專利名稱：一種含有bmp－7基因的重組腺病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)基因的重組腺病毒及其用途。
背景技術(shù)：
由于感染，火器傷以及良惡性腫瘤造成的骨缺損及骨不連等疾病一直是骨科臨床治療的難題，長(zhǎng)期以來(lái)，自體骨移植成為首選的治療方案，但該方法創(chuàng)傷大，容易發(fā)生感染等術(shù)后并發(fā)癥，因此研究人員和臨床醫(yī)師一直在尋找合適的藥物治療方案。
1965年，Urist在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了鹽酸脫鈣異體骨有骨誘導(dǎo)能力，并預(yù)言了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)的存在。
1990年英國(guó)劍橋大學(xué)遺傳學(xué)研究所的Celeste從人胎盤和胎腦基因組文庫(kù)中獲得了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的cDNA，同年，美國(guó)哈佛大學(xué)分子生物研究所的Ozkaynak從人基因組文庫(kù)中克隆出成骨蛋白-1(osteogenic protein-1，OP-1)的序列，經(jīng)核苷酸、氨基酸序列比較確定二者為同一種物質(zhì)。該蛋白為β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，是一個(gè)同源雙鏈的酸性糖蛋白，研究表明BMP-7可跨種屬誘導(dǎo)成骨而且新骨生成迅速，其生成量與BMP-7植入量呈正相關(guān)。
由于BMP-7在天然骨組織中含量極少，1公斤濕骨僅能提取1毫克BMP-7蛋白，所以研究人員試圖用基因工程方法獲得足量BMP-7蛋白以用于臨床治療。
國(guó)外已有研究機(jī)構(gòu)利用DNA重組技術(shù)得到了BMP-7純品，例如在美國(guó)，經(jīng)FDA批準(zhǔn)，BMP-7作為第一個(gè)用于臨床骨科的基因工程藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)；而在澳大利亞，BMP-7已經(jīng)獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用。
雖然BMP-7具有細(xì)胞因子的特點(diǎn)，用量極少而能發(fā)揮極大的作用，但應(yīng)用于體內(nèi)的BMP-7蛋白量仍需達(dá)到毫克級(jí)，而且BMP-7進(jìn)入體內(nèi)后易隨體液流失降解，半衰期短，不能局限在骨缺損部位發(fā)揮作用，因此必須尋找更有效的替代方法。近些年來(lái)，研究人員對(duì)眾多人類遺傳性疾病的動(dòng)物模型進(jìn)行了細(xì)胞和分子生物學(xué)及臨床前期的研究，一系列重要的技術(shù)進(jìn)展使基因治療成為可能。而實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵在于目的基因的高效轉(zhuǎn)移并適度表達(dá)，因此探索理想的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是基因治療的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種新的重組腺病毒，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種含有重組腺病毒并用于基因治療的植入材料。
本發(fā)明需要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種重組腺病毒在制備治療骨缺損疾病中的用途。
本發(fā)明需要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種重組腺病毒在制備基因治療載體中的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的本發(fā)明提供了一種構(gòu)建的重組腺病毒，其特征在于，所述的重組腺病毒是將BMP-7序列插入到穿梭載體pAdTrack中，在BJ5183細(xì)胞內(nèi)與病毒骨架AdEasy完成同源重組，并轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，經(jīng)二次感染后得到大量重組病毒顆粒，CsCl梯度超速離心得到純化的重組腺病毒。其中重組腺病毒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，所述及的包裝細(xì)胞是293T細(xì)胞。
