlyGlyAsn GluAsnAsnPheThr SerLysGlnGluCys LeuArgAlaCysLys225 230 235240LysGlyPheIleGln ArgIleSerLysGly GlyLeuIleAspAsp AspAspLysArgLys245 250 255 260LysGlnArgVlaLys IleAlaTyrGluGlu IlePheVlaLysAsn Met265 270 275 27權(quán)利要求
1.一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一種由人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI編碼的多肽，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
3.一種包含權(quán)利要求1人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體，它是將人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI DNA用XhoI和EcoRI消化的片段與pPIC9載體，加入T4連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，制成m0TFPI-pPIC9。
4.一種利用權(quán)利要求3人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌，它是將含有人類組織因子途徑抑制因子突變基因m0TFPI的重組載體導(dǎo)入宿主畢赤酵母菌GS115，成為GS115/m0TFPI-pPIC9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因m
文檔編號(hào)C12N15/81GK1920030SQ20061001565
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日
發(fā)明者冷希崗, 余波, 宋麗萍, 劉蘭霞, 張海玲 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所