專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用等溫分支擴(kuò)增(Isothermal Ramification Amplification，簡(jiǎn)稱(chēng)RAM)方法檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的試劑盒，進(jìn)一步涉及使用該種試劑盒快速檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)海水養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)，1993年我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦病害的暴發(fā)性流行，給整個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，相關(guān)的對(duì)蝦加工和外貿(mào)出口等行業(yè)也受到嚴(yán)重影響。近幾年來(lái)，我國(guó)引進(jìn)了原產(chǎn)于南美洲的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusv vannamei，俗稱(chēng)南美白對(duì)蝦)和細(xì)角濱對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris，俗稱(chēng)藍(lán)對(duì)蝦)等新的對(duì)蝦品種進(jìn)行養(yǎng)殖，特別是凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖取得了顯著的成功，促進(jìn)了我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的迅速回升。
傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic NecrosisVirus，簡(jiǎn)寫(xiě)IHHNV)，又稱(chēng)瘦小——畸形綜合癥病毒(Runt-deformity syndrome virus)，是1981年首次在夏威夷養(yǎng)殖的細(xì)角濱對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)的對(duì)蝦病毒。該病毒主要感染細(xì)角濱對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦，造成細(xì)角濱對(duì)蝦幼體和仔蝦高達(dá)80％的累積死亡率和引起凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢和畸形，使凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖嚴(yán)重減產(chǎn)，造成10-50％的經(jīng)濟(jì)損失。IHHNV是一種單鏈DNA病毒，根據(jù)其基因組的特點(diǎn)和國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)2002年發(fā)布的分類(lèi)系統(tǒng)，該病毒歸屬細(xì)小病毒科(Parvoviridae)的短濃核病毒屬(Brevidensovirus)。IHHNV在美洲地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦和細(xì)角濱對(duì)蝦中廣泛傳播，目前尚未發(fā)現(xiàn)不同的毒株和變異株。隨著我國(guó)引進(jìn)這兩種對(duì)蝦進(jìn)行人工養(yǎng)殖，該病毒也傳到我國(guó)，對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
以往檢測(cè)對(duì)蝦IHHNV主要有三種辦法1.電鏡法，該法成本高，費(fèi)時(shí)，靈敏度低，不適宜現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；2.基因探針?lè)?，該法成本高，操作?fù)雜；3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高且成本低的用等溫分支擴(kuò)增方法檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，特別是提供一對(duì)檢測(cè)傳染性皮下及造血組織壞死病毒的標(biāo)記探針，并提供一種使用試劑盒快速檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的方法，從而為對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計(jì)的C-探針(由三個(gè)特殊的區(qū)域組成即兩個(gè)與靶基因互補(bǔ)的序列位于5’和3’末端，中間為通用的連接區(qū)域)和捕獲探針與靶基因雜交，用磁珠捕獲雜合體；(2)洗滌未雜交的探針；(3)用連接酶將C-探針的5’和3’端連接成閉合環(huán)狀；(4)在等溫條件下，通過(guò)引物的延伸、置換和擴(kuò)增使C-探針呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的分支復(fù)合物，獲得各種長(zhǎng)度的萬(wàn)能表雙鏈DNA，通過(guò)熒光染料來(lái)觀察擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明涉及的用等溫分支擴(kuò)增方法檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其試劑包括
