專利名稱：從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法。
背景技術：
聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在一些情況下，如電泳片段克隆測序，需要對電泳DNA片段進行回收。由于丙烯酰胺以C-C鍵聚合，因此聚合后很難解聚，不能像瓊脂糖膠一樣采用酶類使之解聚，從而利于DNA從膠中釋放；此外，聚丙烯酰胺凝膠即使在高溫下也不會熔化，因此也不能像低熔點瓊脂糖膠一樣采用較高溫度熔化，以利于DNA從膠中釋放。在常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，膠的濃度通常為6-10％，在這種濃度下，聚丙烯酰胺膠交聯(lián)所形成的膠格致密，同樣不利于DNA的釋放。
在一些文獻報道及實驗室具體操作中常用的方法是采用無菌槍頭搗碎膠，然后將膠放在低溫(4℃)下浸泡過夜，然后離心收集上清，以乙醇沉淀純化DNA。在這種方法中，采用無菌槍頭搗膠，即費時，膠的破碎度也不夠，因此DNA釋放量低，同時采用無菌槍頭搗膠是一件費事并且效率低的工作；此外，為了保證膠中DNA能夠最大程度釋放，需要浸泡過夜，為了保證微量的DNA能夠沉淀，乙醇沉淀的時間也要在30min以上。超長的操作時間，同時也是DNA降解的一個原因。因此，最終在大量時間耗費的情況下，也不能換來DNA回收量的提高。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有常規(guī)方法，操作時間長，DNA回收量低的缺點，提供一種從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法，該方法能夠在4小時內(nèi)從聚丙烯酰胺凝膠中回收目的片段DNA，所獲DNA量大，純度高，可用于后續(xù)的再擴增操作。
本發(fā)明的主要原理為在采用較高溫度、低滲并且聚丙烯酰胺凝膠充分破碎情況下，DNA釋放到溶液中的速度加快，釋放到溶液中的DNA轉(zhuǎn)入一種高鹽、低pH的環(huán)境中，在此環(huán)境下DNA可與硅膠膜特異吸附。在低濃度的緩沖液或水中DNA又從硅膠膜釋放，從而達到回收并純化目的。
本發(fā)明的一種從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法，依次包括以下步驟1)樣品清洗電泳后，在紫外燈下切下含DNA片段的膠條，膠條長0.6-1cm、寬1-3mm、厚0.75-1mm，放入1.5ml離心管中，以移液槍加入100-200μl ddH2O清洗膠條三次，完畢后，吸出清洗液；2)凝膠研磨以凝膠研磨棒研磨凝膠至成粉狀；3)凝膠浸泡取150-200μl以10-30mM三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、10-20mM乙二胺四乙酸(EDTA)組成的pH為8.0的TE緩沖液反復沖洗研磨棒，直至研磨棒不帶有凝膠；70℃水浴1.5-2.5hr，期間振蕩數(shù)次；4)凝膠去除8000-10000轉(zhuǎn)/分，離心2min吸取上清；5)DNA連接上清移入一支新的離心管，加入450-600μl成份為6-10M異硫腈酸胍(GuSCN)、100-300mM三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、pH值為5-6的DNA連接液，混合2min；6)DNA吸附將DNA硅膠吸附柱放置在離心管中，將混合液移入硅膠吸附柱，3000-6000轉(zhuǎn)/分離心0.5min，棄離心管中液體；7)DNA洗滌DNA硅膠吸附柱中加入成份為10-20mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷(Tris)，與無水乙醇1∶2-1∶4混合的DNA洗滌液500-800μl，以3000-6000轉(zhuǎn)/分，離心0.5min，棄離心管中液體；重復操作1-2次；將DNA硅膠吸附柱重新放入離心管中，空管8000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min.。
