專(zhuān)利名稱(chēng)：生物發(fā)光微生物數(shù)量抗干擾快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明生物發(fā)光微生物數(shù)量抗干擾快速檢測(cè)試劑盒 本發(fā)明涉及一種利用ATP生物發(fā)光法進(jìn)行微生物數(shù)量快速檢測(cè)的方法及檢測(cè)試劑盒，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。生物發(fā)光法檢測(cè)微生物細(xì)胞數(shù)量具有快速簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)過(guò)程僅為十幾分鐘，而常規(guī)的細(xì)菌、酵母和霉菌總數(shù)測(cè)定采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，從開(kāi)始培養(yǎng)到肉眼可見(jiàn)的菌落需要幾天，因此在微生物數(shù)量快速檢測(cè)方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)ATP生物發(fā)光法進(jìn)行的微生物數(shù)量測(cè)定技術(shù)由于不需要培養(yǎng)過(guò)程，具有較高的靈敏度，可用于工廠在生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行微生物總數(shù)的在線檢測(cè)，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供快速檢測(cè)手段。目前國(guó)外少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家已有靈敏的生物發(fā)光儀和很高純度的檢測(cè)試劑盒，然而不論高靈敏度的發(fā)光檢測(cè)儀還是高純度的發(fā)光檢測(cè)試劑，其價(jià)格都非常之高，簡(jiǎn)單的儀器一般為5～10萬(wàn)元/臺(tái)，稍好的其價(jià)格達(dá)到10～40萬(wàn)元/臺(tái)，與儀器配套的試劑盒價(jià)格為30～50元/次，這對(duì)于我國(guó)的情況來(lái)說(shuō)，檢測(cè)成本太高，因此在國(guó)內(nèi)完全未得到應(yīng)用。要實(shí)現(xiàn)ATP生物發(fā)光法在我國(guó)的大規(guī)模應(yīng)用，必須解決儀器和發(fā)光試劑兩大核心問(wèn)題，本研究近年來(lái)一直致力于生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)和生物發(fā)光檢測(cè)儀器的研究與開(kāi)發(fā)，目前生物發(fā)光檢測(cè)儀已研制出樣機(jī)，因此構(gòu)建生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒和建立程序化的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于推廣應(yīng)用顯得特別重要。本發(fā)明的目的在于構(gòu)建高靈敏度的ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒，建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌、酵母、霉菌及飲用水中微生物及藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微生物總數(shù)的快速檢測(cè)，為衛(wèi)生監(jiān)督和食品生產(chǎn)質(zhì)量控制提供關(guān)鍵技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種利用生物發(fā)光法快速檢測(cè)微生物數(shù)量的快速檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括熒光素酶及其保護(hù)劑、D-熒光素、標(biāo)準(zhǔn)ATP、發(fā)光檢測(cè)緩沖液、非細(xì)胞ATP去除劑、微生物細(xì)胞ATP抽提劑等試劑。(1)熒光素酶須經(jīng)純化，活力本底比達(dá)到50～500，活力要求在0.5mL發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的發(fā)光脈沖值CP6S不低于7000，活力檢測(cè)在0.5mL發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中加0.1mL熒光素酶、0.1mL 1×10-7mol/L ATP和0.3mL 25mmol/L pH7.8的發(fā)光檢測(cè)緩沖液進(jìn)行，本底以無(wú)菌超純水代替標(biāo)準(zhǔn)ATP在0.5mL發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行。(2)酶保護(hù)劑采用海藻糖、PEG6000和BSA的混合系統(tǒng)，含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L PEG、1～20mg/L BSA。酶液與酶保護(hù)劑按10∶1比例混合。(3)發(fā)光檢測(cè)緩沖液(簡(jiǎn)稱(chēng)GB)可采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等緩沖鹽中的一種配制成濃度為25mmol/L、pH7.2的緩沖液，優(yōu)選甘氨酰甘氨酸，將其配制為含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2的緩沖液。(4)D-熒光素的發(fā)光活力須達(dá)到相當(dāng)于Sigma L9504的水平。(5)非目的細(xì)胞ATP去除劑AE用含有50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/LEDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為0.1～10mg/mL。(6)微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec含1～30g/L TritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)、0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)。
