光復(fù)粳水稻抗黑條矮縮病位點(diǎn)及分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及光復(fù)粳水稻抗黑條矮縮病位點(diǎn)及分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarfvirus, RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飛虱為傳播介體進(jìn)行傳播。宿主有雜交水稻、常規(guī)水稻、大麥、小麥、玉米、小米、高粱、看麥娘、早熟禾、罔草、稗草、馬塘等28種。水稻黑條矮縮病毒侵染玉米致其得玉米粗縮病，侵染小麥致其得小麥從矮病，這些病的病原形態(tài)、寄主及癥狀、介體昆蟲及傳病特性等都極其相似。水稻黑條矮縮病在水稻苗期、分蘗期、拔節(jié)期均可發(fā)病，因感染時(shí)期不同，病癥略有差異，苗期與分蘗期最易感病，且發(fā)生較重。水稻黑條矮縮病的典型癥狀是病株矮縮，葉色濃綠僵硬，葉背、葉鞘和莖桿有早期蠟白色，后期為黑褐色的短條癥狀不規(guī)則突起，通常發(fā)病植株不抽穗或者極少結(jié)實(shí)，被喻為水稻“癌癥”。
[0003]水稻黑條矮縮病首先在日本發(fā)現(xiàn)。60年代，水稻黑條矮縮病在日本大部分地區(qū)流行。我國(guó)黑條矮縮病最早于1963年在浙江省余姚縣的早稻上發(fā)現(xiàn)，同時(shí)在上海市嘉定和奉賢縣、江蘇省蘇州和鎮(zhèn)江等地區(qū)的水稻上、揚(yáng)州和南通等地區(qū)的玉米上有局部危害，主要影響華東地區(qū)。20世紀(jì)60年代水稻黑條矮縮病在我國(guó)華東諸省市大爆發(fā)后20年，由于麥田翻耕和早稻移栽等耕作方式的興起，殺滅了第一代灰飛虱若蟲，病害的初侵染受阻，致使發(fā)病面積逐年下降。80年代后，由于擴(kuò)種小麥，又給本病初侵染創(chuàng)造了有利的寄主條件，致使本病在90年代再次大爆發(fā)，在浙江、上海、江蘇、安徽、江西和福建省北部等長(zhǎng)江中下游地區(qū)廣泛發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、農(nóng)田生態(tài)多樣、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推廣，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、湖南等省大規(guī)模發(fā)生，主要危害雜交中稻、一季晚稻，通常損失稻谷二成以上，嚴(yán)重的甚至絕收。水稻黑條矮縮病在長(zhǎng)江中下游地區(qū)、黃淮海地區(qū)的爆發(fā)，嚴(yán)重挫傷了稻農(nóng)的種糧積極性，危害了我國(guó)糧食產(chǎn)業(yè)的安全。
[0004]目前，對(duì)水稻黑條矮縮病的防治主要是使用農(nóng)藥防治傳毒介體灰飛虱，但由于介體昆蟲種群數(shù)量大，導(dǎo)致防治效果不佳，且存在環(huán)境污染。而培育抗病品種是防治各類病害最為經(jīng)濟(jì)、有效的手段。篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質(zhì)是開展抗病育種的前提和基礎(chǔ)，而抗性基因定位和克隆，則為利用標(biāo)記輔助選擇等分子育種手段，加快和高效培育抗病品種提供了全新和有利工具。但迄今，對(duì)水稻黑條矮縮病抗性種質(zhì)的篩選、抗性遺傳基本特性還鮮有研究。進(jìn)行水稻黑條矮縮病抗性QTL檢測(cè)和遺傳效應(yīng)分析，可以為水稻黑條矮縮病的抗性遺傳育種應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。
[0005]有關(guān)水稻黑條矮縮病的病原形態(tài)、寄主癥狀、介體昆蟲及傳播特性、發(fā)生特點(diǎn)、流行規(guī)律等已基本得到闡明，對(duì)水稻黑條矮縮病毒的核酸序列的測(cè)定和相關(guān)基因克隆也有報(bào)道。水稻黑條矮縮病遺傳、育種研究目前基本處于起步狀態(tài)，未能引起高度重視，可能是由于水稻黑條矮縮病20世紀(jì)60年代中期發(fā)生后近30年基本銷聲匿跡的原因。鑒于近年來水稻黑條矮縮病危害逐年加重，部分地區(qū)泛濫成災(zāi)，加強(qiáng)相關(guān)應(yīng)用基礎(chǔ)研究勢(shì)在必行。目前水稻黑條矮縮病抗性基因的定位鮮有報(bào)道，可能是由于過去未能引起高度重視的原因，抗性基因定位目前基本都處于起步狀態(tài)。
[0006]篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質(zhì)是開展抗病育種的前提和基礎(chǔ)，而抗性基因定位和克隆，則為利用分子標(biāo)記輔助選擇，加快育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。迄今為止，在生產(chǎn)上也沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)RBSDV免疫的品種，所以對(duì)水稻黑條矮縮病抗性種質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模篩選和展開水稻黑條矮縮病抗性定位研究顯得尤為迫切。