本發(fā)明還公開了含有權(quán)利要求1所述重組腺病毒的用于基因治療的植入材料，其特征在于，所述及的植入材料是用如下方法制備的將構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并以高分子多聚物和膠原蛋白作為載體，在體外共培養(yǎng)，即獲得植入骨缺損處的植入材料，其中高分子多聚物是聚乳醇酸PLGA。該植入材料植入橈骨缺損處，以PLGA和膠原蛋白搭建的框架為生長(zhǎng)空間，BMP-7刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)繼續(xù)在支架材料中增殖分化為成骨細(xì)胞，同時(shí)MSCs不斷分泌BMP-7蛋白，通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制加快細(xì)胞的分化過(guò)程，這種分泌刺激的加速過(guò)程是新骨形成的重要基礎(chǔ)。
本發(fā)明公開了重組腺病毒在制備治療骨缺損疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還公開了重組腺病毒在制備基因治療載體中的應(yīng)用，利用構(gòu)建的該重組腺病毒AdCMV-BMP-7轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)體外共培養(yǎng)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)生長(zhǎng)在膠原蛋白支架上，復(fù)合高分子材料PLGA共同植入骨缺損處，以PLGA和膠原蛋白搭建的框架為生長(zhǎng)空間，BMP-7刺激MSCs繼續(xù)在支架材料中增殖分化為成骨細(xì)胞，同時(shí)MSCs不斷分泌BMP-7蛋白，通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制加快細(xì)胞的分化過(guò)程，這種分泌刺激的加速過(guò)程是新骨形成的重要基礎(chǔ)。
AdCMV-BMP-7修復(fù)骨缺損的試驗(yàn)表明，骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為具有分化能力的前體細(xì)胞，在外源BMP-7作用下，胞內(nèi)ALP合成增多，提示其向成骨方向分化，并且在接受BMP-7刺激信號(hào)后可分泌BMP-7蛋白至胞外，形成一個(gè)自分泌的循環(huán)過(guò)程；驗(yàn)證了基于細(xì)胞的基因治療應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的有效性，結(jié)果顯示，植入材料，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和BMP-7在體內(nèi)共同模擬了自然的成骨過(guò)程，加快了新骨生成的速度，這是單一成分或二者結(jié)合所不能達(dá)到的。


圖1穿梭載體pTrack-BMP-7的構(gòu)建用HindIII/XbaI雙酶切pGEM-T-BMP-7及pAdTrack(9220bp)，將經(jīng)膠回收的1293bp BMP-7基因與酶切后的pAdTrack連接轉(zhuǎn)化，挑選克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，篩選出大小約10000bp的pAdTrack-BMP-7。
圖2重組pAdCMV-BMP-7及空載體pAd-GFP的構(gòu)建pAdTrack-BMP-7，pAdTrack經(jīng)Pme I酶切線性化，分別與pAdEasy-1(33414bp)載體共轉(zhuǎn)化BJ5183宿主菌，經(jīng)50μg/ml卡那霉素的瓊脂板篩選。挑選克隆，抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定。酶切后進(jìn)行1.5％瓊脂糖電泳得到1293bp的BMP-7和大小約3000bp的載體片段。
圖3篩選出大小約34kb的重組缺陷型腺病毒載體pAdCMV-BMP-7和空載體pAd-GFP。將所得病毒載體用PacI酶切鑒定，檢測(cè)重組載體的DNA大小及其特征性3000bp大小的酶切片段具體實(shí)施方式
腺病毒載體是近年來(lái)用于基因治療最多的病毒載體之一，它可感染多種細(xì)胞，而且不整合到宿主基因組中，表達(dá)持續(xù)的時(shí)間短，這正是局部成骨所需要的。本發(fā)明利用了腺病毒的這一特性，嘗試用基因治療的方法使BMP-7在骨缺損局部持續(xù)分泌表達(dá)，驗(yàn)證其加快骨愈合過(guò)程的能力。
