專利名稱：人谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法及其該酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的純化及其新用途，具體涉及采用重組蛋白純化技術(shù)純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的方法及該酶在藥物治療炎癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1985年，Coris首先提出全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammationresponse syndrome，SIRS)是由不同疾病，包括微生物感染、創(chuàng)傷、燒傷等感染性疾病所引起的全身性的非特異性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體對炎癥反應(yīng)的失控。根據(jù)臨床表現(xiàn)分為全身感染或膿毒癥、敗血癥綜合征、早期感染性休克、難治性感染性休克、多器官功能障礙綜合征以及死亡6期。最近的臨床資料表明，革蘭氏桿菌所致全身炎癥反應(yīng)綜合征的主要死亡原因是內(nèi)毒素的作用。
SIRS是一動態(tài)發(fā)展、連續(xù)的過程，治療得當(dāng)可使病情早期得到控制，避免其進(jìn)一步發(fā)展。目前臨床治療措施有1、抗介質(zhì)制劑治療。目前國外已將包括單克隆腫瘤壞死因子(TNF-α)抗體、重組人類白介素-1受體拮抗劑、TNF受體、內(nèi)毒素單克隆抗體等抗炎介質(zhì)應(yīng)用于臨床。2、CRRT治療。通過體外循環(huán)清除血液中的代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性抗體、異常血漿成分及蓄積體內(nèi)的藥物或毒物。3、核因子-κB(NF-κB)抑制劑治療。NF-κB抑制劑有糖皮質(zhì)激素、IL-10等，糖皮質(zhì)激素通過活化的糖皮質(zhì)激素受體與調(diào)節(jié)它們表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子結(jié)合而抑制炎癥基因的表達(dá)；而IL-10可抑制與輔助T淋巴細(xì)胞1(Th1)反應(yīng)相關(guān)的許多細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。4、基因治療。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)制成病毒疫苗傳遞某些必要的基因，可對抗過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，現(xiàn)已成功地給實(shí)驗(yàn)動物轉(zhuǎn)入抗炎因子基因IL-4、IL-10，抗氧化劑和抗蛋白酶等基因調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞的反應(yīng)性、耐受性。
目前的抗炎藥物一定程度上都存在缺陷，很多藥物抗炎療效并不理想或不良反應(yīng)較大，在減輕組織炎癥損傷的同時(shí)亦削弱了機(jī)體免疫力，不利于炎癥的治療。提高抗炎藥物的療效和降低藥物對機(jī)體正常免疫力的影響是各國科學(xué)家一直不斷努力的研究目標(biāo)。
1961年，Boouh首先發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，該酶是由2個(gè)同源酶二聚體亞基組成的一個(gè)超基因家族，有α、μ、pi 3種，在體內(nèi)主要催化外源性和內(nèi)源性親電子有毒物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合，形成親水性強(qiáng)的物質(zhì)而起到解毒作用。目前研究最多的是pi亞型，已有研究表明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi(GSTpi)與腫瘤的耐藥性/腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。目前尚未發(fā)現(xiàn)GSTpi在抗炎方面的應(yīng)用。另外，未見應(yīng)用重組蛋白純化技術(shù)表達(dá)、純化GSTpi的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的表達(dá)純化方法及其在制藥中的新用途，即提供一種能夠抵御全身炎癥反應(yīng)綜合癥以及其它革蘭氏桿菌引起炎癥的有效藥物。
2、技術(shù)方案人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的表達(dá)純化方法純化方法一、其方法步驟如下第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)2～4h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，PH 7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過的IDA-Ni2+樹脂在4℃結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，PH 7.9的洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，PH 7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5M NaCl，20mMTris-HCl，PH 7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mM EDTA，PH 6.5透析液2透析測定酶活性；第四步用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割His6標(biāo)簽，得到人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。
純化方法二、其方法步驟如下第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)3h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL 140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneSepharose 4B 36-38℃結(jié)合30min，用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次；第三步合并3次洗脫液上清，用上述PBS緩沖液透析，得到人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。
本發(fā)明為人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合征疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明為人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用重組蛋白純化技術(shù)純化的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi(GSTpi)的藥理藥效試驗(yàn)的結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在炎癥治療中的應(yīng)用(1)LPS是大腸桿菌內(nèi)毒素的主要成分，常作為致傷劑，用于誘導(dǎo)動物全身炎癥反應(yīng)綜合征。當(dāng)空腹注射37.5mg/Kg的LPS時(shí)，小鼠死亡率達(dá)70％；而注射LPS后30分鐘再注射2mg/kg的GSTpi，小鼠死亡率降為30％。實(shí)驗(yàn)證明GSTpi非常顯著地對抗全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的致死作用，大大提高了動物的存活率。
(1)一氧化氮(NO)含量的增加是全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的結(jié)果，NO在全身炎癥反應(yīng)中的作用是降低血壓、產(chǎn)生氧自由基如ONOO·ONOO·是NO致細(xì)胞毒性的主要物質(zhì)，過量的氧化自由基導(dǎo)致細(xì)胞壞死、組織損傷和器官功能衰竭(鄒岡等.基礎(chǔ)神經(jīng)藥理學(xué)，第二版.科學(xué)出版社1999，5.)本實(shí)驗(yàn)測定LPS刺激后小鼠血清NO的水平。結(jié)果表明GSTpi通過抑制氧化自由基NO的增高來抵御全身反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)展。
(2)髓過氧化物酶(MPO)是白細(xì)胞中的一種炎性標(biāo)志物，組織中MPO活性的增加反應(yīng)了白細(xì)胞的浸潤。本實(shí)驗(yàn)測定LPS刺激后肺組織中MPO的活性。結(jié)果表明GSTpi抑制肺組織中MPO的活性，說明其阻止全身反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)展。