(1)DNA提取試劑含組織裂解液A和DNA吸附液B，組織裂解液A含有4M異硫氰酸胍(GTC)、25mM檸檬酸鈉、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1M的β-巰基乙醇；DNA吸附液B為50％磁珠(Golden Beads)懸浮液；(2)雜交液C雜交液C含有2M異硫氰酸胍(GTC)、0.5％牛血清白蛋白(BSA)、80mM乙二胺四乙酸(EDTA)、400mM pH7.5的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、0.5％十二烷基肌氨酸鈉、2-10nM IHHNV-C-探針和20-100nM IHHNV-捕獲探針；(3)探針捕獲試劑包括磁珠D和探針捕獲液E，磁珠D是濃度為4mg/ml的鏈親和素(SAV)免疫磁珠；探針捕獲液E含有10mM pH7.5的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1-2MNaCl(氯化鈉)；(4)洗滌液F含有10mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；(5)連接液G含有10-20活性單位(U)的Taq DNA連接酶和1×連接酶(ligase)緩沖液，1×連接酶(ligase)緩沖液含有20mM pH7.6的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、25mMKAcO(醋酸鉀)、10mMMgAcO(醋酸鎂)、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、1mM二氫尿嘧啶脫氫酶(NAD)和0.1％曲拉通X-100(Triton X-100)；(6)等溫分支擴(kuò)增(RAM)反應(yīng)液H含有5-15U Bst DNA聚合酶、10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、200-1000uMdNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、0.8-1.5uM正向引物Prime-1、0.8-1.5uM反向引物Prime-2和50-200ng(納克)T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 Gene 32Protein)；10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mMKCl(氯化鉀)、100mM(NH4)2SO4(硫酸銨)、20mM MgSO4(硫酸鎂)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；(7)顯色劑I為1％的熒光染料SYBR GREEN I(進(jìn)口材料，只有英文名稱(chēng))其中雜交液C中的IHHNV-C-探針序列為5’-磷酸-CAGCAAAGGTAACTCCCAAATAGGCGATGTCTGTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCGTAGTCGCTTCAGCTTCGGCTCTGG雜交液C中的IHHNV-捕獲探針序列為5’-生物素-AAGATACGAAAGCCGTTCAATACCGTATCTGATAAGATAGAGTAT等溫分支擴(kuò)增(RAM)反應(yīng)液H中的正向引物Prime-1序列為5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT等溫分支擴(kuò)增(RAM)反應(yīng)液H中的反向引物Prime-2序列為5’-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC。
上面所述等溫分支擴(kuò)增(RAM)反應(yīng)液H每管50ul的最佳組成為5.0ul 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、6.0ul 2.5mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、2.5ul 20uM正向引物Prime-1、2.5ul 20uM反向引物Prime-2、0.8ul 8U/ul Bst DNA聚合酶、2ul 100ng/ul T4 Gene32 Protein和31.2ul ddH2O(滅菌雙蒸水)。
使用上述對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IHHNV的方法，依次包括下列步驟(1)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA的提取A.取待檢樣品組織25-30mg于1.5ml離心管中，加入200ul組織裂解液A，搗爛；B.用臺(tái)式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取上清液，置于1.5ml離心管中；C.加入15ul DNA吸附液B(內(nèi)含白色物質(zhì)，用前充分搖勻)，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D.10000轉(zhuǎn)/分離心15秒，用移液器吸去上清液，加入200ul 70％乙醇，用移液器槍頭輕輕搖動(dòng)，使沉淀充分懸浮起來(lái)；E.10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，用移液器吸去上清液，將沉淀放入恒溫金屬浴上60℃烘3分鐘，離心管蓋打開(kāi)；F.加入20ulddH2O，充分搖勻，10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，上清液為待檢樣品病毒DNA；(2)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增A.在0.5ml離心管中加入80ul雜交液C和1ul待檢樣品病毒DNA，于恒溫金屬浴上60℃放置1小時(shí)；B.加入5ul磁珠D和80ul探針捕獲液E，混勻，室溫放置20分鐘；C.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液，并用洗滌液F洗兩次，每次200ul；D.在洗滌好的磁珠上加入20ul連接液G，于恒溫金屬浴上60℃放置20分鐘；E.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液；F.加入50ul RAM反應(yīng)液H，于恒溫金屬浴上65℃放置45分鐘；(3)顯色檢測(cè)將反應(yīng)完的離心管放到磁力分離架上，用移液器吸取25ul上清液，置于0.5ml的離心管中，加入1ul顯色劑I，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不攜帶IHHNV病毒，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品攜帶IHHNV病毒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是建立了IHHNV的等溫分支擴(kuò)增的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，本試劑盒根據(jù)IHHNV的基因保守區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白2的DNA序列設(shè)計(jì)了特異性的探針，以保證檢測(cè)不同來(lái)源IHHNV株的可靠性。