但如何調(diào)控導(dǎo)入體內(nèi)的基因表達(dá)，是目前基因治療研究中無(wú)法解決的難題。與遺傳性疾病不同，骨創(chuàng)傷及某些骨病治療要求導(dǎo)入體內(nèi)的外源基因(如BMP-7)表達(dá)有一定時(shí)限，在骨折愈合或骨量升至正常后，不再需要外源基因繼續(xù)表達(dá)。應(yīng)用復(fù)制缺陷型腺病毒載體進(jìn)行骨缺損治療，所攜帶的外源基因表達(dá)持續(xù)數(shù)周或數(shù)月后即消失，這一特點(diǎn)恰恰符合骨修復(fù)基因治療的要求；在這一段時(shí)間內(nèi)所表達(dá)的細(xì)胞因子對(duì)骨修復(fù)已足夠，而又不必?fù)?dān)心持續(xù)的過(guò)度表達(dá)引起骨質(zhì)增生過(guò)度，影響骨改建及可能的致瘤性。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 BMP-7全長(zhǎng)序列的獲得1.獲得BMP-7全長(zhǎng)cDNA編碼區(qū)序列從ATCC構(gòu)得BMP-7mRNA豐度高的骨肉瘤細(xì)胞株U2 OS，以此總RNA為模板，用RT-PCR方法得到hBMP-7序列，經(jīng)測(cè)序，與GeneBank報(bào)道的序列完全一致。
2.構(gòu)建p114真核表達(dá)載體設(shè)計(jì)BMP-7引物時(shí)，在酶切位點(diǎn)和起始密碼子之間設(shè)計(jì)了Kozak序列，該序列廣泛應(yīng)用于真核表達(dá)系統(tǒng)，可促進(jìn)目的基因的表達(dá)。所有構(gòu)建產(chǎn)物均經(jīng)過(guò)HindIII/XbaI雙酶切鑒定。柱純法得到純化的重組BMP-7質(zhì)粒，測(cè)O.D值確定質(zhì)粒濃度以備細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例2重組腺病毒AdCMV-BMP-7的構(gòu)建1、穿梭載體pAdTrack-BMP-7的構(gòu)建分別用HindIII/XbaI酶切pGEM-T-BMP-7及pAdTrack質(zhì)粒，將目的基因與酶切的pAdTrack連接轉(zhuǎn)化，挑克隆，抽提質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出pAdTrack-BMP-7。
2、重組腺病毒載體的構(gòu)建穿梭載體pAdTrack-BMP-7和pAdTrack經(jīng)Pme I酶切線性化后，分別與Adeasy-1載體共轉(zhuǎn)化BJ5183宿主菌，經(jīng)50μg/ml卡那霉素的瓊脂板篩選出陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定。將構(gòu)建的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)化至DH5α菌中，大量擴(kuò)增后提取重組DNA，鑒定正確后柱純法得到大量純化重組質(zhì)粒，O.D法確定其濃度以備細(xì)胞轉(zhuǎn)染。抽提重組腺病毒質(zhì)粒的方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
3、重組腺病毒的包裝病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞前，將293細(xì)胞傳入6孔板，長(zhǎng)至60～80％融合。將經(jīng)Pac I酶切線性化的重組腺病毒載體及空載體各5μg，分別加入500μl無(wú)血清培養(yǎng)基OPTI中，室溫靜置5min；脂質(zhì)體Lipofectamine200015μl加入500μl無(wú)血清培養(yǎng)基OPTI，室溫靜置5min；二者輕輕混勻，室溫靜置20分鐘；將293細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗2次；將質(zhì)粒/脂質(zhì)體混合液1ml和500μl新鮮OPTI混合后加入細(xì)胞中，37℃，7％CO2培養(yǎng)4h后，再加入1.5ml含20％FBS的DMEM/1640培養(yǎng)基，24h-48h后即可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。
4、重組腺病毒的獲得轉(zhuǎn)染大約48h后，顯微鏡下即可見到包裝成功的病毒感染的293細(xì)胞。收取細(xì)胞，離心棄上清，用少量PBS重懸細(xì)胞，于37℃和-80℃之間反復(fù)凍融3次，離心后收取上清，置于-80℃保存。