本發(fā)明檢測(cè)試劑盒可預(yù)先按比例取熒光素酶100mL，加入酶保護(hù)劑10mL、含50～150mgD-熒光素的發(fā)光檢測(cè)緩沖液(含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2)10mL，得到120mL的ATP生物發(fā)光試劑，用棕色瓶裝。
為提高該生物發(fā)光試劑盒的抗干擾能力，還可以增加抗干擾培養(yǎng)基?？垢蓴_培養(yǎng)基包括抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型液體大樣檢測(cè)培養(yǎng)基，它們可分別消除防腐劑山梨酸及山梨酸鉀、苯甲酸及苯甲酸鈉，消毒劑二氧化氯、過(guò)氧乙酸、次氯酸鈉和過(guò)氧化氫以及臭氧和余氯的干擾，在檢測(cè)含有干擾的樣品時(shí)，與普通液體培養(yǎng)基相比，可大大提高檢測(cè)的靈敏度，具體用法見(jiàn)表1。
表1 抗干擾微生物液體培養(yǎng)基可以消除的干擾物質(zhì)及其濃度
應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行微生物數(shù)量快速測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法是通過(guò)在選定的生物發(fā)光儀和選定的系統(tǒng)中做ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，取對(duì)數(shù)后得到線性回歸方程，將經(jīng)過(guò)非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統(tǒng)中用同一批酶進(jìn)行ATP生物發(fā)光檢測(cè)，同時(shí)做空白對(duì)照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對(duì)發(fā)光值取對(duì)數(shù)后，通過(guò)建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據(jù)細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細(xì)菌、酵母、霉菌孢子或單細(xì)胞微藻的細(xì)胞數(shù)，或只計(jì)相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)量。如同一樣品中既有細(xì)菌、酵母、霉菌或微藻且須分別計(jì)量時(shí)，則須有一個(gè)依細(xì)胞大小分級(jí)過(guò)濾的過(guò)程。
應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒建立微生物數(shù)量快速檢測(cè)程序化的具體方法為1.標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線的制作在生物發(fā)光儀0.5mL檢測(cè)系統(tǒng)中，用ATP生物發(fā)光試劑盒進(jìn)行10-12～10-6mol/L系列標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度發(fā)光檢測(cè)，并做出對(duì)數(shù)曲線和線性回歸方程。檢測(cè)系統(tǒng)為0.1mL熒光素酶(FL)+0.1mL ATP+0.3mL發(fā)光檢測(cè)緩沖液，在發(fā)光儀上進(jìn)行系列標(biāo)準(zhǔn)ATP和用無(wú)菌水代替不加ATP的空白的發(fā)光脈沖值(CP6S或CPM值測(cè)量)，去除空白值的凈相對(duì)發(fā)光值(ΔCP6S或ΔCPM)在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)上做折線圖、趨勢(shì)線和回歸方程。
2.樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理包括非目標(biāo)ATP的去除，微生物細(xì)胞的分級(jí)過(guò)濾，樣品中干擾成份的去除，樣品稀釋或濃縮到適合ATP生物發(fā)光法的檢測(cè)范圍等，依樣品的形態(tài)、性質(zhì)和內(nèi)含物及檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)處理。非目標(biāo)ATP的去除聯(lián)合采用微孔濾膜和ATP去除劑的辦法，可以節(jié)省試劑。微生物細(xì)胞的分級(jí)過(guò)濾依樣品所含雜質(zhì)情況，先采用20μm大孔經(jīng)微孔濾膜去除雜質(zhì)，然后在真空條件下通過(guò)8μm、3μm、0.45μm和0.22μm的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾。樣品中干擾成份的去除可通過(guò)離心加無(wú)菌超純水洗滌方法或用微孔濾膜過(guò)濾的辦法進(jìn)行。對(duì)于含有防腐劑、消毒劑或臭氧的食品、飲料等樣品，需要較高的檢測(cè)靈敏度的時(shí)候可用與抗干擾培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)孵育以提高抗干擾能力和檢測(cè)靈敏度。樣品稀釋或濃縮可用無(wú)菌超純水稀釋?zhuān)瑵饪s可通過(guò)8000～12000r/min離心方法進(jìn)行，亦可用微孔濾膜分級(jí)過(guò)濾的辦法。
3.微生物細(xì)胞ATP的抽提將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品用微生物細(xì)胞ATP抽提劑Ec進(jìn)行ATP的提取，具體過(guò)程為Ec與液體樣品按1∶1比例加入后，室溫作用1.5～2.0min；濾膜上微生物細(xì)胞ATP提取則加入1～2ml Ec，室溫作用1.5～2.0min即可。其中ATP抽提劑Ec的制備方法為每升無(wú)菌超純水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