(3)誘生型一氧化氮合酶(iNOS)是SIRS中NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的增加是炎癥發(fā)展的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞iNOS的表達(dá)，表明其阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)展。
(4)環(huán)氧化酶-2(COX-2)是體內(nèi)前列腺素合成的限速酶，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞COX-2的表達(dá)，進(jìn)一步表明其阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)展。
3、有益效果(1)采用本發(fā)明方法純化得到的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi重組蛋白純度高、產(chǎn)量高、且空氣氧化形成的無活性二聚體少。
(2)提供了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的新用途，為炎癥的治療特別是全身性炎癥反應(yīng)綜合癥找到新型有效藥物。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在炎癥治療中的應(yīng)用，不僅能有效控制炎癥，避免其進(jìn)一步發(fā)展；而且對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響較小；作為一種內(nèi)源性蛋白，給藥后不會引起免疫反應(yīng)，副作用極小。
四

圖1、His-tag重組蛋白純化技術(shù)純化人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi圖2、GSTpi對LPS所致小鼠死亡率的影響圖3、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響圖4、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響圖5、Western Blotting檢測GSTpi、Y7F對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS合成的抑制作用圖6、Western Blotting檢測GSTpi對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2合成的抑制作用四具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、帶組氨酸標(biāo)簽的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(His6-hGSTpi)重組蛋白的純化方法1)實(shí)驗(yàn)儀器及材料菌株E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)，質(zhì)粒pET-28a、His·Bind蛋白純化試劑盒購自Novagen公司，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，超聲破碎儀，4℃層析柜。
2)實(shí)驗(yàn)步驟方法一
第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，38℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，36-38℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)3h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)5h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，PH7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過的IDA-Ni2+樹脂在4℃結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，PH 7.9洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，PH 7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5M NaCl，20mMTris-HCl，PH 7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mM EDTA，PH 6.5透析液2透析測定酶活性；第四步用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割His6標(biāo)簽，獲得純化的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。
方法二第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，38℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，38℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)3h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)5h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL 140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneSepharose 4B38℃結(jié)合30min，用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次；
第三步合并3次洗脫液上清，用上述的PBS緩沖液透析，獲得純化的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖1可以看出，采用以上方法純化得到的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(hGSTpi)重組蛋白純度高、產(chǎn)量高，且空氣氧化形成的無活性二聚體少。
實(shí)施例2、GSTpi對LPS所致小鼠死亡率的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)。
2)實(shí)驗(yàn)步驟取雄性20±2g ICR小鼠腹腔注射LPS(37.5mg/kg)后30min，分別腹腔給藥GSTpi(2mg/kg)，觀察并記錄LPS組和LPS+GSTpi組小鼠的存活率。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖1可以看出GSTpi可以提高LPS引起小鼠炎癥后的存活率。LPS刺激40小時(shí)后，LPS組小鼠存活率僅有30％而腹腔給予GSTpi后，小鼠存活率提高到了60％(LPS+GSTpi組)。
表1.GSTpi對LPS引起炎癥后小鼠存活率的影響(％) 動物數(shù)每組20只。
實(shí)施例3、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)；NO試劑盒(硝酸還原酶法)，購于南京建成生物。
2)實(shí)驗(yàn)步驟取雄性20±2g ICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內(nèi)毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8和12小時(shí)眼眶取血采集小鼠血液樣本，1000rpm/min離心取血清，參照NO試劑盒方法，檢測血清中NO含量。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2可以看出，LPS引起動物炎癥反應(yīng)后，血清中NO含量顯著升高且隨著LPS刺激時(shí)間的延長，NO含量持續(xù)升高。GSTpi可以抑制NO的分泌，在12小時(shí)顯示了顯著的抑制效果；相反，GSTpi的4M變體則不具有這種抑制作用，該組動物血清中NO含量與LPS組無顯著差異。
表2.GSTpi對LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響 結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P＜0.05，與LPS組比較，n＝5。
實(shí)施例4、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制；3％戊巴比妥鈉；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)；MPO試劑盒，購于南京建成生物。
2)實(shí)驗(yàn)步驟選取雄性20g左右ICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內(nèi)毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8、12和16小時(shí)麻醉動物打開胸腔，剪開左心房后經(jīng)右心室注入100ml生理鹽水沖洗肺部，待沖洗干凈后摘取肺。玻璃勻漿器研磨后用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，參照MPO試劑盒檢方法，測肺組織勻漿中MPO活性。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可以看出，LPS引起動物炎癥反應(yīng)后，肺部MPO活性顯著升高且隨著LPS刺激時(shí)間的延長，MPO活性持續(xù)升高。GSTpi可以抑制MPO活性，LPS刺激動物后30min腹腔注射GSTpi后動物肺部MPO活性被抑制，在4、8、12和16小時(shí)均有顯著抑制效果。相反，GSTpi的4M變體的這種抑制作用要小的多，在LPS的刺激下，該組動物肺部MPO活性仍然趨于升高。
