專(zhuān)利名稱(chēng)：一種泡菜用乳酸菌的高密度培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種泡菜用乳酸菌的高密度培養(yǎng)方法，具體是指采用含有緩沖鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)程中流加氨水保持培養(yǎng)液pH值穩(wěn)定，培養(yǎng)后期補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的方法，促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)泡菜用乳酸菌的高密度培養(yǎng)；該方法得到的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心，加入復(fù)合保護(hù)劑真空冷凍干燥得到乳酸菌凍干粉。
背景技術(shù)：
高密度培養(yǎng)技術(shù)一般指在液體培養(yǎng)中的細(xì)胞密度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的培養(yǎng)技術(shù)，達(dá)到提高菌體富集培養(yǎng)的目的。不僅可減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
由于乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷地產(chǎn)生代謝產(chǎn)物—乳酸，導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值不斷下降，從而抑制乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖。熊曉輝等在《中國(guó)調(diào)味品》2004年第5期發(fā)表的“乳酸菌發(fā)酵劑高密度培養(yǎng)的研究”論文中采用緩沖鹽法，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加緩沖鹽，一定程度上阻止了培養(yǎng)液的pH值的變化，但培養(yǎng)后期，由于產(chǎn)生乳酸過(guò)多，仍無(wú)法維持乳酸菌正常生長(zhǎng)所需的pH值。李斌等在《食品科技》2005年第1期發(fā)表的“泡菜用乳酸菌富集培養(yǎng)的研究”論文中采用化學(xué)中和法，即在乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中自動(dòng)向培養(yǎng)液中流加氨水，不斷中和乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，促進(jìn)乳酸菌的大量繁殖。但由于培養(yǎng)過(guò)程中乳酸鹽不斷積累，達(dá)到一定濃度時(shí)，仍會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。因而，現(xiàn)有技術(shù)限制了泡菜用乳酸菌的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
真空冷凍干燥技術(shù)是保存生物材料最有效的方法之一。但真空冷凍干燥過(guò)程中，冷凍和干燥兩個(gè)步驟都可能會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化。如果凍干工藝中保護(hù)劑選擇不當(dāng)，微生物的存活率和發(fā)酵活力將嚴(yán)重下降。賀稚非等在《四川食品與發(fā)酵》2005年第1期發(fā)表的“橄欖菜直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究”論文中選用甘油作保護(hù)劑，凍干后活菌存活率為50％。單一的保護(hù)劑并不能滿(mǎn)足冷凍干燥的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種泡菜用乳酸菌的培養(yǎng)方法。該高密度培養(yǎng)新方法，既能保證乳酸菌的活性，又能大量富集該乳酸菌。同時(shí)，還可以通過(guò)添加獨(dú)特的復(fù)合保護(hù)劑，利用冷凍干燥技術(shù)制備高活性乳酸菌凍干粉。
為了達(dá)到以上發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是主要是采用常規(guī)植物乳酸菌為菌種，經(jīng)常規(guī)方法活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于按常規(guī)配方配置的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于將發(fā)酵培養(yǎng)基用含0.2％～0.3％檸檬酸鈉、0.2％～0.3％磷酸氫二鈉、0.1％～0.2％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.3～6.6；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在5.8～6.2；菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加500ml～700ml新鮮培養(yǎng)基；菌液培養(yǎng)結(jié)束后離心，加入由10％～15％脫脂乳、5％～7％谷氨酸鈉、2％～3％甘油和7％～8％麥芽糖組成的復(fù)合保護(hù)劑，真空冷凍干燥。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法高效可靠，培養(yǎng)液乳酸菌活菌體含量高。由于在乳酸菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，乳酸菌會(huì)不斷產(chǎn)生代謝產(chǎn)物一乳酸，乳酸的積累對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用；同時(shí)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物的減少也延緩了乳酸菌細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明在乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)添加緩沖鹽、調(diào)節(jié)pH值、追加營(yíng)養(yǎng)物等措施，延長(zhǎng)乳酸菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得了高密度的細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明通過(guò)添加復(fù)合保護(hù)劑克服了真空冷凍干燥過(guò)程中造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子鈍化等問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1(1)種子培養(yǎng)挑取菌苔接入50ml MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫801mL，MgSO4·7H2O0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，pH6.2～6.4，下同)中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，然后以5％的接種量轉(zhuǎn)入210ml含2％植物蛋白粉的番茄汁培養(yǎng)基(番茄汁濃度以100ml番茄汁含2g還原糖為標(biāo)準(zhǔn)，下同)，在37℃下靜置培養(yǎng)18h，即得種子液。
(2)接種前準(zhǔn)備及接種過(guò)程將植物蛋白粉溶于3升番茄汁，采用0.2％檸檬酸鈉、0.2％磷酸氫二鈉、0.2％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.3左右，倒入5L發(fā)酵罐中；發(fā)酵罐罐體放入高壓滅菌鍋中滅菌；發(fā)酵罐冷卻至室溫，在酒精火焰圈上方，將種子液以7％的接種量接種到發(fā)酵罐中，以普通氮?dú)獗３止迚簽?.05MPa，攪拌常溫發(fā)酵。