[0007]目前常規(guī)水稻抗黑條矮縮病資源篩選抗病品種、抗病基因定位鑒定抗性家系均采用田間自然發(fā)病鑒定，即將各鑒定品種或品系小區(qū)形式種植于大田，每個(gè)小區(qū)幾十株左右，大田常規(guī)栽培管理，傳毒介體灰飛虱自然傳毒，待水稻顯現(xiàn)病癥后調(diào)查各鑒定品種(家系)小區(qū)的穴發(fā)病率，以此為標(biāo)準(zhǔn)鑒別水稻品種(家系)的抗感能力的差異。然而，由于植物對(duì)天敵的抗性分為耐害性、抗生性和排趨性三種類別，各種抗性類別具由不同的抗性機(jī)理，水稻也不其外。不同水稻品種(家系)對(duì)灰飛虱排趨性的差異使得不同水稻品種(家系)的某些形態(tài)和生理等特性，表現(xiàn)出對(duì)灰飛虱的取食偏向的差異。而水稻黑條矮縮病的傳毒介體正為灰飛虱，因此，通過自然鑒定方法鑒定得到的抗病水稻，可能實(shí)際上是抗蟲(排趨性強(qiáng))水稻而并非抗病水稻。然而，假若以該抗蟲不抗病水稻育成品種進(jìn)行病害區(qū)規(guī)模種植后，規(guī)模種植導(dǎo)致傳毒介體被迫選擇而使得水稻對(duì)灰飛虱排趨產(chǎn)生的假抗病表現(xiàn)消失，可能給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大的損失。
[0008]田間自然發(fā)病的不能排除灰飛虱排趨性的干擾，常規(guī)方法進(jìn)行的抗病基因不夠準(zhǔn)確，因此，本研究小組改良了灰飛虱排趨性鑒定方法，采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法，篩選到了抗水稻黑條矮縮病品種資源，并進(jìn)一步準(zhǔn)確定位了水稻黑條矮縮病抗病基因而排除了灰飛虱排趨的干擾，我們的研究對(duì)水稻黑條矮縮病抗病育種提供了重要的指導(dǎo)信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對(duì)常規(guī)育種中水稻黑條矮縮病抗性鑒定穩(wěn)定性、重復(fù)性較差及費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，提供了光復(fù)粳水稻抗黑條矮縮病位點(diǎn)及分子標(biāo)記方法，該方法可以預(yù)測(cè)植株對(duì)水稻黑條矮縮病的抗性，簡(jiǎn)化了選擇方法，進(jìn)而加快抗病品種的育種進(jìn)程。
[0010]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
光復(fù)粳水稻抗黑條矮縮病位點(diǎn)及分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，或者用自行合成的分子標(biāo)記05-22引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2能夠擴(kuò)增出147bp的擴(kuò)增片段，或用自行合成的分子標(biāo)記05-22引物:SEQ IDN0.3/SEQ ID N0.4能夠擴(kuò)增出265bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在抗黑條矮縮病位點(diǎn) qRBSDV19o
[0011 ] 該方法包含以下步驟:
(1)以水稻黑條矮縮病抗源光復(fù)粳為母本，水稻黑條矮縮病高感品種揚(yáng)農(nóng)粳2號(hào)為父本，配制雜種F1，構(gòu)建了包含282個(gè)單株的F2分離群體，F(xiàn)2單株自交獲得F2:3家系；
(2)對(duì)F2:3家系采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法，進(jìn)行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定；
(3)親本、F1及F2:3定位群體單株的DNA采用TPS粗提法提取；
(4)用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的308對(duì)SSR引物(含59對(duì)自行合成引物)，對(duì)親本、F1及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增尋找兩兩之間同時(shí)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的多態(tài)性分子標(biāo)記檢測(cè)F2:3家系；
(5)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM);
(6)采用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測(cè)水稻黑條矮縮病的抗性QTL，L0D值的閾值定為2.0，按P = 0.005概率值檢測(cè)抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置；
