專利名稱：兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測病毒核糖核酸的方法。
背景技術：
現(xiàn)有技術中對丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的檢測，有匹基法、華美法等，均存在靈敏度低、特異性不理想等缺陷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效提高檢測靈敏性、特異性的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法。
本發(fā)明的技術解決方案是一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，其特征是包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV全系列，在HCV(丙型肝炎病毒)基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，設計并合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)制備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer(緩沖液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應液18μl，分別放入各個反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量。
步驟(3)中擴增是于Roche熒光定量檢測儀中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環(huán)，共進行45個循環(huán)。
步驟(2)中制備標準品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質量和濃度，并進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴增儀進行如下循環(huán)94℃預變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，涂布于含X-gal和IPTG并具氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，Sac I酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準確定量(連續(xù)測定5次，每次重復4管，取均值)，并進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μldd(double-distilled)H2O。
利用本發(fā)明方法對105例HCV抗體陽性和220例陰性樣本進行檢測，陽性率分別為89.52％(94例)和2.72％(6例)，而同樣的樣本用匹基法和華美法檢測，匹基法的陽性率分別為71.42(75例)和0.9(2例)，華美法為69.52(73例)和2.27(5例)，由此可以看出，本發(fā)明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
抗HCV陽性樣本105例，抗HCV陰性220例，兩探針法、匹基法和華美法檢測結果見表1。表1結果經(jīng)統(tǒng)計學處理，抗HCV陰性與多探針法、華美法顯著性差異(P＜0.05)，抗HCV陽性與匹基法、華美法顯著性差異(P＜0.05)。
表1 105例抗HCV陽性220例抗HCV陰性三種方法結果的比較

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施例方式一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV(丙型肝炎病毒)全系列(GenBank注冊號為AB114136)，在HCV(丙型肝炎病毒)基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，應用Beacon Designer2.1軟件，設計如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2，并合成引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)制備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer(緩沖液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應液18μl，分別放入各個Roche反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量(可根據(jù)HCVRNA標準品建立的標準曲線，計算出待測樣品中HCVRNA的準確含量，同時還可分析標準品建立的標準曲線的線性范圍、標準品實測值與換算值之間的差異以及實驗重復性)。
步驟(3)中擴增是于Roche熒光定量檢測儀(lightcycle)中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環(huán)，共進行45個循環(huán)。
步驟(2)中制備標準品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀(Eppendorf公司)檢測RNA的質量和濃度，并進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴增儀進行如下循環(huán)94℃預變性5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，涂布于含X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并具氨芐青霉素(Amp)抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，Sac I酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準確定量(連續(xù)測定5次，每次重復4管，取均值)，并進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
上述試劑中，Trizo購自Invitrogen公司，AMV、dNTPs、DNA聚合酶購自Promega公司。
權利要求
1.一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV全系列，在HCV基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，設計并合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt 127～nt149)(2)制備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/L BSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應液18μl，分別放入各個反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是步驟(3)中擴增是于Roche熒光定量檢測儀中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環(huán)，共進行45個循環(huán)。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是步驟(2)中制備標準品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質量和濃度，并進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/LdNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴增儀進行如下循環(huán)94℃預變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含X-gal和IPTG并具氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，SacI酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準確定量，并進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品。
4.根據(jù)權利要求3所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，包括引物和探針的制備、制備反應液、制備RNA標準品、熒光定量檢測等步驟。本發(fā)明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
文檔編號C12Q1/68GK1908627SQ20061004097
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月16日 優(yōu)先權日2006年8月16日
發(fā)明者崔之礎, 張冬雷, 施健, 黃竺筠 申請人:南通大學附屬醫(yī)院