4.ATP生物發(fā)光測(cè)試取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL發(fā)光檢測(cè)緩沖液的發(fā)光管中，搖勻，加入ATP生物發(fā)光試劑0.1ml，搖勻后立即置發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，讀取發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)值CP6S或CPM，同時(shí)進(jìn)行空白樣品的對(duì)照測(cè)試。其中發(fā)光檢測(cè)緩沖液(GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2。ATP生物發(fā)光試劑按比例取熒光素酶100mL，加入酶保護(hù)劑10mL、含100mg D-熒光素的發(fā)光檢測(cè)緩沖液10mL，得到120mL的ATP生物發(fā)光試劑。
5.樣品中相應(yīng)微生物細(xì)胞ATP含量的計(jì)算ATP生物發(fā)光測(cè)試后的樣品發(fā)光值去除空白后的凈相對(duì)發(fā)光值取對(duì)數(shù)后，通過(guò)回歸方程(lg[ATP]＝A+Blg(ΔCP6S)或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，相關(guān)性R大于0.98為好，其中A和B為回歸方程的系數(shù))，計(jì)算樣品中相應(yīng)的ATP濃度。
6.樣品中細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞藻類(lèi)數(shù)量或以細(xì)菌計(jì)的微生物總數(shù)的計(jì)算根據(jù)本發(fā)明前期研究結(jié)果，細(xì)菌細(xì)胞的ATP含量為3×10-16g/cell；酵母菌的ATP含量為3×10-14g/cel；霉菌孢子的平均ATP含量為3×10-15g/cell；單細(xì)胞藻的ATP含量為3×10-14g/cell換算成細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞藻類(lèi)的細(xì)胞數(shù)，或只計(jì)相當(dāng)于細(xì)菌的總數(shù)量。
注式中505為ATP的分子量。

圖1在上海上立生物發(fā)光儀SHG-C和廣東環(huán)凱微生物科技公司研制的發(fā)光儀HKM-NRD(1)機(jī)上0.5mL系統(tǒng)中，檢測(cè)系統(tǒng)為0.1mL生物發(fā)光試劑(FL)+0.1mL標(biāo)準(zhǔn)ATP+0.3mL發(fā)光檢測(cè)緩沖液(GB)。橫坐標(biāo)為所加標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度(在10-12～10-6mol/L范圍)的Lg[ATP]，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的相對(duì)發(fā)光值的LgΔCP6S1。實(shí)施例1生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒的構(gòu)建(發(fā)光試劑為FL04113)(1)試劑的預(yù)先配制熒光素酶保護(hù)劑取500mg海藻糖、500mg PEG6000及15mg BSA，溶解于10mL無(wú)菌蒸餾水中，搖勻后通過(guò)0.22μm的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌即可。
標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液采用Sigma公司的二鈉鹽A-2383 55.1mg，溶解于10mL無(wú)菌餾水中，配成濃度為1×10-2mol/L，用1.5ml無(wú)菌離心管裝，每管0.1ml。
非細(xì)胞ATP去除劑AP其具體成份和制作過(guò)程是用含50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgS04，1mmol/L EDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為5mg/ml，并通過(guò)0.22μm的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾。
微生物細(xì)胞ATP提取液Ec每升無(wú)菌超純水中加入20g TritonX-100、2.0g CTAB、2.0gDMSO、0.05g EDTA、0.05g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
發(fā)光檢測(cè)緩沖液(簡(jiǎn)稱(chēng)GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/LDTT，pH7.2。
(2)生物發(fā)光試劑(FL04113)的配制取純化的熒光素酶100mL，加入酶保護(hù)劑10mL、含100mg D-熒光素的發(fā)光檢測(cè)緩沖液10mL，得到120mL溶液，分裝到60個(gè)小的棕色瓶中，每瓶2mL，凍干。
(3)生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒的構(gòu)建該檢測(cè)試劑盒包括生物發(fā)光試劑(FL04113)4瓶，每瓶2mL；0.1mL濃度為1×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液10管；無(wú)菌蒸餾水4瓶，每瓶25mL；發(fā)光檢測(cè)緩沖液4瓶，每瓶20mL；1瓶20mL微生物細(xì)胞ATP提取液Ec；1個(gè)棕色瓶裝非細(xì)胞ATP去除劑AP 5mL。
該試劑盒用于實(shí)施例2～6的檢測(cè)。