5、重組腺病毒的擴(kuò)增感染前24小時(shí)，293細(xì)胞按照1∶2-1∶3傳代；棄除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.5ml稀釋的病毒上清，輕轉(zhuǎn)搖勻，置37℃培養(yǎng)箱感染1小時(shí)；加入10ml培養(yǎng)液(含5％血清)，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，至細(xì)胞毒性反應(yīng)(CPU)完全發(fā)生；將細(xì)胞及培養(yǎng)液收集至離心管，在-80℃和37℃之間反復(fù)凍融三次。1000g離心10分鐘，將病毒上清集中于一無(wú)菌管中保存于-80℃，此為第一代病毒。相同方法可制得第二代病毒。
6、CsCl離心純化腺病毒CsCl低密度母液67.2gCsCl/300g總?cè)芤?50mmol/L Tris-HCl PH7.4)＝22.4％CsCl(W/W)即1.2g/ml；CsCl高密度母液126.6gCsCl/300g總?cè)芤?50mmol/L Tris-HCl PH7.4)＝42.2％CsCl(W/W)即1.46g/ml；在12ml離心管中加入3ml高密度CsCl，再小心地在其上面鋪3ml低密度CsCl，將5ml病毒上清鋪在低密度CsCl上。用吊桶式ST41型轉(zhuǎn)頭，超速離心35000rpm/min，4℃，4h。在高/低密度CsCl之間會(huì)有一條藍(lán)白色帶，用18號(hào)針頭刺入帶的下面，以盡可能小的體積吸出病毒。純化后的病毒液在10mM TrispH8.0，2mM MgCl2，5％蔗糖緩沖液中透析。透析膜孔徑小于10kDa。
7、OD260法測(cè)病毒滴度配制病毒裂解液(VLB)0.1％SDS，10M Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA。
(1)首先在無(wú)菌條件下用病毒裂解液準(zhǔn)備兩個(gè)病毒稀釋度；


(2)56℃振蕩培養(yǎng)10min；(3)準(zhǔn)備1ml含有VLB和透析緩沖液的空白對(duì)照溶液，比例同上，以緩沖液代替病毒；(4)測(cè)定OD260處吸光度值稀釋液1再稀釋1∶5，為稀釋液3；稀釋液2再稀釋1∶5和1∶10，分別為稀釋液4和5；測(cè)定稀釋液5(2次)，4，3的OD260，取其4值的平均值作為最終結(jié)果。將OD260值與稀釋度相關(guān)系數(shù)相乘即可得出病毒滴度病毒的滴度(VP/ml)＝OD值×病毒稀釋倍數(shù)×1.1×1012實(shí)施例3 AdCMV-BMP-7修復(fù)骨缺損的試驗(yàn)本部分試驗(yàn)利用第一部分構(gòu)建的AdCMV-BMP-7轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)體外共培養(yǎng)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)生長(zhǎng)在膠原蛋白支架上，復(fù)合高分子材料PLGA共同植入骨缺損處，以PLGA和膠原蛋白搭建的框架為生長(zhǎng)空間，BMP-7刺激MSCs繼續(xù)在支架材料中增殖分化為成骨細(xì)胞，同時(shí)MSCs不斷分泌BMP-7蛋白，通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制加快細(xì)胞的分化過(guò)程，這種分泌刺激的加速過(guò)程是新骨形成的重要基礎(chǔ)。
1、分離兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)雄性成年新西蘭大白兔，3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，股骨大轉(zhuǎn)子處備皮，碘伏消毒，用2號(hào)骨穿針經(jīng)皮刺入大轉(zhuǎn)子骨髓腔內(nèi)，抽出內(nèi)針，可見有骨髓流出，用經(jīng)過(guò)50U/ml肝素預(yù)處理的10ml注射器吸取流出的骨髓液，與10％FBS-DMEM/1640培養(yǎng)液等體積混合。
制備Percoll密度梯度Percoll母液購(gòu)自Amersham公司，密度為1.135mg/l。取1份母液與9份PBS混合，此為100％Percoll；以100％Percoll為基礎(chǔ)，分別制備53％，50％，30％的Percoll，稀釋液為PBS。