(7)獲得水稻黑條矮縮病抗性品種光復(fù)粳抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)qRBSDV19，位于第5號(hào)染色體分子標(biāo)記RM6082與自行合成的分子標(biāo)記05-22之間，通過檢測(cè)第5號(hào)染色體上該兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)該植株對(duì)水稻黑條矮縮病的抗性，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0012]所述的采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法進(jìn)行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定的具體方案為:
(1)待鑒定材料大田小區(qū)種植，采用水育手工移栽法，每品種單本移栽60-120株，秧田期和大田移栽早期均不防治灰飛虱，其他時(shí)間按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)常規(guī)管理，水稻移栽活棵后調(diào)查基本苗，水稻分蘗高峰期調(diào)查每份材料水稻黑條矮縮病發(fā)病率A ；
(2)將催芽后的水稻種子播于65cmX44cmX14cm的塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，每份材料1行，每行10株，待幼苗長(zhǎng)至1.5-2.0葉，按每株10頭接入3-4齡的灰飛虱若蟲，每天上午8時(shí)、下午4時(shí)調(diào)查每個(gè)單株上的蟲數(shù)，每次調(diào)查后進(jìn)行驅(qū)蟲，使其盡量均勻分布，環(huán)境溫度保持在26±2°C，自然光照，5天后計(jì)算每份材料每個(gè)單株上的平均蟲數(shù)，作為排驅(qū)性測(cè)驗(yàn)值，進(jìn)一步按照每份材料單株平均蟲數(shù)/整個(gè)家系單株平均蟲數(shù)計(jì)算相對(duì)排趨性指數(shù)B ;
(3)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)計(jì)算公示計(jì)算每份材料水稻黑條矮縮病抗病指數(shù)C:C=1-A/ V B，以抗病指數(shù)C作為定位群體的抗性表型參數(shù)。
[0013]所述的擴(kuò)增黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV19的分子標(biāo)記引物選自分子標(biāo)記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2 和自行合成的分子標(biāo)記 05-22 引物:SEQ ID N0.3/SEQ IDN0.4。
[0014]所述的對(duì)親本、FI及F2:3定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為20μ?，反應(yīng)液組成為 10XPCR buffer(200mmol/L Tris-HCl pH8.4,500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，stabilizers)2PL，10mmol/L dNTPs 1.2μ?，引物各50ng，基因組DNA50ng，1.0U TaqDNA聚合酶，補(bǔ)水至20μ? ;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，50°C退火復(fù)性lmin，72°C延伸50_90s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫lOmin ;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測(cè)。
[0015]本發(fā)明所提供的光復(fù)粳水稻抗黑條矮縮病位點(diǎn)及分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法進(jìn)行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定，其鑒定結(jié)果排除了灰飛虱排趨性的干擾，表型鑒定方法更加準(zhǔn)確可信； (2)本發(fā)明分子標(biāo)記定位的抗性基因位點(diǎn)位置明確，鑒定方便。本發(fā)明通過檢測(cè)5號(hào)染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記，即可以預(yù)測(cè)水稻植株的黑條矮縮病抗性水平，大大提高了抗黑條矮縮病水稻的選擇效率，加快了育種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0016]圖1所示5號(hào)染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記在染色體上的位置。
[0017]圖2所示應(yīng)用5號(hào)染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記預(yù)測(cè)植株水稻黑條矮縮病抗性的電泳圖譜。M:Mark ；1:光復(fù)粳；2:揚(yáng)農(nóng)粳2號(hào)；3:F1 ；4~12:抗病單株；13_20