實(shí)施例2FL04113 ATP生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線在上海上立生物發(fā)光儀SHG-C和廣東凱微生物科技公司研制的發(fā)光儀HKM-NRD(1)機(jī)上0.5mL系統(tǒng)中，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍在10-12～10-6mol/L的ATP發(fā)光值，檢測(cè)系統(tǒng)為0.1mL FL+0.1mL標(biāo)準(zhǔn)ATP+0.3mL GB，并做出對(duì)數(shù)曲線和線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1和附圖1。
從表1可見(jiàn)在SHG-C發(fā)光儀上進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，當(dāng)ATP濃度在10-10～10-6mol/L時(shí)線性較好，在0.5mL發(fā)光系統(tǒng)中的回歸曲線為L(zhǎng)g[ATP]＝-12.4792+1.0374LgΔCPM，R＝0.9977，n＝5；在HKM-NRD(I)發(fā)光儀上，當(dāng)ATP濃度在10-10～10-6mol/L時(shí)線性較好，回歸曲線為L(zhǎng)g[ATP]＝-10.8382+0.9547LgΔCP6S1，R＝0.9951，n＝5。兩臺(tái)儀器上的檢測(cè)靈敏度均為10-10mol/L。
表1 FL041130在SHG-C和HKM-NRD(I)機(jī)上檢測(cè)的ATP的發(fā)光值
實(shí)施例3酵母人工樣品的發(fā)光檢測(cè)(SHG-C)(1)在SHG-C上的發(fā)光檢測(cè)在0.5mL系統(tǒng)中于SHG-C上進(jìn)行釀酒酵母樣品檢測(cè)，人工酵母樣平板培養(yǎng)結(jié)果為1.44×107cfu/mL(原液簡(jiǎn)為Y0)，檢測(cè)系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mL標(biāo)準(zhǔn)ATP或H2O樣+0.3mL GB，發(fā)光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 酵母人工樣品在SHG-C上發(fā)光檢測(cè)結(jié)果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明當(dāng)酵母菌樣的濃度在103cells/m～107cells/mL時(shí)，用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)較能反應(yīng)出真實(shí)的水平。
(2)在HKM-NRD(1)機(jī)上的發(fā)光檢測(cè)在0.5ml系統(tǒng)中于廣東環(huán)凱HKM-NRD(1)機(jī)上上進(jìn)行釀酒酵母人工樣品檢測(cè)，人工酵母樣平板培養(yǎng)結(jié)果為1.44×107cfu/mL(原液簡(jiǎn)為Y0)，檢測(cè)系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mL GB，發(fā)光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 酵母人工樣品在HKM-NRD(1)機(jī)上發(fā)光檢測(cè)結(jié)果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell計(jì)。
結(jié)果表明兩臺(tái)儀器的檢測(cè)結(jié)果比較接近，當(dāng)酵母菌樣的濃度在103cells/m～107cells/mL時(shí)，用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)較能反應(yīng)出真實(shí)的水平。
實(shí)施例4細(xì)菌人工樣品的發(fā)光檢測(cè)(SHG-C)在0.5ml系統(tǒng)中于SHG-C上進(jìn)行釀酒酵母樣品檢測(cè)，人工細(xì)菌樣品ATCC25922平板培養(yǎng)結(jié)果為6.4×108cfu/mL(原液簡(jiǎn)為Y0)，檢測(cè)系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mLGB，發(fā)光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 細(xì)菌人工樣品在SHG-C上發(fā)光檢測(cè)結(jié)果
注細(xì)菌的平均ATP含量為3×10-16g/cell，標(biāo)準(zhǔn)ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)微生物數(shù)量時(shí)，速度很快，具體的檢測(cè)過(guò)程只需十幾分鐘，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程和細(xì)菌的ATP含量換算關(guān)系，可以得出細(xì)胞數(shù)，在細(xì)菌細(xì)胞數(shù)為104cells/mL~108cells/mL，較能反應(yīng)出真實(shí)的水平。
實(shí)施例5霉菌人工樣品的ATP發(fā)光檢測(cè)在0.5mL系統(tǒng)中于SHG-C上進(jìn)行霉菌MIG3.95孢子人工樣品檢測(cè)，MIG3.95孢子數(shù)顯微計(jì)數(shù)值為9.45×107cfu/mL(原液簡(jiǎn)稱(chēng)M0)，檢測(cè)系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mL GB，ATP發(fā)光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。
表5 霉菌人工樣品的ATP發(fā)光測(cè)試結(jié)果
注霉菌孢子的平均ATP含量按3×10-16g/cell計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)霉菌孢子數(shù)時(shí)，當(dāng)孢子數(shù)在103～108cells/mL之間ATP生物發(fā)光法換算的結(jié)果和顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果差異不算大。
實(shí)施例6；瓶裝飲用水微生物數(shù)量的生物發(fā)光測(cè)定1、水樣1#天然泉水廠儲(chǔ)水池水、2#5加侖天然飲用泉水、3#5加侖飲用凈水、4#礦泉水水處理過(guò)錳沙前水(1#～4#樣品均由懷疑產(chǎn)品有藻類(lèi)污染的瓶裝飲用水廠家提供)、5#水庫(kù)水、6#天臺(tái)水池水。
