專利名稱：小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物、探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物及探針；此外，本發(fā)明還涉及使用該引物和探針檢測小麥印度腥黑穗病菌的方法。
背景技術(shù)：
小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica Mitra是世界關(guān)注的危險(xiǎn)性有害生物，也是我國對外公布的一類危險(xiǎn)性有害生物，主要分布在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊爾、阿富汗、巴西、墨西哥、美國和南非等地。近年來隨著糧食市場的開放，進(jìn)口糧食數(shù)量的不斷增加，增加了小麥印腥傳入的機(jī)會和風(fēng)險(xiǎn)，特別是主要糧食出口國美國也有小麥印度腥黑穗病菌的發(fā)生，給我國口岸檢疫帶來小麥印度腥黑穗病菌檢測的新難題。目前常用的檢測和鑒定方法是形態(tài)特征鑒定和常規(guī)PCR技術(shù)。形態(tài)特征鑒定需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和一定數(shù)量的病菌冬孢子。傳統(tǒng)的PCR檢測方法是先萌發(fā)孢子，繁殖菌絲，提取DNA，PCR檢測，整個(gè)檢測過程一般為20-30天。如果直接檢測孢子，從孢子中提取DNA再PCR檢測，需要的孢子量比較大，在實(shí)際的檢測過程中難以得到大量的孢子，而且實(shí)際的樣品中可能存在幾種病菌孢子。常規(guī)PCR技術(shù)需要冬孢子萌發(fā)培養(yǎng)繁殖得到菌絲，整個(gè)處理和鑒定的過程長達(dá)2-3周，而且冬孢子休眠和不具存活力也影響病菌的鑒定。因此以上兩種鑒定方法的實(shí)用性受到一定的限制。
Frederick等(2000)報(bào)道了利用TaqMan探針的小麥印度腥黑穗病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。章桂明等(2002)也建立了小麥印度腥黑穗病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法(未發(fā)表)。已報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的探針都是針對小麥印度腥黑穗病菌的線粒體序列，而線粒體序列的變異速率比核糖體序列變異速率更大，核糖體序列更為保守和穩(wěn)定。
MGB方法是在Taqman方法之后產(chǎn)生的更新的方法，其全稱為MinorGroove Binder。與TaqMan探針相比，其原理是TaqManMGB探針一是在探針的3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記；二是探針的3’端另結(jié)合了Minor groove binder結(jié)合物，使探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、更容易設(shè)計(jì)；2、探針更短3、提高配對與司E配對模板間的Tm值差異；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩(wěn)定性提高；6、低背景；7、重復(fù)性更強(qiáng)。該方法適合病原體的檢測、SNP和突變體檢測，既可以進(jìn)行基因定量分析，又可以進(jìn)行基因突變分析。
動植物檢疫部門、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門、植物保護(hù)、真菌研究部門等單位往往在進(jìn)出境或田間所取的樣品中往往獲取的孢子量很少，有時(shí)甚至僅有1個(gè)、幾個(gè)或極微量的孢子，因此，現(xiàn)有的方法不能滿足動植物檢疫檢測部門、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門、植物保護(hù)部門及真菌科研部門對小麥印度腥黑穗病菌檢測的需要。因此，針對核糖體序列設(shè)計(jì)小麥印度腥黑穗病菌的特異性探針，建立小麥印度腥黑穗病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定的目的，就顯得非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測探針。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種使用上述引物和探針檢測小麥印度腥黑穗病菌的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供一種小麥印度腥黑穗病菌檢測引物，其序列為5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)。
本發(fā)明還提供一種小麥印度腥黑穗病菌檢測引物，其序列為5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種小麥印度腥黑穗病菌檢測探針，其序列為5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。
在本發(fā)明的另一方面，還提供一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測方法，包括如下步驟(1)提取冬孢子DNA；(2)設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)，探針5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。
(3)以步驟(1)中提取的DNA為模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；(4)以步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用步驟(2)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于1.檢測時(shí)間大大縮短，可以在八個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測，傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法二至三周以上；2.單個(gè)冬孢子的檢測，檢測的靈敏度大大提高，傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法100個(gè)孢子以上；3.利用引物和探針可以特異性區(qū)分小麥印度腥黑穗病菌，同時(shí)可檢測兩種病菌冬孢子。傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法不能同時(shí)檢測兩種病菌冬孢子。


圖1是本發(fā)明小麥印度腥黑穗病菌冬孢子的檢測流程圖；圖2是本發(fā)明小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物和探針的位置示意圖；圖3是本發(fā)明小麥印度腥黑穗病菌單個(gè)冬孢子的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 冬孢子DNA獲取準(zhǔn)備滅菌的干凈蓋玻片塊(2mm×2mm)，將單個(gè)冬孢子挑至一個(gè)蓋玻片小塊上，用另一個(gè)蓋玻片小塊蓋住，輕輕按壓蓋玻片小塊使孢子破裂，最后將兩個(gè)蓋玻片小塊一起轉(zhuǎn)移至盛有PCR反應(yīng)液的PCR小管中進(jìn)行擴(kuò)增。
