一種用于檢測(cè)樣品中豬凸隆病毒的熒光rt-pcr引物和探針和試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT?PCR引物和熒光探針，所述引物和熒光探針為針對(duì)豬凸隆病毒M基因保守序列設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性正反向引物和熒光探針。本發(fā)明還公開(kāi)了用于檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明對(duì)豬凸隆病毒基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性探針和引物，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)即可確診樣本感染豬凸隆病毒，具有簡(jiǎn)便、快速、特異性高、靈敏度高的特點(diǎn)，可用于豬活畜和肉品檢疫時(shí)豬凸隆病毒的快速診斷和流行病學(xué)研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種用于檢測(cè)樣品中豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和探針和試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)樣品中豬凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)的熒光RT-PCR引物和探針和試劑盒及檢測(cè)方法，可用于豬活畜和肉品檢疫時(shí)豬凸隆病毒的快速診斷和流行病學(xué)研究。
【背景技術(shù)】
[0002]凸隆病毒(Torovirus)作為套式病毒目(Nidovirairs)冠狀病毒科(Coronaviridae)家族的重要成員，包括馬凸隆病毒(Equine Torovirus，EToV，最初稱(chēng)為伯爾尼病毒)、牛凸隆病毒(Bovine Torovirus，BToV，最初稱(chēng)為布雷達(dá)病毒)、豬凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)和人凸隆病毒(Human Torovirus，HToV)等四種標(biāo)準(zhǔn)型。凸隆病毒有囊膜病毒，表現(xiàn)為圓形，橢圓形、線形或者腎形，也有呈現(xiàn)桿狀和小圓盤(pán)狀的記載，最大直徑為120?140nm，基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)28，473kb。該病毒感染人和動(dòng)物，主要引起消化道和呼吸道疾病。自1982年，美國(guó)愛(ài)荷華州爆發(fā)一場(chǎng)由牛凸隆病毒引發(fā)的嚴(yán)重腹瀉以來(lái)，瑞士、英國(guó)、德國(guó)、南非、巴西、印度、加拿大、荷蘭、澳大利亞、日本、韓國(guó)等全球不同國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道由凸隆病毒感染馬、牛、豬、人等引起的腹瀉事件，至2010年底以來(lái)，中國(guó)華南、華東、華中等地區(qū)爆發(fā)了哺乳仔豬腹瀉疫情，臨床癥狀多為水樣腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水。I周齡以下的仔豬最為易感染，此病發(fā)病率和死亡率較高，很多豬場(chǎng)的豬發(fā)病后死亡率高達(dá)100 %，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]凸隆病毒是腸道病原體，可以感染各年齡的易感動(dòng)物，包括豬、牛、馬、人等，主要引起被感染動(dòng)物的胃腸炎。目前被報(bào)道的檢測(cè)手段包括抗原捕獲-沒(méi)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫電鏡(IEM) JLISA方法雖然是一個(gè)快速且廉價(jià)方法，但是由于目前凸隆病毒不能在細(xì)胞中培養(yǎng)，導(dǎo)致在以發(fā)病動(dòng)物的排泄物或腸道內(nèi)容物作為抗原來(lái)源時(shí)，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較高背景，大大降低了 ELISA方法的特意性和敏感性。
[0004]四川農(nóng)業(yè)大學(xué)于2012年申請(qǐng)了專(zhuān)利《一種豬環(huán)曲病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法》，申請(qǐng)?zhí)?201210398440.8，該專(zhuān)利采用RT-PCR方法，擴(kuò)增需要采用凝膠電泳技術(shù)才能觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，同時(shí)采取開(kāi)蓋處理容易產(chǎn)生氣溶膠污染，并不適合開(kāi)發(fā)快速，便捷產(chǎn)品。
[0005]IEM方法是一個(gè)流行病學(xué)診斷中非常重要的方法，但是由于其需要高度精密設(shè)備和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，加之檢測(cè)成本較高，所以很難做到大范圍推廣和商業(yè)化。
[0006]實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的全過(guò)程可以在單管內(nèi)封閉完成，并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié)果，具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，是一種先進(jìn)的分子檢測(cè)技術(shù)。目前還沒(méi)有基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的豬凸隆病毒核酸檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的之一是針對(duì)于豬凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)基因編碼區(qū)的特異保守區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域而提供一種用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針。
[0008]本發(fā)明目的之二是提供一種包括上述熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒。
[0009]本發(fā)明目的之三是提供一種使用上述熒光RT-PCR引物和熒光探針對(duì)豬凸隆病毒的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可以快速、定性檢測(cè)樣本中的豬凸隆病毒。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0011]—種用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述熒光RT-PCR引物和熒光探針為針對(duì)豬凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列設(shè)計(jì)的豬凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述豬凸隆病毒正向、反向引物和熒光探針序列分別是:
[0013]正向引物:5’-AGCCTYACATCTTTGGCAAT-3’(SEQID N0.1)
[0014]反向引物:5’-CTAAAATGGTGGCAATTACAGTAAG-3’(SEQID N0.2)
