專利名稱：新型重組人組織因子途徑抑制物活性肽及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領域，具體涉及新型重組人組織途徑抑制物活性肽。更具體地，本發(fā)明涉及新型重組人組織途徑抑制物活性肽1和活性肽2，與全長人組織途徑抑制物相比，活性肽1保持抗組織因子/因子VIIa活性，活性肽2保持抗因子Xa活性。本發(fā)明還涉及本重組人組織因子途徑抑制物活性肽的制備方法及其應用。
近年來，研究人員使用重組人TFPI進行了一系列的動物實驗和若干臨床實驗，結(jié)果表明TFPI對于冠狀動脈血栓形成、膿毒血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、中風、癌癥、急性呼吸窘迫綜合征和缺血再灌注損傷等均有很好的療效，而且出血的危險性明顯低于低分子肝素，是一種安全性好，療效高的抗凝和抗血栓藥物(Jeske W，et al.Seminars in thrombosis and hemostasis，1996；22(2)213-219)。
TFPI是分子量約40kd的單鏈糖蛋白，由276個氨基酸殘基組成。TFPI的結(jié)構(gòu)包括氨基端區(qū)，三個Kunitz型蛋白酶抑制區(qū)(結(jié)構(gòu)域)。每個結(jié)構(gòu)域均是51個氨基酸殘基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有三對二硫鍵。結(jié)構(gòu)域1的活性位點位于Lys36-Ala37，結(jié)構(gòu)域2的活性位點位于Arg107-Gly108，結(jié)構(gòu)域3的活性位點位于Arg199-Ala200。TFPI有三個糖基化位點，分別位于Asn117，Asn167和Asn228，但糖基化的有無不影響TFPI的活性(Nakahara Y，et al.Biochemistry，1996；356450-6459；Burgering M，et al.J.Mol.Biol.1997；269395-407)。根據(jù)TFPI以上的特性，本發(fā)明設計了rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的分子結(jié)構(gòu)。rhTFPI-AP1保留了TFPI 22-79，Asp31和Asp32被替換為Lys31和Ala32。rhTFPI-AP2保留了TFPI 93-150，Asp100、Glu101、Glu102和Asn117被替換為Arg100、Arg101、Gly102和Gln103。表1序列表SEQ ID NO1，顯示本發(fā)明rhTFPI-AP1的氨基酸序列，表2序列表SEQ ID NO2，顯示本發(fā)明rhTFPI-AP2的氨基酸序列，表3序列表SEQ ID NO3，顯示本發(fā)明rhTFPI-AP1的核甘酸序列，表4序列表SEQ ID NO4，顯示本發(fā)明rhTFPI-AP2的核甘酸序列。
本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的方法，包括制備至少包含表達生物活性的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2編碼序列部分的cDNA；在適合表達的載體中克隆cDNA片斷；用該載體轉(zhuǎn)染宿主細胞；在適于表達該cDNA片斷的條件下培養(yǎng)該宿主細胞；及從培養(yǎng)物中回收和純化所需rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2。
本發(fā)明中rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2基因的制備包括經(jīng)過點突變后的基因，與質(zhì)粒PUC19重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
將本發(fā)明的cDNA片斷與表達載體重組，形成重組表達質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用真核表達載體，例如pPIC9K等。
上述重組表達載體可按常規(guī)方法導入適宜宿主細胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用甲醇營養(yǎng)型酵母菌株如GS115，KM71等。
本發(fā)明的表達產(chǎn)物分泌到胞外，存在于宿主細胞培養(yǎng)液上清內(nèi)。只需離心去除宿主細胞，即可對培養(yǎng)液上清進行分離和純化所需產(chǎn)品。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學操作均參照<分子克隆實驗指南>。本發(fā)明應用基因工程方法對2種活性肽進行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效的抗凝和抗栓功能，并且制備工藝簡便、安全，與全長TFPI性質(zhì)比較表明，rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的抗凝和抗栓功能與TFPI類似，但分子量明顯減少，為非靜脈緩釋注射劑和非注射劑的研究提供了原料，可用于預防和治療血栓性疾病限制性內(nèi)切酶購自BRL公司，大腸桿菌JM109、質(zhì)粒pUC19、甲醇營養(yǎng)型酵母菌GS115、酵母多拷貝表達載體pPIC9K購自Invitrogen公司。
(2)篩選高拷貝高效表達菌株將質(zhì)粒rhTFPI-AP1-pPIC9K和rhTFPI-AP2-pPIC9K電轉(zhuǎn)化甲醇營養(yǎng)型酵母GS115，使其與酵母染色體發(fā)生重組，G418篩選高效表達菌株。
挑取上述陽性克隆接種于10ml低營養(yǎng)液BMG〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油〗中，30℃快速振遙(250 RPM)，培養(yǎng)過夜。次日測定光密度OD600，離心棄除BMG培液，用無菌水洗滌后用BMM培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇〗稀釋至OD600＝1。每天補加體積百分數(shù)為0.5％的甲醇。甲醇誘導培養(yǎng)7天，每隔24小時取樣1ml，測定抗TF/FVIIa(rhTFPI-AP1)或抗Fxa(rhTFPI-AP2)活性。離心棄沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清與2x上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS掃描定純度、分子量?？梢娬T導后上清液在分子量約6kd處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，目的蛋白約占上清總蛋白的84％；結(jié)果表明表達產(chǎn)物rhTFPI-AP1有明顯的抗TF/FVIIa作用，rhTFPI-AP2有明顯的抗FXa作用。上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進行。
(3)發(fā)酵表達工程菌按上述篩選高表達菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱培養(yǎng)2-3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級潔凈度條件下接種于10ml BMG培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過夜，此為一級種子液。再將一級種子液加入140ml培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)6-8小時，直至OD600＝6，此為二級種子液。種子菌接入后，自然增值，待基礎培養(yǎng)基中預加的甘油被耗盡以后，開始補充甘油，補充速度16ml/L/h，待OD600達到120左右，停止補加甘油。待培養(yǎng)液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導。甲醇補料速度從1ml/L/h逐漸升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發(fā)明的發(fā)酵技術(shù)是用低鹽培養(yǎng)基擴增工程菌，誘導前用含微量元素的甘油溶液進行補料，到達一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進行誘導表達。