該技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需價(jià)廉的恒溫金屬浴(價(jià)格僅為PCR儀的5-10％)或恒溫水浴即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，可直接使用熒光染料，通過(guò)肉眼觀察來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，簡(jiǎn)單而快速?？蓮V泛用于科研，特別是養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的IHHNV的檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)例是進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。
按下列配方制作對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒組織裂解液A4MGTC、25mM檸檬酸鈉、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1Mβ-巰基乙醇DNA吸附液B50％Golden Beads懸浮液雜交液C2M GTC、0.5％BSA、80mM EDTA、400mM pH7.5的Tris-HCl、0.5％十二烷基肌氨酸鈉、2.5nM IHHNV-C-探針和25nM IHHNV-捕獲探針磁珠D4mg/ml的SAV免疫磁珠探針捕獲液E10mM pH7.5的Tris-HCl、1mM EDTA和2M NaCl洗滌液F10mM pH8.0的Tris-HCl和1mM EDTA連接液G20ul 1×ligase緩沖液和0.25ul Taq DNA連接酶(40U/ul)RAM反應(yīng)液H6ul 2.5mM dNTP、5ul 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、2.5ul 20uM正向引物Prime-1、2.5ul 20uM反向引物Prime-2、0.8ul 8U/ul Bst DNA聚合酶、2ul 100ng/ul T4 Gene32 Protein和31.2ul ddH2O(滅菌雙蒸水)。
顯色劑I1％的SYBR GREEN I按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA的提取A.取待檢樣品組織25-30mg于1.5ml離心管中，加入200ul組織裂解液A，搗爛；B.用臺(tái)式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取上清液，置于1.5ml離心管中；C.加入15ul DNA吸附液B(內(nèi)含白色物質(zhì)，用前充分搖勻)，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D.10000轉(zhuǎn)/分離心15秒，用移液器吸去上清液，加入200ul 70％乙醇，用移液器槍頭輕輕搖動(dòng)，使沉淀充分懸浮起來(lái)；E.10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，用移液器吸去上清液。將沉淀放入恒溫金屬浴上60℃烘3分鐘(離心管蓋打開(kāi))；F.加入20ulddH2O，充分搖勻，10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，上清液為待檢樣品病毒DNA。
(2)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增A.在0.5ml離心管中加入80ul雜交液C和1ul待檢樣品病毒DNA，于恒溫金屬浴上60℃放置1小時(shí)；B.加入5ul磁珠D和80ul探針捕獲液E，混勻，室溫放置20分鐘；C.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液，并用洗滌液F洗兩次，每次200ul；D.在洗滌好的磁珠上加入20ul連接液G，于恒溫金屬浴上60℃放置20分鐘；E.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液；F.加入50ul RAM反應(yīng)液H，于恒溫金屬浴上65℃放置45分鐘(3)顯色檢測(cè)將反應(yīng)完的離心管放到磁力分離架上，用移液器吸取25ul上清液，置于0.5ml的離心管中，加入1ul顯色劑I，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不攜帶IHHNV病毒，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品攜帶IHHNV病毒。
權(quán)利要求
1.一種用等溫分支擴(kuò)增方法檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其試劑包括(1)DNA提取試劑含組織裂解液A和DNA吸附液B，組織裂解液A含有4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1M的β-巰基乙醇；DNA吸附液B為50％磁珠懸浮液；(2)雜交液C雜交液C含有2M異硫氰酸胍、0.5％牛血清白蛋白、80mM乙二胺四乙酸、400mM pH7.5的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、0.5％十二烷基肌氨酸鈉、2-10nM IHHNV-C-探針和20-100nMIHHNV-捕獲探針；(3)探針捕獲試劑包括磁珠D和探針捕獲液E，磁珠D是濃度為4mg/ml的鏈親和素免疫磁珠；探針捕獲液E含有10mM pH7.5的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、1mM乙二胺四乙酸和1-2MNaCl；(4)洗滌液F含有10mM pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸和1mM乙二胺四乙酸；(5)連接液G含有10-20活性單位的Taq DNA連接酶和1×連接酶緩沖液，1×連接酶緩沖液含有20mM