在15ml離心管中，從下到上依次緩慢加入以下成分1ml 100％Percoll，1.5ml53％Percoll，1.5ml 50％Percoll，1.5ml 30％Percoll，3-4ml混合骨髓液。根據(jù)所取骨髓液的體積決定Percoll的體積。將制備好的密度梯度離心管置于角對(duì)稱離心機(jī)中，2000rpm室溫離心30min。取出離心管，用注射器小心將白色細(xì)胞層吸出，加入含15％FBS的DMEM/1640培養(yǎng)基，37℃，7％CO2孵箱中培養(yǎng)。4天后第一次換液，細(xì)胞長(zhǎng)出后可進(jìn)行傳代。
2、兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法獲得兔MSCs。培養(yǎng)第四天，培養(yǎng)皿中可見梭形細(xì)胞散落長(zhǎng)出(如圖3.1.2-A)，第七天時(shí)，細(xì)胞匯合約50％，鏡觀形態(tài)均一，呈梭形，有的細(xì)胞有1-2個(gè)偽足(如圖3.1.2-B)，第十天時(shí)細(xì)胞成片生長(zhǎng)，密度高的部位細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞內(nèi)顆粒有所增加(如圖3.1.2-C)。細(xì)胞以高密度傳代培養(yǎng)，第3，4代細(xì)胞形態(tài)趨向一致(如圖3.1.2-D)，圖見下頁(yè)。
3、檢測(cè)植入材料的生物相容性支架材料是骨缺損修復(fù)過(guò)程中不可缺少的一部分，它既是新生組織生長(zhǎng)的支架，也是BMP-7和MSCs細(xì)胞的載體，本實(shí)驗(yàn)選用高分子多聚物聚乳醇酸PLGA和膠原蛋白作為載體，在體外與MSCs共培養(yǎng)，驗(yàn)證其生物相容性。
4、植入材料與MSCs體外共培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用的膠原海綿厚約3mm，無(wú)菌條件下將膠原海綿剪成1cm大小，取生長(zhǎng)良好的第三代MSCs細(xì)胞，制成密度為5×104/ml的細(xì)胞懸液；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1ml細(xì)胞懸液，同時(shí)分別加入準(zhǔn)備好的膠原海綿，常規(guī)進(jìn)行共培養(yǎng)。鏡下觀察，海綿周圍有細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，而放置海綿的部位沒有細(xì)胞生長(zhǎng)。隔日將海綿進(jìn)行消化(細(xì)胞用消化液)，發(fā)現(xiàn)有大量細(xì)胞游離出載體，形態(tài)飽滿，活細(xì)胞數(shù)占95％以上。
5、建立合適的動(dòng)物骨缺損模型為正確評(píng)價(jià)應(yīng)用BMP-7治療骨缺損的效果，缺損部位宜選擇在長(zhǎng)骨干，因?yàn)殚L(zhǎng)骨干有完整的骨髓腔及清晰的骨皮質(zhì)層，便于進(jìn)行放射學(xué)及骨密度檢測(cè)，制造的缺損以不能完全自愈為宜，還應(yīng)盡可能避免輔助治療手段(如內(nèi)外固定等)。綜上所述，我們選擇新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其前肢尺橈骨之間有骨間膜相連，橈骨缺損形成的斷端可附著于尺骨上，不會(huì)因錯(cuò)位而影響治療效果，是觀察研究的理想模型。
6、實(shí)驗(yàn)分組以健康成年雄性新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共分為5組(1)空白組不作任何處理；(2)材料組缺損處植入同治療組等量的支架材料；(3)細(xì)胞組缺損處植入同治療組等量的MSCs細(xì)胞；(4)空載體對(duì)照組缺損處植入感染Ad空載體的MSCs；(5)BMP-7治療組每處缺損給予1×107感染AdCMV-BMP-7的MSCs。手術(shù)過(guò)程始終保持無(wú)菌，術(shù)前術(shù)后給予環(huán)丙沙星和金霉素眼膏抗感染。手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后每?jī)芍苓M(jìn)行放射學(xué)檢查，結(jié)束觀察的動(dòng)物解剖后取新鮮標(biāo)本制作病理切片，部分標(biāo)本進(jìn)行骨密度測(cè)定。