8)DNA洗脫將DNA硅膠吸附柱移入一支新的離心管中，DNA硅膠吸附柱底部中央加入30-60μl預熱至65℃的DNA洗脫液，成份為5-20mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷(Tris)或ddH2O；65℃水浴2min，6000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min；重新將離心收集的液體加入到DNA硅膠吸附柱底部中央；65℃水浴1min，6000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min；離心管中收集液體即為從聚丙烯凝膠中回收的DNA溶液，-20℃保存。
上述ddH2O用于沖洗膠條表面的雜質(zhì)和污染核酸；凝膠研磨棒為塑料小棒，底部可與1.5ml離心管致密吻合，商業(yè)購得，可滅菌反復使用；TE緩沖液用于浸泡凝膠，釋放DNA，并抑制DNAase活性；DNA連接液提供一種高鹽、低pH的環(huán)境，從而使DNA可以與硅膠膜結(jié)合；DNA洗滌液用于沖洗掉DNA以外的成分，在一定濃度的乙醇存在下，沖洗過程中，DNA不會溶失；DNA洗脫液用于溶解DNA。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果①DNA回收量大，純度高。②操作時間短，操作簡單。③不需要特殊設備，成本低廉。④可以制成試劑盒。⑤本發(fā)明也可用于瓊脂糖凝膠的DNA回收。
具體實施例方式
下列實例是進一步對本發(fā)明的說明，不應該當作對本發(fā)明的限制。
實施例1按以下程序從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA1)在紫外燈下切下含DNA片段的丙烯酰胺濃度為6％的膠條后(膠條長1cm，寬2mm，厚0.75mm)，放入1.5ml離心管中。
2)以移液槍加入150μl ddH2O清洗膠條三次，完畢后，吸出清洗液。
3)以凝膠研磨棒研磨凝膠至成粉狀。
4)加入150μl TE緩沖液，成分15mM Tris，10mM EDTA(pH8.0)。反復沖洗研磨棒，直至研磨棒不帶有凝膠。
5)70℃水浴2hr，期間振蕩數(shù)次。8000轉(zhuǎn)/分，離心2min，吸取上清。
6)上清移入一支新的離心管，加入450μl含6M GuSCN、200mM Tris，調(diào)整pH至6.0的DNA連接液，混合2min。
7)將DNA硅膠吸附柱放置在離心管中，將混合液移入吸附柱，3000轉(zhuǎn)/分離心0.5min，棄離心管中液體。
8)DNA硅膠吸附柱中加入500μl成份為10mM Tris (pH8.0)，與無水乙醇3∶7混合的DNA洗滌液。3000轉(zhuǎn)/分，離心0.5min。棄離心管中液體。重復操作2次。將DNA硅膠吸附柱重新放入離心管中，空管8000轉(zhuǎn)/分離心1min。
9)將DNA吸附柱移入一支新的離心管中，DNA硅膠吸附柱底部中央加入30μl預熱至65℃的成份為10mM Tris，pH8.0的DNA洗脫液。65℃水浴2min，6000轉(zhuǎn)/分離心1min。重新將離心收集的液體加入到DNA硅膠吸附柱底部中央。65℃水浴1min，8000轉(zhuǎn)/分離心1min。離心管中收集液體即為從聚丙烯凝膠中回收的DNA溶液，-20℃保存。
此例在3hr內(nèi)，從膠中回收約800ng(納克)的DNA，OD260/OD280為1.8，滿足后續(xù)PCR再擴增要求。(OD260/OD280這個比值是用來表示DNA的純度)實施例2按以下程序從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA1)紫外燈下切下含DNA片段的丙烯酰胺濃度為8％的膠條后(膠條長0.8cm，寬1.5mm，厚1mm)后，放入1.5ml離心管中。
2)以移液槍加入200μl ddH2O(滅菌)清洗膠條三次，完畢后，吸出清洗液。
3)以凝膠研磨棒研磨凝膠至成粉狀。
4)加入200μl成分為20mM Tris，15mM EDTA(pH8.0)TE緩沖液，反復沖洗研磨棒，直至研磨棒不帶有凝膠。