[0015]熒光探針:5，-TGGTGGCTTCCTAGTATGACCTTTACYGGCT-3，(SEQID N0.3)；
[0016]所述熒光探針的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，5’端分別標(biāo)記有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
[0017]上述引物和探針的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5’端和3’端方向延伸一至十個(gè)堿基或刪減一至十個(gè)堿基得到的序列。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、J0E、R0X、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlack? RQ或Lowa Black? FQ0
[0019]一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品，其中RT-PCR反應(yīng)液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、內(nèi)標(biāo)正向、反向引物、內(nèi)標(biāo)探針和上述檢測(cè)豬凸隆病毒的豬凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針、含有鎂離子的緩沖液。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述內(nèi)標(biāo)正向、反向引物和內(nèi)標(biāo)探針序列分別是:
[0021]內(nèi)標(biāo)正向引物:5’-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3’(SEQID N0.4)
[0022]內(nèi)標(biāo)反向引物:5’-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3’(SEQID N0.5)
[0023]內(nèi)標(biāo)探針:5’-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3，(SEQID N0.6)；
[0024]所述內(nèi)標(biāo)探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
[0025]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、J0E、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、AMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlack? RQ或Lowa Black? FQ0。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的酶混合液為包含有熱啟動(dòng)的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為1.0 X 16Copies/mlo
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液是將含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液稀釋后得到。
[0029]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述豬凸隆病毒特異型保守序列為:
[0030]
AGCCTTACATCTTTGGCAATTGCTTATTGGTGGCTTCCTAGTATGACCTTTACTGGCTACTGGGCACTTACTGTAATTGCCACCATTTTAG(SEQ ID N0.7)。
[0031 ]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的無(wú)菌TE緩沖液采用DEPC水配制。
[0032]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的內(nèi)標(biāo)溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒質(zhì)粒。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的人RNP基因特異型保守序列為:
[0034]
GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC(SEQ ID N0.8)。
[0035]本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0036]—種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，包括以下步驟:
[0037](I)樣本RNA的提取:所述樣本RNA可以采用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)病毒RNA磁珠提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取；
[0038](2)以待檢測(cè)樣本RNA為模板，采用上述的RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液與待檢測(cè)樣本RNA—起配制RT-PCR反應(yīng)體系，對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:第一階段:50 V151^11，951€21^11，1個(gè)循環(huán);第二階段:95°(:108，601€308，40個(gè)循環(huán);第二階段每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào);所述熒光探針和內(nèi)標(biāo)探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)兩個(gè)熒光檢測(cè)通道，分別為目標(biāo)熒光通道和內(nèi)標(biāo)熒光通道；
[0039](3)反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct，根據(jù)擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷:當(dāng)FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均<37，可判定豬凸隆病毒陽(yáng)性；當(dāng)FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均彡37時(shí)可判定豬凸隆病毒陰性；當(dāng)FAM通道有擴(kuò)增曲線，但37<Ct值彡40，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均<37時(shí)建議重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果同上，可判定為陽(yáng)性，如果無(wú)擴(kuò)增，可判定為陰性；當(dāng)FAM通道和NEX通道均無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，實(shí)驗(yàn)無(wú)效、建議更換一批試劑重新實(shí)驗(yàn)。
[0040]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述RT-PCR反應(yīng)體系中，RT-PCR反應(yīng)液18μ1、酶混合液Ιμ?、內(nèi)標(biāo)溶液Ιμ?、RNA模板5μ1。