pH7.6的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、25mMKAcO、10mMMgAcO、10mM二硫蘇糖醇、1mM二氫尿嘧啶脫氫酶和0.1％曲拉通X-100；(6)等溫分支擴(kuò)增反應(yīng)液H含有5-15UBstDNA聚合酶、10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、200-1000uMdNTP、0.8-1.5uM正向引物Prime-1、0.8-1.5uM反向引物Prime-2和50-200ng T4噬菌體基因32編碼蛋白；10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mMKCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％曲拉通X-100；(7)顯色劑I為1％的熒光染料SYBR GREEN I；其中雜交液C中的IHHNV-C-探針序列為5’-磷酸-CAGCAAAGGTAACTCCCAAATAGGCGATGTCTGTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCGTAGTCGCTTCAGCTTCGGCTCTGG；雜交液C中的IHHNV-捕獲探針序列為5’-生物素-AAGATACGAAAGCCGTTCAATACCGTATCTGATAAGATAGAGTAT；等溫分支擴(kuò)增反應(yīng)液H中的正向引物Prime-1序列為5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT；等溫分支擴(kuò)增反應(yīng)液H中的反向引物Prime-2序列為5’-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的試劑盒，其特征是等溫分支擴(kuò)增反應(yīng)液H每管50ul的組成為5.0ul 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、6.0ul 2.5mM dNTP、2.5ul 20uM正向引物Prime-1、2.5ul 20uM反向引物Prime-2、0.8ul 8U/ul Bst DNA聚合酶、2ul 100ng/ul T4 Gene 32Protein和31.2ul ddH2O。
3.一種使用權(quán)利要求1對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IHHNV的方法，依次包括下列步驟(1)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA的提取A.取待檢樣品組織25-30mg于1.5ml離心管中，加入200ul組織裂解液A，搗爛；B.用臺(tái)式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取上清液，置于1.5ml離心管中；C.加入15ul DNA吸附液B，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D.10000轉(zhuǎn)/分離心15秒，用移液器吸去上清液，加入200ul 70％乙醇，用移液器槍頭輕輕搖動(dòng)，使沉淀充分懸浮起來(lái)；E.10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，用移液器吸去上清液，將沉淀放入恒溫金屬浴上60℃烘3分鐘，離心管蓋打開(kāi)；F.加入20ulddH2O，充分搖勻，10000轉(zhuǎn)/分離心30秒，上清液為待檢樣品病毒DNA；(2)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的等溫分支擴(kuò)增A.在0.5ml離心管中加入80ul雜交液C和1ul待檢樣品病毒DNA，于恒溫金屬浴上60℃放置1小時(shí)；B.加入5ul磁珠D和80ul探針捕獲液E，混勻，室溫放置20分鐘；C.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液，并用洗滌液F洗兩次，每次200ul；D.在洗滌好的磁珠上加入20ul連接液G，于恒溫金屬浴上60℃放置20分鐘；E.將離心管放到磁力分離架上，用移液器吸去上清液；F.加入50ul RAM反應(yīng)液H，于恒溫金屬浴上65℃放置45分鐘；(3)顯色檢測(cè)將反應(yīng)完的離心管放到磁力分離架上，用移液器吸取25ul上清液，置于0.5ml的離心管中，加入1ul顯色劑I，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不攜帶IHHNV病毒，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品攜帶IHHNV。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用等溫分支擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的試劑盒，它包括DNA提取試劑、雜交液C、探針捕獲試劑、洗滌液F、連接液G、等溫分支擴(kuò)增反應(yīng)液H、顯色劑I；特別是提供一對(duì)檢測(cè)傳染性皮下及造血組織壞死病毒的標(biāo)記探針。進(jìn)一步提供一種使用試劑盒檢測(cè)IHHNV的方法。本發(fā)明特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需價(jià)廉的恒溫金屬浴(價(jià)格僅為PCR儀的5－10％)或恒溫水浴即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，可直接使用熒光染料，通過(guò)肉眼觀察來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，簡(jiǎn)單而快速?？蓮V泛用于科研，特別是養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的IHHNV的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1936550SQ20061003735
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月29日
發(fā)明者任春華, 胡超群, 沈琪 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所