表3.GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響
結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，**P＜0.01，與LPS組比較，n＝5。
實(shí)施例5Western Blotting檢測GSTpi、Y7F對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS合成的抑制作用1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料電泳儀BioRad；LPS(Sigma)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi Y7F變體(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制；培養(yǎng)液DMEM(GIBCO)；血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞所。
2)實(shí)驗(yàn)步驟將RAW264.7細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種于24孔板。細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)，加入終濃度為100ng/ml的LPS，30分鐘后，加入終濃度分別為5μg/ml的GSTpi或Y7F，以未經(jīng)處理的細(xì)胞為陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細(xì)胞30min，裂解液4℃ 15000×g 15min取上清。Western Blotting檢測iNOS蛋白量。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4可以看出未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞無iNOS表達(dá)，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞iNOS表達(dá)量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)，且表現(xiàn)為劑量依賴性；但是GSTpi變體Y7F由于7位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?，失去酶活，不能抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的合成。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明GSTpi抑制NO合成的機(jī)制是通過抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)且其抑制作用依賴本身酶活。
實(shí)施例6Western Blotting檢測GSTpi對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2合成的抑制作用1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料電泳儀BioRad；LPS(Sigma)使用時(shí)用1×PBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1×PBS配制，培養(yǎng)液DMEM(GIBCO)，血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細(xì)胞系，購于中科院上海細(xì)胞所
2)實(shí)驗(yàn)步驟將RAW264.7細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種于24孔板。細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)，加入終濃度為100ng/ml的LPS，分別于1、2、4、6、8、10小時(shí)后，加入終濃度為5μg/ml的GSTpi，以未經(jīng)處理的細(xì)胞為陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細(xì)胞30min，裂解液4℃ 15000×g 15min取上清。WesternBlotting檢測COX-2蛋白量。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5可以看出未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞無COX-2表達(dá)，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞COX-2表達(dá)量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明GSTpi可通過抑制COX-2表達(dá)來抑制前列腺素的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)及組織損傷。
權(quán)利要求
1.一種人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法，其純化步驟如下(1)、將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)2～4h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；(2)、按每g菌體沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，PH7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過的IDA-Ni2+樹脂在4℃結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，PH7.9的洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；(3)、合并3次洗脫液上清，用0.5M NaCl，20mMTris-HCl，PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mM EDTA，PH6.5透析液2透析測定酶活性；(4)、用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割His6標(biāo)簽，得到人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。
2.一種人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法，其純化步驟如下(1)、將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)3h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；(2)、按每g菌體沉淀加5mL 140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneSepharose 4B 36-38℃結(jié)合30min，用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次；(3)、合并3次洗脫液上清，用上述的140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液透析，獲得純化的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGST。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合征疾病藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi在制備治療革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法，其方法步驟為(1)將含表達(dá)載體pET－28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體；(2)按每g菌體沉淀加入pH7.9的結(jié)合緩沖液重懸收集菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎、離心后取上清液，用緩沖液洗脫；(3)將洗脫上清用透析液1透析去咪唑，再用透析液2透析測定酶活性；(4)用PBS緩沖液透析，用凝血酶水解切割His
文檔編號C12N15/09GK1869210SQ200610040269
公開日2006年11月29日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者殷志敏, 沈佳胤, 羅蘭, 張泓, 王宇 申請人:南京師范大學(xué)