[0041]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(3)中的分析條件設(shè)置如下:根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線(Base line)的Start值、Stop值以及閾值(Threshold)的Value值(用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3-15、end值可以在5-20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線)，使儀器給出正確的結(jié)果。
[0042]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(3)中的質(zhì)量控制條件如下:
[0043]I).陰性對(duì)照:FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均< 32;
[0044]2).陽(yáng)性對(duì)照:FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均彡32 ；
[0045]以上兩個(gè)要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0046]Ct值(cycle threshold，Ct)的定義為:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)焚光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值的設(shè)定一般是將其設(shè)定為恰好可以覆蓋住陰性對(duì)照和空白對(duì)照的熒光值處，因此可以很好的去除反應(yīng)管熒光值即背景。
[0047]本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)快速、特異的單管檢測(cè)樣本中是否含有豬凸隆病毒，與其它檢測(cè)技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0048]1、全封閉反應(yīng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒鈹?shù)據(jù)，無(wú)需后續(xù)處理，避免污染，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0049]2、快速，操作簡(jiǎn)單，全程3個(gè)小時(shí)即可出診斷結(jié)果，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
[0050]3、實(shí)現(xiàn)單管雙重檢測(cè)，同時(shí)引入了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控，提高了檢測(cè)人員的檢測(cè)效率，監(jiān)控抽提效率和排除抑制劑干擾。
[0051]4、探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)特有的優(yōu)勢(shì)，即特異性更強(qiáng)、靈敏度更高，完全滿(mǎn)足豬凸隆病毒流行病學(xué)診斷和疫情監(jiān)控，為降低病死率以及控制疫情爭(zhēng)取時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1為豬凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的FAM通道線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中S1-S8表示濃度為1.0X 110Copies/ml、I.0 X 19Copies/ml、I.0 X 18Copies/ml、1.0 X 17Copies/ml、I.0 X106copies/ml、1.0X105copies/ml、1.0X104copies/ml、1.0X103copies/ml、1.0X102COpieS/ml的陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，CK為陰性質(zhì)控品，橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)ARn表示熒光強(qiáng)度。通過(guò)該圖可以說(shuō)明該試劑盒的在1.0X 101()COpies/ml至1.0X 103copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系。
[0053]圖2為豬凸隆病毒核酸檢測(cè)試劑盒的FAM通道標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。該試劑盒擬合的線性方程為:Y = -3.4105X+45.906，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.99965，其中Y代表Ct值，X代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值
[0054]圖3為豬凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的檢出限實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S7-S9分別為1.0 X104copies/ml、1.0 X 103copies/ml、1.0 X 102copies/ml，各20次重復(fù)數(shù)據(jù)，該圖說(shuō)明該試劑盒的檢測(cè)限達(dá)到5copies/反應(yīng)。
[0055]圖4為豬凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S4和S6分別為1.0 X107copies/ml、I.0 X 105copies/ml，各 10次重復(fù)數(shù)據(jù)。
[0056]圖5為豬凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)ARn表示熒光強(qiáng)度，CK代表陰性質(zhì)控品，A代表PToV陽(yáng)性質(zhì)控品FAM通道擴(kuò)增曲線，B代表內(nèi)標(biāo)陽(yáng)性質(zhì)控品NEX通道擴(kuò)增曲線，特異性參考品分別為豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。這7種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好。
【具體實(shí)施方式】
[0057]本發(fā)明具有用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒及檢測(cè)方法采用TaqMan探針?lè)晒釶CR檢測(cè)技術(shù)，快速檢測(cè)樣品中豬凸隆病毒特有序列，從而判斷樣品中是否存在豬凸隆病毒。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特色將會(huì)隨著描述而更加清楚。這些實(shí)施例僅是示范性，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，凡是利用本
【發(fā)明內(nèi)容】
所做的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，直接或間接運(yùn)用于其他相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。試劑盒在檢測(cè)豬凸隆病毒的使用方法即檢測(cè)方法，下面以試劑盒為例進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn)、最低檢出限實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)和特異性實(shí)驗(yàn)。