實(shí)施例2 設(shè)計(jì)引物和探針如圖1所示，針對病原菌ITS(internal transcribed spacer，核糖體基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列的特異性位點(diǎn)差異(G/A)，設(shè)計(jì)檢測小麥印度腥黑穗病菌的TaqMan-MGB探針TIND，建立單個(gè)冬孢子的Real timePCR(實(shí)時(shí)熒光PCR)檢測技術(shù)。
如圖2所示，設(shè)計(jì)上游引物D-FPa5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)；設(shè)計(jì)下游引物T-RPb5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)；設(shè)計(jì)TaqMan-MGB探針TIND5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。
實(shí)施例3 第一輪擴(kuò)增(ITS擴(kuò)增)如圖1所示，利用引物Til1(5’-AAGGTTTCTGTAGGTGAACCT-3’)(SEQ ID NO.5)/Til4(5’-GATAT GCTTAAGTTCAGCGG G-3’)(SEQ IDNO.6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)總體積為30μl，包含10mmol/LTris-HCl；50mmol/L KCl(pH8.3)；1.5mmol/L MgCl2；dATP，dGTP，dCTP，dTTP濃度為100μmol/L；引物濃度100nmol/L；0.5U Taq DNA聚合酶(寶生物工程有限公司)。加雙蒸水至終體積為30μl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。取產(chǎn)物1μl進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系25μl(大連寶生物工程有限公司TaKaRareal-time PCR core kit)5×real time PCR Buffer(Mg2+free)5μl，Mg2+solution(250mmol/L)0.5μl，dNTP mixture(各10mmol/L)0.75μl，TaKaRa Ex-Taq HS(5U/μl)0.25μl，實(shí)施例2中的上游引物、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，實(shí)施例2中的TaqMan-MGB探針(5μmol/L)0.6μl，DNA(10～20ng/μl)模板0.5μl，超純水補(bǔ)至25μl，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增在ABI PRISM 7700定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。兩步法擴(kuò)增反應(yīng)程序50℃ 2min，預(yù)變性95℃ 10min；然后95℃ 15s，65℃ 1min循環(huán)40次。
檢測結(jié)果如圖3所示，有2條上升的曲線，其中，曲線1代表小麥印度腥黑穗病菌T.indica的單個(gè)冬孢子的檢測結(jié)果，曲線3代表T.indica的菌絲DNA的檢測結(jié)果。而曲線2代表黑麥草腥黑穗病菌T.walkeri的單個(gè)冬孢子的檢測結(jié)果，曲線4代表T.walkeri的菌絲DNA的檢測結(jié)果，曲線5代表無DNA模板的陰性對照。由圖3可知，定量PCR儀檢測到以小麥印度腥黑穗病菌的DNA為模板的陽性對照FAM熒光信號增長，陰性對照和空白對照都沒有熒光信號增長，而樣品的檢測結(jié)果是FAM熒光信號增長，表明檢測到的真菌是小麥印度腥黑穗病菌。
序列表<110>上海出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物、探針及檢測方法<130>NP-10481<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>300<212>DNA<213>Tilletia indica<400>1atcattagtg aattacggag ctcttcttcg gaagagtctc cttctctttt atcccaacac 60caaactacgg aaggaacgag gccttgcgct gagtacctgt ccggatggaa cagagttgct 120ggtacttcgg tattggcagc gctgctccaa cccttttaaa cacttaagaa ttaaagaatg 180ttaaaactat tgtcttcgga cataaactaa tatacaactt ttgacaacgg atctcttggt 240tctcccatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 300<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ttctctttta tcccaacacc aaact 25
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cttatcgcat ttcgctgcg19<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<400>4cggaaggaac gaggc15<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aaggtttctg taggtgaacc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gatatgctta agttcagcgg g 2權(quán)利要求
1.一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物，其序列為5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)。
2.一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測引物，其序列為5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
3.一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測探針，其序列為5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。
4.一種小麥印度腥黑穗病菌的檢測方法，包括如下步驟(1)提取冬孢子DNA；(2)設(shè)計(jì)如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的引物及權(quán)利要求3所述的探針；(3)以步驟(1)中提取的DNA為模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；(4)以步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用步驟(2)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica的檢測引物及探針；此外，本發(fā)明還公開了使用該引物和探針檢測小麥印度腥黑穗病菌的方法。利用引物和探針可以特異性區(qū)分小麥印度腥黑穗病菌，且大大縮短了檢測時(shí)間，檢測的靈敏度也大大提高。
文檔編號C12Q1/68GK101054599SQ20061002568
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者易建平, 周國梁, 印麗萍 申請人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局