甲醇誘導40h以后，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中立即放出菌液進行離心，分離沉淀菌體，收集上清進行純化。上清中rhTFPI-AP1對TF/FVIIa的抑制常數(shù)達Ki＝0.12uM，rhTFPI-AP2對FXa的抑制常數(shù)達Ki＝0.09uM。發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清以1∶10稀釋，經(jīng)Millipore超濾裝置(NMWL3000，Millipore公司)超濾濃縮至1.0L，脫去無機鹽。
(5)凝膠過濾Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，將超濾濃縮液上樣，加樣時注意勿攪動Sephadex G-50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集活性峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以10倍體積的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活性部分，分裝，冷凍干燥，-40℃保存。
本發(fā)明的色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測定樣品進行16.5％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，Pharmacia InagemasterVDS掃描測定純度、分子量。所得產(chǎn)品純度97％以上，分子量約6kD。
(8)抗TF/FVIIa活性測定使用稀釋后的凝血酶原時間測定。
(9)抗FXa測定應用發(fā)色低物發(fā)測定。實施例2 制備rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建，高拷貝高效表達菌株的篩選，工程菌的發(fā)酵表達均同實施例1。發(fā)酵液離心后收集上清液，按下法進行純化制備純品rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2。
(1)Poros HQ柱層析濃縮以10倍體積的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Poros HQ(Pharmacia公司)柱，發(fā)酵液離心后收集的上清以100ml/min的速率將其吸附到Poros HQ柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活力部分。
(2)凝膠過濾Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH 7.4)平衡后，將Poros HQ柱層析濃縮液上樣，注意加樣時勿擾動SephadexG-50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集活性峰。
(3)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以10倍體積的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活性部分，分裝，冷凍干燥，-40℃保存。
(4)純度鑒定及分子量測定樣品進行16.5％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，Pharmacia InagemasterVDS掃描測定純度、分子量。所得產(chǎn)品純度97％以上，分子量約6kD。
(5)抗TF/FVIIa活性測定(6)抗FXa測定實施例3 rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2在血栓性疾病中的應用應用本發(fā)明所制備的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2進行抗血栓實驗，證實其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，與低分子肝素相比，抗栓效果明顯，對凝血功能的影響明顯小于低分子肝素。
(1)抑制靜脈血栓形成損傷兔頸內(nèi)靜脈誘發(fā)靜脈血栓形成。模型形成2小時后靜脈注射給藥。陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予低分子肝素60抗Xa U/kg，治療組分別給予rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2 0.5和1.0mg/kg。給藥后4小時后取出血栓，稱重。結(jié)果顯示rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2比低分子肝素更能抑制靜脈血栓形成，并且對凝血功能的影響很小。表5為rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制靜脈血栓形成實驗結(jié)果。表5

(2)抑制動脈血栓形成用氣囊導管損傷家兔股動脈內(nèi)皮細胞，并結(jié)扎損傷部分的血管，使局部血流阻滯而誘發(fā)動脈血栓形成。陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予低分子肝素60-120抗Xa U/kg，治療組分別給予rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2 0.5-2.0mg/kg。實驗結(jié)果表明，rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2可使動脈血栓形成率下降，并呈劑量相關性。表6為rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制動脈血栓形成的作用。表6

(3)防治彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)給家兔注射內(nèi)毒素誘發(fā)DIC形成。與低分子肝素相比，靜脈注射rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2可明顯糾正DIC所致的凝血功能異常和血栓形成的程度。表7為rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2治療DIC的作用。
表7

(4)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后血栓再形成的防治損傷狗的左冠狀動脈前降支內(nèi)皮細胞，誘發(fā)阻塞性冠脈血栓形成。應用rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2作為重組鏈激酶的附加用藥，能促進冠脈再通，抑制血栓再形成，減少殘余血栓的重量，并呈劑量的依賴性。與低分子肝素相比，發(fā)生再通的時間較短，再灌注的持續(xù)時間延長，且殘留的血栓重量較輕。表8為rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制動脈血栓再形成的作用。
表8