[0058]實(shí)施例1試劑盒的線性實(shí)驗(yàn)
[0059]目標(biāo)靶標(biāo)探針標(biāo)記為FAM熒光基團(tuán)，該試劑盒的FAM通道的線性參比品，由含有目的片段的質(zhì)粒組成，采用TE緩沖液將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍的梯度稀釋得到下列梯度溶液(S1:
1.0X 1010copies/ml、S2: 1.0 X 109copies/ml、S3: 1.0 X 108copies/ml、S4:1.0 X 107copies/ml、S5:1.0 X 16Copies/ml、S6:1.0 X 15copies/ml、S7:1.0 X 14Copies/ml、S8:1.0 X103copies/ml)作為的線性參比品，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的在1.0X 101()copies/ml至
1.0X 103copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系，同時(shí)該試劑盒擬合的線性方程為:Y =-3.4105x+45.906，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.99965，其中Y代表Ct值，x代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖2。
[0060]實(shí)施例2試劑盒的最低檢出限實(shí)驗(yàn)
[0061 ]該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的最低檢出限，采用線性參比品中的S7:1.0 X 104copies/ml、S8:1.0X103copies/ml、S9:1.0X102copies/ml等濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為檢出限參比品，每個(gè)濃度進(jìn)行20個(gè)重復(fù)樣品，其中檢出限參比品S7和S8全部表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性數(shù)據(jù)，S9參比品僅有8個(gè)樣品擴(kuò)增出S型曲線，不滿(mǎn)足要求，因此通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的檢出限為1.0X 103copies/ml，即達(dá)到5copies/反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖3。
[0062]實(shí)施例3試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)
[0063]該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的批內(nèi)精密度，采用線性參比品中的S4:1.0X 107copies/mUS6:1.0 X 105COpieS/ml等兩個(gè)高低濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為精密度參比品，各做10個(gè)重復(fù)樣本，結(jié)果兩個(gè)濃度數(shù)據(jù)變異系數(shù)均小于5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖4。
[0064]實(shí)施例4試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)
[0065]該實(shí)驗(yàn)選擇與豬凸隆病毒具有相同感染部位的常見(jiàn)病原體作為特異性參考品，采用的是滅活陽(yáng)性樣本。特異性參考品分別為豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。利用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司研發(fā)的通用性病毒DNA/RNA提取試劑盒提取以上滅活樣本中的DNA/RNA作為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這7種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述熒光RT-PCR引物和熒光探針為針對(duì)豬凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列設(shè)計(jì)的豬凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針。2.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述豬凸隆病毒正向、反向引物和熒光探針序列分別是: 正向引物:5’-AGCCTYACATCTTTGGCAAT_3’(SEQ ID N0.1) 反向引物:5’-CTAAAATGGTGGCAATTACAGTAAG-3'(SEQ ID N0.2) 熒光探針:5’-TGGTGGCTTCCTAGTATGACCTTTACYGGCT-3'(SEQ ID N0.3)； 所述熒光探針的3 ’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，5 ’端分別標(biāo)記有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。3.如權(quán)利要求2所述的一種用于檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述熒光探針的3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)選自MlQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black? RQ或Lowa Black? FQ04.一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品，其中RT-PCR反應(yīng)液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、內(nèi)標(biāo)正向、反向引物、內(nèi)標(biāo)探針和權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測(cè)豬凸隆病毒的豬凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針、含有鎂離子的緩沖液。5.如權(quán)利要求4所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)正向、反向引物和內(nèi)標(biāo)探針序列分別是: 內(nèi)標(biāo)正向引物:5’-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3’(SEQ ID N0.4) 內(nèi)標(biāo)反向引物:5’-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'(SEQ ID N0.5) 內(nèi)標(biāo)探針:5’-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'(SEQ ID N0.6)； 所述內(nèi)標(biāo)探針的5 ’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3 ’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。