肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備防治腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗腸道病毒71型感染的新靶點(diǎn)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬人腸 道A類(lèi)病毒，是導(dǎo)致手足口?。℉and-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。目 前，手足口病在世界多個(gè)地區(qū)暴發(fā)并流行，尤其是亞太地區(qū)。在我國(guó)，自2008年幾大省市 暴發(fā)手足口病疫情以來(lái)，該病的感染人數(shù)和死亡率一直居高不下，每年報(bào)告發(fā)病數(shù)超過(guò)100 萬(wàn)例，死亡數(shù)近1000例。手足口病主要發(fā)病人群為5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出現(xiàn)皰疹等癥狀；少數(shù)患兒可發(fā)展為重癥患者，出現(xiàn)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS)病變，包括無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎以 及神經(jīng)源性肺水腫等，嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的生命健康[Solomon T, Lewthwaite P, Perera D, Cardosa MJ, McMinn P, Ooi ΜΗ. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特別是重癥病 例多由腸道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前關(guān)于EV71引起手足口病的治療尚無(wú)特 異高效的抗病毒藥物，臨床上仍以對(duì)癥治療為主，在預(yù)防方面也無(wú)有效疫苗問(wèn)世。
[0003] EV71的傳播以糞-口途徑最廣，在此傳播途徑中，腸道是人體抵御病原體 的第一道屏障。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，EV71經(jīng)口腔接種小鼠后，最先在小腸組織表現(xiàn) 出病原體陽(yáng)性[Chen YC, Yu CK, Wang Y F，et al. A murine oral enterovirus T7I infection model with central nervous system involvement. Journal of General Virology，2004, 85(1) :69-77]。因此，EV71首先通過(guò)對(duì)腸道系統(tǒng)進(jìn)行感染，在小腸道細(xì)胞 內(nèi)大量快速?gòu)?fù)制，隨后入血導(dǎo)致病毒血癥并引發(fā)其它器官的感染。然而，在EV71到達(dá)人體 腸道系統(tǒng)后，病毒如何侵入腸道細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚。小腸作為人體消化系統(tǒng)重要器官，主 要負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，其腔面最外層為小腸粘膜上皮細(xì)胞，對(duì)于抵御病原體的起 著至關(guān)重要的作用。作為人結(jié)腸癌細(xì)胞系，Caco-2在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)功能方面與人小腸粘 膜上皮細(xì)胞相似，培養(yǎng)成熟的Caco-2為致密的單層細(xì)胞，具有與正常的小腸粘膜上皮細(xì)胞 相同的極性和緊密連接、微絨毛結(jié)構(gòu)；且作為腫瘤細(xì)胞，比小腸粘膜上皮細(xì)胞更易培養(yǎng)。因 此，探明EV71感染Caco-2的機(jī)制并以此尋找新的抗病毒靶點(diǎn)，對(duì)于防治EV71對(duì)人體的感 染至關(guān)重要。
[0004] 為了有效地感染細(xì)胞，病毒必須利用宿主細(xì)胞的膜分子及其囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)完成 對(duì)宿主細(xì)胞的入侵，才能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并釋放出有感染性的子代病毒顆粒。因此， 作為病毒感染宿主細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)，細(xì)胞入侵已成為抗病毒藥物篩選的重要靶標(biāo)。研究 表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途徑來(lái)入侵不同種類(lèi)的靶細(xì)胞，比如EV71借助 網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑（clathrin-mediated endocytosis)感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞 (rhabdomyosarcoma, RD)[Yamayoshi, S. , et al. , Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus71.Nat Med，2009.15(7):p.798_801·];而感染 Jurkat T 淋巴細(xì)胞系則主要利用小窩依賴的內(nèi)吞途徑（caveolar-dependent endocytosis) [Lin HY，Yang YTj Yu SL，et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 infection. J Virol. 2013, 87 (16) :9064-76.] D 目前， 關(guān)于EV71感染Caco-2的途徑及機(jī)制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶細(xì)胞主要借助了參與宿主細(xì)胞自身物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵分子，這些宿主細(xì) 胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子在細(xì)胞的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸，囊泡的形成、內(nèi)吞以及分泌中發(fā)揮著重要的作用。