2、水樣預(yù)處理參照常規(guī)取樣方法取飲用水樣100～1000mL(根據(jù)樣品的潔凈程度而定)，振搖使樣品分散均勻，然后抽真空分別通過(guò)8μm、3μm及0.45μm經(jīng)滅菌處理的微孔濾膜，并分別用50mL無(wú)菌去離子水洗滌過(guò)濾漏斗和微孔濾膜。
3.樣品ATP的提取濾膜截留細(xì)胞ATP的提取將抽濾樣品后的各種濾膜取下，分別置于50mL無(wú)菌小燒杯中，加入1mL無(wú)菌超純水，再加入1mL細(xì)胞ATP抽提液Ec，用槍頭輕輕吸打，作用1.5min。分別取1mL不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品取代1mL無(wú)菌去離子水做同樣處理作為標(biāo)準(zhǔn)樣；空白微孔濾膜做同樣處理作為空白樣。
4.發(fā)光測(cè)試在0.5ml系統(tǒng)中于SHG-C上進(jìn)行ATP生物發(fā)光測(cè)試。吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入0.3mL發(fā)光檢測(cè)緩沖液中，再加入0.1mL配制好的生物發(fā)光試劑(FL04113)，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)。同時(shí)作1×10-7mol/L ATP標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣的發(fā)光檢測(cè)。
5.樣品中ATP濃度計(jì)算依測(cè)試樣品的凈相對(duì)發(fā)光值ΔCP6S，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的ATP濃度。
6.樣品中相應(yīng)微生物細(xì)胞數(shù)計(jì)算在分級(jí)過(guò)濾的濾膜上截留的不同微生物細(xì)胞內(nèi)ATP含量后，根據(jù)不同細(xì)胞的ATP含量轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。
7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用8μm、3μm和0.45μm的濾膜對(duì)飲用水樣品進(jìn)行分級(jí)過(guò)濾，檢測(cè)濾膜截留ATP量換算成樣品中的微藻細(xì)胞數(shù)及細(xì)菌數(shù)(表5)。結(jié)果表明，樣品中的微藻主要由8μm的濾膜截留，3μm和0.45μm的濾膜截留的主要是細(xì)菌。從表5的檢測(cè)結(jié)果看，樣品在污染藻類(lèi)的同時(shí)，亦污染了細(xì)菌和真菌，提示水處理工藝或包裝材料的清洗消毒不完善。由于飲用水樣品中存在的對(duì)發(fā)光檢測(cè)造成干擾的物質(zhì)較少，用濾膜截留微生物細(xì)胞發(fā)光檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法較為相近，因此可以達(dá)到快速檢測(cè)飲用水中污染的微生物的目的，有利于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和產(chǎn)品分析。
表6 濾膜法截留飲用水中微藻和細(xì)菌分級(jí)檢測(cè)結(jié)果
注表中A表示換算成微藻細(xì)胞的數(shù)量，B表示換算成細(xì)菌的數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種微生物數(shù)量的生物發(fā)光法抗干擾快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括熒光素酶及其保護(hù)劑、D-熒光素、標(biāo)準(zhǔn)ATP、發(fā)光檢測(cè)緩沖液、非細(xì)胞ATP去除劑、微生物細(xì)胞ATP抽提劑。
2.一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于按比例取熒光素酶100mL，加酶保護(hù)劑10mL、含50～150mg D-熒光素的發(fā)光檢測(cè)緩沖液10mL，預(yù)先混合配制成ATP生物發(fā)光試劑。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒，其中熒光素酶須經(jīng)過(guò)純化，活力本底比達(dá)到50～500，在1mL發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的發(fā)光脈沖值CP6S不低于7000。
4.權(quán)利要求1或2所述的微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒，其中D-熒光素的發(fā)光活力須達(dá)到相當(dāng)于Sigma L9504的水平。
5.權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒，其中熒光素酶保護(hù)劑含50～75％海藻糖、10～15％ PEG6000和10～15％的BSA。
6.權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒，所用發(fā)光檢測(cè)緩沖液采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等緩沖鹽中的一種配制成濃度為25mmol/L、pH7.2的緩沖液。
7.權(quán)利要求6所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒，所用發(fā)光檢測(cè)緩沖液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、0.5mg/mL BSA、0.5mmol/L EDTA、0.5mmol/L DTT、pH7.2。
8.權(quán)利要求1所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒，非細(xì)胞ATP去除劑的配制方法為將含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mg/ml BSA、pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為0.1～10mg/mL。