5)70℃水浴2hr，期間振蕩數(shù)次。10000轉(zhuǎn)/分，離心2min，吸取上清。
上清移入一支新的離心管，加入600μl成份為8M GuSCN，300mM Tris，調(diào)整pH至5.8的DNA聯(lián)接液，混合2min。
6)NA吸附將DNA硅膠吸附柱放置在離心管中，將混合液移入硅膠吸附柱，5000轉(zhuǎn)/分離心0.5min，棄離心管中液體。
7)DNA洗滌DNA硅膠吸附柱中加入成份為15mM Tris(pH8.0)，與無水乙醇3∶7混合的DNA洗滌液800μl，4000轉(zhuǎn)/分，離心0.5min。棄離心管中液體。重復操作2次。將DNA硅膠吸附柱重新放入離心管中，空管9000轉(zhuǎn)/分離心1min。
8)DNA洗脫將DNA硅膠吸附柱移入一支新的離心管中，DNA硅膠吸附柱底部中央加入60μl預熱至65℃的DNA洗脫液15mM Tris(pH8.0)。65℃水浴2min，7000轉(zhuǎn)/分離心1min。重新將離心收集的液體加入到DNA硅膠吸附柱底部中央。65℃水浴1min，9000轉(zhuǎn)/分離心1min。離心管中收集液體即為回收的DNA溶液，-20℃保存。
此例在3hr內(nèi)，從膠中回收約720ng(納克)的DNA，OD260/OD280為1.8，滿足后述續(xù)PCR再擴增要求。
權利要求
1.一種從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法，依次包括以下步驟1)樣品清洗電泳后，在紫外燈下切下含DNA片段的膠條，膠條長0.6-1cm、寬1-3mm、厚0.75-1mm，放入1.5ml離心管中，以移液槍加入100-200μl ddH2O清洗膠條三次，完畢后，吸出清洗液；2)凝膠研磨以凝膠研磨棒研磨凝膠至成粉狀；3)凝膠浸泡取150-200μl以10-30mM三羥基甲基氨基甲烷、10-20mM乙二胺四乙酸組成的pH為8.0的TE緩沖液反復沖洗研磨棒，直至研磨棒不帶有凝膠；70℃水浴1.5-2.5hr，期間振蕩數(shù)次；4)凝膠去除8000-10000轉(zhuǎn)/分，離心2min吸取上清；5)DNA連接上清移入一支新的離心管，加入450-600μl成份為6-10M異硫腈酸胍、100-300mM三羥基甲基氨基甲烷、pH值為5-6的DNA連接液，混合2min；6)DNA吸附將DNA硅膠吸附柱放置在離心管中，將混合液移入硅膠吸附柱，3000-6000轉(zhuǎn)/分離心0.5min，棄離心管中液體；7)DNA洗滌DNA硅膠吸附柱中加入成份為10-20mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷(Tris)，與無水乙醇1∶2-1∶4混合的DNA洗滌液500-800μl，以3000-6000轉(zhuǎn)/分，離心0.5min，棄離心管中液體；重復操作1-2次；將DNA硅膠吸附柱重新放入離心管中，空管8000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min.。8)DNA洗脫將DNA硅膠吸附柱移入一支新的離心管中，DNA硅膠吸附柱底部中央加入30-60μl預熱至65℃的DNA洗脫液，成份為5-20mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷(Tris)或ddH2O；65℃水浴2min，6000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min；重新將離心收集的液體加入到DNA硅膠吸附柱底部中央；65℃水浴1min，6000-9000轉(zhuǎn)/分離心1min；離心管中收集液體即為從聚丙烯凝膠中回收的DNA溶液，-20℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從電泳后的聚丙烯酰胺膠中回收DNA的方法，它依次包括以下步驟用dH
文檔編號C12N15/10GK1935997SQ20061003735
公開日2007年3月28日 申請日期2006年8月29日 優(yōu)先權日2006年8月29日
發(fā)明者羅鵬, 胡超群, 任春華, 王青柏 申請人:中國科學院南海海洋研究所