如 Rab5a、Rab5b、Rab5c介導(dǎo)了批網(wǎng)格蛋白衣被小泡從細(xì)胞質(zhì)膜向早期內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)（Gorvel J Pj Chavrier Pj Zerial Mj et al. rab5 controls early endosome fusion in vitro. [J]. Cell，1991，64(5) :915-925.);網(wǎng)格蛋白（clathrin)主要負(fù)責(zé)受體介導(dǎo)的的內(nèi)吞過(guò)程；小 窩蛋白家族分子 caveolin-l(CAVl)、caveolin_2(CAV2)、caveolin_3(CAV3)將物質(zhì)運(yùn)輸 至高爾基體；Floti 11 in分子能夠與脂後內(nèi)蛋白分子相互作用并內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)；ADP核糖 基化因子6分子參與調(diào)解細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配；GTP酶激活蛋白分子GRAFl 在網(wǎng)格蛋白非依賴型的囊泡運(yùn)輸中具有重要的調(diào)節(jié)作用；白細(xì)胞介素2受體內(nèi)吞調(diào)節(jié)了 信號(hào)通路并影響了細(xì)胞增殖（Jason Mercer，Mario Schelhaas，et al.Virus Entry by Endocytosis. Annu Rev Biochem. 2010;79:803-833·)。在以上這些分子中，caveolin-1 和 clathrin被證實(shí)分別參與了 EV71感染Jurist T淋巴細(xì)胞和RD細(xì)胞的過(guò)程，而其它分子在 EV71感染中的作用還未有報(bào)道。
[0006] 液泡分選蛋白 4A (vacuolar protein sorting 4homolog A，VPS4A)由 VPS4A 基因編碼，其另一同源蛋白為Vps4B，二者都屬于ATP酶AAA蛋白成員，通過(guò)水解ATP 提供能量，與轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（Endosomal Sorting Complex Required for Transport，ESCRT)第三成員ESCRT-III的相關(guān)蛋白相互作用，參與到細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu) 的變形和剪切過(guò)程中。其主要生物學(xué)功能包括多囊泡體的形成、胞質(zhì)分離、病毒出芽 釋放等（Henne WM，Buchkovich NJ，Emr SD. The ESCRT pathway. [J]· Developmental Cell, 2011, 21 (I) : 77 - 91. Votteler Jj ffi.S. Virus budding and the ESCRT pathway. [J]. Cell Host&Microbe，2013, 14(3) :232-241.)。
[0007] 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物（hepatocyte growthfactor-regulated tyrosine kinasesubstrate，HRS)作為ESCRT-O的一個(gè)重要分子，可識(shí)別和募集范素 化修飾的底物，使底物進(jìn)入多囊泡體介導(dǎo)的分選和降解途徑（Henne麗，Buchkovich NJ jEmr SD. The ESCRT pathway. [J]. Developmental CelI,2011, 21(I):77 - 91. Votteler Jj ffi.S.Virus budding and the ESCRT pathway. [J].Cell Host&Micro be，2013, 14(3) :232-241.)。
[0008] 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)VPS4A和HRS均能介導(dǎo)柯薩奇病毒A9、輪轉(zhuǎn)病毒等多種病毒 的的細(xì)胞入侵，表明VPS4A和HRS在病毒感染入侵階段也發(fā)揮著重要作用（Huttunen M j ffaris M，Kajander Rj et al. Coxsackievirus A9infects cells via nonacidic multivesicular bodies. [J].Journal of Virology, 2014, 88 (9) :5138-5151. Silva-Ayala Dj Lopez T，Gutierrez M，et al. Genome-wide RNAi screen reveals a role for the ESCRT complex in rotavirus cell entry. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2013, 110 (25) : 10270-10275.)。
[0009] 目前還沒(méi)有任何關(guān)于VPS4A和HRS分子在EV71感染宿主細(xì)胞（特別是Caco-2細(xì) 胞）中作用的報(bào)道，對(duì)于這兩個(gè)分子進(jìn)行深入研究不僅能夠提升對(duì)EV71感染與致病機(jī)制的 認(rèn)識(shí)，也可以為預(yù)防與治療EV71感染提供新的思路與靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗腸道病毒71型感染的新靶點(diǎn)。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物（h印atocyte growthfactor-regulated tyrosine kinasesubstrate，HRS)的新用途，特別是在抗腸道病 毒71型感染中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第三目的在于提供干擾HRS分子表達(dá)的siRNA。
[0013] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：
[0014] 本發(fā)明，以人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶細(xì)胞宿 主蛋