(3)流加堿當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液低于6.0時(shí)，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在6.0±0.1。
(4)補(bǔ)料菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加500ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h。
(5)凍干粉的制備培養(yǎng)液在10℃下，以4000r/min離心25min；棄上清液，沉淀部分加入無(wú)菌生理鹽水振蕩洗滌，按上述條件再次離心。棄上清液，沉淀部分加入復(fù)合保護(hù)劑(脫脂乳10％、谷氨酸鈉5％、甘油3％和麥芽糖7％)振蕩均勻，置于-70℃預(yù)凍2h后，再置入真空冷凍干燥機(jī)。凍干條件為真空度5Pa，隔板加熱溫度20℃，冷阱溫度-55℃，凍干28h～30h，即得泡菜用乳酸菌凍干粉。
實(shí)例2(1)種子培養(yǎng)挑取菌苔接入50ml MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，然后以5％的接種量轉(zhuǎn)入210ml含2％植物蛋白粉的番茄汁培養(yǎng)基，在37℃下靜置培養(yǎng)18h，即得種子液。
(2)接種前準(zhǔn)備及接種過(guò)程將植物蛋白粉溶于3升番茄汁，0.3％檸檬酸鈉、0.3％磷酸氫二鈉、0.2％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.5左右，倒入5L發(fā)酵罐中；發(fā)酵罐罐體放入高壓滅菌鍋中滅菌；發(fā)酵罐冷卻至室溫，在酒精火焰圈上方，將種子液以7％的接種量接種到發(fā)酵罐中，以普通氮?dú)獗３止迚簽?.05MPa，攪拌常溫發(fā)酵。
(3)流加堿當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液低于5.9時(shí)，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在5.9±0.1。
(4)補(bǔ)料菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加600ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7h。
(5)凍干粉的制備培養(yǎng)液在8℃下，以4500r/min離心20min；棄上清液，沉淀部分加入無(wú)菌生理鹽水振蕩洗滌，按上述條件再次離心。棄上清液，沉淀部分加入復(fù)合保護(hù)劑(脫脂乳15％、谷氨酸鈉6％、甘油2％和麥芽糖8％)振蕩均勻，置于-70℃預(yù)凍2h后，再置入真空冷凍干燥機(jī)。凍干條件為真空度5Pa，隔板加熱溫度20℃，冷阱溫度-55℃，凍干28h～30h，即得泡菜用乳酸菌凍干粉。
實(shí)例3(1)種子培養(yǎng)挑取菌苔接入50ml MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，然后以5％的接種量轉(zhuǎn)入210ml含2％植物蛋白粉的番茄汁培養(yǎng)基，在37℃下靜置培養(yǎng)18h，即得種子液。
(2)種前準(zhǔn)備及接種過(guò)程將植物蛋白粉溶于3升番茄汁，0.3％檸檬酸鈉、0.3％磷酸氫二鈉、0.1％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.6左右，倒入5L發(fā)酵罐中；發(fā)酵罐罐體放入高壓滅菌鍋中滅菌；發(fā)酵罐冷卻至室溫，在酒精火焰圈上方，將種子液以7％的接種量接種到發(fā)酵罐中，以普通氮?dú)獗３止迚簽?.05MPa，攪拌常溫發(fā)酵。
(3)流加堿當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液低于6.1時(shí)，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在6.1±0.1。
(4)補(bǔ)料菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加700ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h。
(5)凍干粉的制備培養(yǎng)液在6℃下，以5000r/min離心15min；棄上清液，沉淀部分加入無(wú)菌生理鹽水振蕩洗滌，按上述條件再次離心。棄上清液，沉淀部分加入復(fù)合保護(hù)劑(脫脂乳12％、谷氨酸鈉7％、甘油2％和麥芽糖7％)振蕩均勻，置于-70℃預(yù)凍2h后，再置入真空冷凍干燥機(jī)。凍干條件為真空度5Pa，隔板加熱溫度20℃，冷阱溫度-55℃，凍干28h～30h，即得泡菜用乳酸菌凍干粉。
權(quán)利要求
1.一種泡菜用乳酸菌的高密度培養(yǎng)方法，采用常規(guī)植物乳酸菌為菌種，經(jīng)常規(guī)方法活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于按常規(guī)配方配置的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于將發(fā)酵培養(yǎng)基用含0.2％～0.3％檸檬酸鈉、0.2％～0.3％磷酸氫二鈉、0.1％～0.2％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.3～6.6；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在5.8～6.2；菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加500ml～700ml新鮮培養(yǎng)基；菌液培養(yǎng)結(jié)束后離心，加入由10％～15％脫脂乳、5％～7％谷氨酸鈉、2％～3％甘油和7％～8％麥芽糖組成的復(fù)合保護(hù)劑，真空冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種泡菜用乳酸菌的高密度培養(yǎng)方法，具體是指主要是采用常規(guī)植物乳酸菌為菌種，經(jīng)常規(guī)方法活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于按常規(guī)配方配置的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于將發(fā)酵培養(yǎng)基用含0.2％～0.3％檸檬酸鈉、0.2％～0.3％磷酸氫二鈉、0.1％～0.2％磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6.3～6.6；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，流加氨水以保持pH值穩(wěn)定在5.8～6.2；菌液培養(yǎng)20h后，補(bǔ)加500ml～700ml新鮮培養(yǎng)基；菌液培養(yǎng)結(jié)束后離心，加入由10％～15％脫脂乳、5％～7％谷氨酸鈉、2％～3％甘油和7％～8％麥芽糖組成的復(fù)合保護(hù)劑，真空冷凍干燥。其培養(yǎng)方法高效可靠，培養(yǎng)液乳酸菌活菌體含量高。且克服了真空冷凍干燥過(guò)程中造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡等問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12R1/225GK1844362SQ200610039750
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者董英, 孫樂(lè)六, 王文兵, 崔恒林, 張紅印 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)