6.如權(quán)利要求5所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)探針的5 ’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述內(nèi)標(biāo)探針的3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、AMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black? RQ或Lowa Black? FQ07.如權(quán)利要求4所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的酶混合液為包含有熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。8.如權(quán)利要求4所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為1.0X 106COpieS/ml。9.如權(quán)利要求8所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的PUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液是將含有插入豬凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液稀釋后得到。10.如權(quán)利要求4所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述豬凸隆病毒特異型保守序列為: AGCCTTACATCTTTGGCAATTGCTTATTGGTGGCTTCCTAGTATGACCTTTACTGGCTACTGGGCACTTACTGTAATTGCCACCATTTTAG(SEQ ID N0.7)。11.如權(quán)利要求9所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的無(wú)菌TE緩沖液采用DEPC水配制。12.如權(quán)利要求4所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的內(nèi)標(biāo)溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒質(zhì)粒。13.如權(quán)利要求12所述的一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)豬凸隆病毒的試劑盒，其特征在于，所述的人RNP基因特異型保守序列為: GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC(SEQ ID N0.8)。14.一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)樣本RNA的提取:所述樣本RNA可以采用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)病毒RNA磁珠提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提??； (2)以待檢測(cè)樣本RNA為模板，采用權(quán)利要求4至13任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液與待檢測(cè)樣本RNA—起配制RT-PCR反應(yīng)體系，對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:第一階段:50°C15min，95°C 2min，I個(gè)循環(huán)；第二階段:95 °C 1s，60°C 30s,40個(gè)循環(huán);第二階段每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào);所述熒光探針和內(nèi)標(biāo)探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)兩個(gè)熒光檢測(cè)通道，分別為目標(biāo)熒光通道和內(nèi)標(biāo)熒光通道； (3)反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct，根據(jù)擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷:當(dāng)FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均<37，可判定豬凸隆病毒陽(yáng)性；當(dāng)FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均<37時(shí)可判定豬凸隆病毒陰性；當(dāng)FAM通道有擴(kuò)增曲線，但37<Ct值(40，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均<37時(shí)建議重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果同上，可判定為陽(yáng)性，如果無(wú)擴(kuò)增，可判定為陰性；當(dāng)FAM通道和NEX通道均無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，實(shí)驗(yàn)無(wú)效、建議更換一批試劑重新實(shí)驗(yàn)。15.如權(quán)利要求14所述的一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)體系中，RT-PCR反應(yīng)液18μ1、酶混合液Ιμ?、內(nèi)標(biāo)溶液1μ1、尺熟模板541。16.如權(quán)利要求14所述的一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，其特征在于，步驟(3)中的分析條件設(shè)置如下:根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線(Baseline)的Start值、Stop值以及閾值(Threshold)的Value值(用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3_15、end值可以在5-20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線)，使儀器給出正確的結(jié)果。17.如權(quán)利要求14所述的一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)豬凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，其特征在于，步驟(3)中的質(zhì)量控制條件如下: 1).陰性對(duì)照:FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均彡32； 2).陽(yáng)性對(duì)照:FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均彡32;以上兩個(gè)要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105907887SQ201610097108
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年2月22日
【發(fā)明人】黃超杰, 朱海, 游騰飛, 付輝, 盧和華, 汪鳳林, 嚴(yán)義勇, 畢思遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司