9.權(quán)利要求1所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒，微生物細(xì)胞ATP去除劑含1～30g/LTritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨、0.1～3.0g/L二甲亞砜、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸、0.01～0.1g/L硫酸鎂。
10.權(quán)利要求1或2所述的一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于還含有抗防腐劑型、抗消毒劑型或抗臭氧型液體大樣檢測(cè)培養(yǎng)基中的一種或幾種抗干擾培養(yǎng)基。
11.利用權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行快速檢測(cè)的方法，按下述步驟進(jìn)行(1)標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線的制作在生物發(fā)光儀0.5mL系統(tǒng)中，進(jìn)行10-12～10-6mol/L系列標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度發(fā)光檢測(cè)，并做出對(duì)數(shù)曲線和線性回歸方程Lg[ATP]＝A+BLgΔCP6S或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，其中A和B為回歸方程的系數(shù)；(2)樣品的預(yù)處理依樣品的形態(tài)、性質(zhì)和內(nèi)含物及檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)樣品預(yù)處理包括非目標(biāo)ATP的去除、微生物細(xì)胞的分級(jí)過(guò)濾、樣品中干擾成份的去除、最后將樣品稀釋或濃縮到適合ATP生物發(fā)光法的檢測(cè)范圍等；(3)微生物細(xì)胞ATP的抽提將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品用微生物細(xì)胞ATP抽提劑Ec進(jìn)行ATP的提取，具體過(guò)程為Ec與液體樣品按1∶1比例加入后，室溫作用1.5～2.0min；濾膜上微生物細(xì)胞ATP提取則是將抽濾樣品后的各種濾膜取下，分別置于50mL無(wú)菌小燒杯中，加入1～2mL細(xì)胞ATP抽提液Ec，室溫作用1.5～2.0min；(4)ATP生物發(fā)光測(cè)試取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL發(fā)光檢測(cè)緩沖液的發(fā)光管中搖勻，再加入生物發(fā)光試劑0.1mL，搖勻后立即置發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，讀取發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)值CP6S或CPM，同時(shí)進(jìn)行1mL無(wú)菌去離子水空白樣品的對(duì)照測(cè)試。(5)樣品中相應(yīng)微生物細(xì)胞ATP含量的計(jì)算ATP生物發(fā)光測(cè)試后的樣品發(fā)光值去除空白后的凈相對(duì)發(fā)光值取對(duì)數(shù)后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中相應(yīng)的ATP濃度。(6)樣品中細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞藻類(lèi)數(shù)量或以細(xì)菌計(jì)的微生物總數(shù)的計(jì)算
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用ATP生物發(fā)光法進(jìn)行微生物數(shù)量快速檢測(cè)的方法及檢測(cè)試劑盒，快速檢測(cè)試劑盒包括熒光素酶及其保護(hù)劑、D－熒光素、標(biāo)準(zhǔn)ATP、發(fā)光檢測(cè)緩沖液、非細(xì)胞ATP去除劑、微生物細(xì)胞ATP抽提劑等試劑。應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行微生物數(shù)量快速測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法是通過(guò)在選定的生物發(fā)光儀和選定的系統(tǒng)中做ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，取對(duì)數(shù)后得到線性回歸方程，將經(jīng)過(guò)非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統(tǒng)中用同一批酶進(jìn)行ATP生物發(fā)光檢測(cè)，同時(shí)做空白對(duì)照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對(duì)發(fā)光值取對(duì)數(shù)后，通過(guò)建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據(jù)細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細(xì)菌、酵母、霉菌孢子或單細(xì)胞微藻的細(xì)胞數(shù)，或只計(jì)相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)量。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1876829SQ20061003438
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者吳清平, 吳慧清, 張菊梅, 李程思 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司