無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領域技術(shù)人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變更和改進。表1 SEQ ID NO11 11 21 31MHSFCEAFKAAKCPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCEG41 51NQNRFESLEE CKKNCTRD表2 SEQ ID NO 2111 21 31KPDFCFLGRRPGICRGYITR YFYNQQTKQC ERFKYGGCLG41 51NMNNFETLEE CKNICEDG表3 SEQ ID NO3ATG CAT TCA TTT TGT GCA TTC AAG GCGGCA AAGGGC CCA TGT AAA GCAATC ATG AAA AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG TGC GAA GAATTT ATA TAT GGG GGA TGT GAA GGA AAT CAG AAT CGA TTT GAA AGT CTGGAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GAT表4 SEQ ID NO4AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTGGGA CGA AGGCCT GGA ATA TGT CGA GGTTAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AATCGAACA AAA CAG TGT GAA CGTTTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTGGAA GAA TGC AAG AAC ATT TGT GAA GAT GGT
權(quán)利要求
1.新型重組人組織因子途徑抑制物活性肽，其特征在于改變?nèi)私M織因子途徑抑制物結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2的結(jié)構(gòu)，獲得保持hTFPI特異、高效抗組織因子(TF)/FVIIa的活性肽1和抗FXa活性的活性肽2，活性肽1 rhTFPI-AP1具有SEQ ID NO1的氨基酸序列和SEQ IDNO3的核甘酸序列，活性肽2 rhTFPI-AP2具有SEQ ID NO2的氨基酸序列和SEQ ID NO4的核甘酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組人組織因子途徑抑制物活性肽，其特征在于所述的活性肽rhTFPI-AP1保留了TFPI 22-79，D59和D60被替換為K59和A60，rhTFPI-AP2保留了TFPI 93-150，D128、E129和E130被替換為R128、R129和G130。
3.一種制備新型重組人組織因子途徑抑制物活性肽的方法，其特征在于采用下列步驟(1)根據(jù)對全長hTFPI的結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析，設計rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2分子結(jié)構(gòu)；(2)在適于表達的載體中克隆rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2基因；(3)用該重組載體轉(zhuǎn)染適于表達的宿主細胞；(4)在適于表達該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細胞，并從中回收和純化所需產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所使用的載體不限于特定的表達載體，只要它能夠與所述cDNA片段重組，形成適宜表達的質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利4所述的方法，其中所使用的載體為真核表達載體。
6.根據(jù)權(quán)利5所述的方法，其中所使用的載體為pPIC9K。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所使用的宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。
8.根據(jù)權(quán)利7所述的方法，其中所使用的宿主細胞為甲醇營養(yǎng)型酵母菌株GS115。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中培養(yǎng)宿主細胞所使用的方法為發(fā)酵方法，發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2終產(chǎn)物是通過工程菌發(fā)酵后離心收集上清，經(jīng)超濾、凝膠過濾、離子交換三步法純化而獲得。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2在制備防治血栓性疾病的藥物中的應用。SEQ ID NO 11 11 21 31MHSFCEAFKAAKCPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCEG41 51NQNRFESLEE CKKNCTRDSEQ ID NO 2111 21 31KPDFCFLGRRPGICRGYITR YFYNQQTKQC ERFKYGGCLG41 51NMNNFETLEE CKNICEDGSEQ ID NO 3ATG CAT TCA TTT TGT GCA TTC AAG GCGGCA AAGGGC CCA TGT AAA GCAATC ATG AAA AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG TGC GAA GAATTT ATA TAT GGG GGA TGT GAA GGA AAT CAG AAT CGA TTT GAA AGT CTGGAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GATSEQ ID NO 4AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTGGGA CGA AGGCCT GGA ATA TGT CGA GGTTAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AATCGAACA AAA CAG TGT GAA CGTTTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTGGAA GAA TGC AAG AAC ATT TGT GAA GAT GGT
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領域,具體涉及具有抗凝和抗栓活性的重組人組織因子途徑抑制物活性肽和制備方法及其應用。本發(fā)明根據(jù)對全長組織因子途徑抑制物的結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析,設計了新型rhTFPI－AP1和rhTFPI－AP2結(jié)構(gòu)。將突變后組織因子途徑抑制物結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2基因與真核表達載體pPIC9K重組,轉(zhuǎn)化甲醇營養(yǎng)型酵母GS115,篩選高表達工程菌。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴增,離心收集上清液,經(jīng)三步法純化rhTFPI－AP1和rhTFPI－AP2。所得產(chǎn)品凍干后,具有抗凝和抗栓活性,對于預防血栓性疾病的發(fā)生有明顯的作用。
文檔編號C07K14/435GK1367176SQ01126949
公開日2002年9月4日 申請日期2001年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月8日
發(fā)明者馬端, 宋后燕 申請人:復旦大學