放射影像學(xué)結(jié)果顯示BMP-7治療組的新骨生成量明顯多于對(duì)照組，在兩周時(shí)有明顯的骨膜反應(yīng)，開始有新骨痂形成；四周時(shí)有50％動(dòng)物的骨缺損完全愈合，而對(duì)照組的斷端骨髓腔已閉塞；八周時(shí)BMP-7治療組動(dòng)物全部愈合，其中60％有骨髓腔再通，新生骨痂更加光滑，提示BMP-7具有顯著促進(jìn)骨愈合的能力。骨密度測(cè)定結(jié)果提示治療組新生骨密度略高于正常橈骨中段骨密度，提示骨愈合過(guò)程中過(guò)量的鈣鹽沉積。病理切片100倍光鏡觀察顯示治療組的骨愈合部位鮮有支架材料殘留，有大量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞排列在骨痂處，骨髓腔完整，腔內(nèi)淋巴細(xì)胞和脂肪細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。對(duì)照組可見支架材料殘留，骨髓腔閉塞，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞稀疏。以上結(jié)果均提示BMP-7可加快新骨生成速度，且新生骨密度和強(qiáng)度與正常骨相比基本無(wú)差別。
本試驗(yàn)成功分離、純化了兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞，作為具有分化能力的前體細(xì)胞，MSCs在外源BMP-7作用下，胞內(nèi)ALP合成增多，提示其向成骨方向分化，并且在接受BMP-7刺激信號(hào)后可分泌BMP-7蛋白至胞外，形成一個(gè)自分泌的循環(huán)過(guò)程；驗(yàn)證了基于細(xì)胞的基因治療應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的有效性，結(jié)果顯示，植入材料，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和BMP-7在體內(nèi)共同模擬了自然的成骨過(guò)程，加快了新骨生成的速度，這是單一成分或二者結(jié)合所不能達(dá)到的。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建的重組腺病毒，其特征在于，所述的重組腺病毒是將BMP-7序列插入到穿梭載體pAdTrack中，在BJ5183細(xì)胞內(nèi)與病毒骨架AdEasy完成同源重組，并轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，經(jīng)二次感染后得到大量重組病毒顆粒，CsCl梯度超速離心得到純化的重組腺病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，所述及的重組腺病毒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，所述及的包裝細(xì)胞是293T細(xì)胞。
4.一種含有權(quán)利要求1所述重組腺病毒的用于基因治療的植入材料，其特征在于，所述及的植入材料是用如下方法制備的將構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并以高分子多聚物和膠原蛋白作為載體，在體外共培養(yǎng)，即獲得植入骨缺損處的植入材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植入材料，其特征在于，所述及的高分子多聚物是聚乳醇酸PLGA。
6.一種如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒在制備治療骨缺損疾病藥物中的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒在制備基因治療載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有BMP－7基因的重組腺病毒，以及將該重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并以高分子多聚物聚乳醇酸PLGA和膠原蛋白作為載體，在體外共培養(yǎng)，形成一種用于基因治療的植入材料。本發(fā)明用基因治療的方法使BMP－7在骨缺損局部持續(xù)分泌表達(dá)，提高加快骨愈合過(guò)程的能力。本發(fā)明還公開了重組腺病毒在制備治療骨缺損疾病藥物中的應(yīng)用，重組腺病毒在制備基因治療載體中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101037674SQ20061002470
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者黃芳, 錢衛(wèi)珠, 鄒萍 申請(qǐng)人:上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司