專利名稱：分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類或動物細(xì)胞的培養(yǎng)，或基因工程技術(shù)，具體是一種分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)形成包裹軸突的髓鞘，便于神經(jīng)沖動的快速傳輸。哺乳動物出生前有大量少突膠質(zhì)干(OP)細(xì)胞，在CNS發(fā)育過程中，OP分化為成熟OL，軸突才能正常髓鞘化。最近，對脫髓鞘的動物模型以及多發(fā)性硬化(MS)的研究表明，成熟個體的CNS中也存在OP細(xì)胞，可以分化補(bǔ)充丟失的OL。這些實驗結(jié)果引起人們研究OP細(xì)胞分化和修復(fù)能力的極大興趣。
目前有多種從嚙齒類動物組織中分離OP和OL細(xì)胞的方法。Jean deVellis實驗室建立了一種方法，從原代混合培養(yǎng)的新皮層細(xì)胞中分離OP細(xì)胞(McCarthy and de Vellis 1980)。最近，有報導(dǎo)從圍產(chǎn)期的大鼠、小鼠或狗獲得稱為少突球的懸浮OP細(xì)胞團(tuán)，并進(jìn)一步擴(kuò)增的方法。
這些細(xì)胞團(tuán)的分離和擴(kuò)增需要bFGF和PDGF等生長因子，以及從成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系B104獲得的條件培養(yǎng)基。Vitry et al.已證明小鼠自由懸浮的干細(xì)胞球是OP前體細(xì)胞，通過在B104條件培養(yǎng)基中加入高濃度的胰島素和孕酮可以獲得成熟的少突球。雖然采用分離少突球的方法獲得的OP細(xì)胞進(jìn)行的研究得出了許多關(guān)于OP細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的結(jié)果，但是用這種方法獲得的OP細(xì)胞有許多限制條件。單獨(dú)的一個干細(xì)胞球是許多細(xì)胞的集合體，并不清楚是否所有這些細(xì)胞都有完全相同的表型，是否它們都一定分化為OL細(xì)胞。存在著分化的不確定性。另外，由上述方法獲得的OP細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的自發(fā)成熟程度沒有經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗，這同樣會使成熟和分化研究結(jié)果的解釋復(fù)雜化。
為此，建立了小鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株一直是困擾在全世界范圍內(nèi)所有生物及神經(jīng)學(xué)科學(xué)家的一道難題。鑒于神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞在進(jìn)行諸如誘導(dǎo)細(xì)胞分化的體外細(xì)胞實驗，細(xì)胞信號傳導(dǎo)的細(xì)胞模型，分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究，及用于治療中樞神經(jīng)脫髓鞘藥物的篩選所扮演的重要作用，全世界范圍內(nèi)所有生物及神經(jīng)學(xué)科學(xué)家一直在不斷探索一種方法來建立無缺陷的小鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株。迄今為止獲得了廣泛承認(rèn)的只是大鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株CG4建立。然而，由于探索病因最重要的動物模型如基因敲除技術(shù)只在小鼠身上得到應(yīng)用。為了保持實驗的連續(xù)性及可靠性，就必須建立有效及可靠的小鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞模型。以往的小鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株都有不同的缺陷。因而并未得到全世界科學(xué)界的一致認(rèn)可，也因此未得到廣泛應(yīng)用。
中國專利1727472公開了“一種簡單分離提純腦神經(jīng)干細(xì)胞的方法”，其是利用凝膠對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行三維立體培養(yǎng)，利用神經(jīng)干細(xì)胞在無接著點(diǎn)環(huán)境中可以增殖并形成神經(jīng)球的特征達(dá)到對神經(jīng)干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和提純的目的。形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光標(biāo)記，90％左右的細(xì)胞為Nestin陽性，說明此方法分離擴(kuò)增提純的神經(jīng)干細(xì)胞快速有效。經(jīng)此法分離提純的神經(jīng)干細(xì)胞可以在體外分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決適用于多種基因型小鼠，采用多種細(xì)胞培養(yǎng)分選步驟，獲得高純度OP細(xì)胞，表型穩(wěn)定，可分化為成熟OL細(xì)胞的問題，進(jìn)一步建立人類少支膠質(zhì)干細(xì)胞，而提供一種分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方按實現(xiàn)的。
一種分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法a.原代細(xì)胞培養(yǎng)乳鼠大腦皮層，移入含有HBSS的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)吸液管吹打，細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，4℃，2000rpm離心2min，收集細(xì)胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育；分離的細(xì)胞以每孔5×104的密度種在未包被的六孔板內(nèi)增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b.mOP細(xì)胞的分離和傳代收集原代培養(yǎng)18天后的原代培養(yǎng)細(xì)胞，低密度重新種植到未包被培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2-3星期，直到出現(xiàn)OP細(xì)胞群，分離；置于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，傳代20次獲得為mOPpri細(xì)胞，傳代50次獲得mOP細(xì)胞。
所述分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，其低密度種植是以1.0×102低密度種植到60mm未包被培養(yǎng)皿。
所述分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，其重新種植OP細(xì)胞的培養(yǎng)皿作為“母皿”，附在150mm培養(yǎng)皿底部，在每個150mm培養(yǎng)皿中放置一個60mm“母皿”，為了從“母皿”中獲得OP細(xì)胞，將2-6個空白未包被的60mm“俘獲皿”用一滴無菌瓊脂糖分別粘在150mm大皿底部。在大皿內(nèi)加入PM淹沒60mm培養(yǎng)皿。
這樣，經(jīng)本發(fā)明建立的細(xì)胞株可廣泛應(yīng)用于有關(guān)于干細(xì)胞分化條件下的基礎(chǔ)研究，包括誘導(dǎo)細(xì)胞分化的體外細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞信號傳導(dǎo)的細(xì)胞模型，分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究；用于治療中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病的病因探索及藥物篩選；進(jìn)一步可以用此方法分離并建立人類神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株，因而對所有脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化癥等有重大的治療意義；以及體內(nèi)用于中樞神經(jīng)髓鞘再生動物實驗，行為學(xué)研究，并結(jié)合各類生長因子進(jìn)行體內(nèi)及體外的綜合研究。
本發(fā)明較之其他任何方法都更加簡單。不用振蕩篩選，不用抗體，培養(yǎng)皿也不用包被。因而時間及成本都大大降低。
本發(fā)明第一次在全世界范圍內(nèi)建立了小鼠神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞株。純度達(dá)到100％，表達(dá)所有的神經(jīng)少支膠質(zhì)干細(xì)胞特異抗原，經(jīng)過長期培養(yǎng)，染色體沒有突變。而且，體內(nèi)及體外實驗都證實可以分化為成熟的少支膠質(zhì)細(xì)胞。


圖1A是分離自第5天新生小鼠大腦皮層原代培養(yǎng)6天的細(xì)胞形態(tài)；圖1B是分離自第5天新生小鼠大腦皮層原代培養(yǎng)18天的細(xì)胞形態(tài)；圖1C是胰酶消化后的二次培養(yǎng)2周后生長情況；圖1D是俘獲并分離的少支膠質(zhì)干細(xì)胞mOPpri；圖2A是傳代20代前的mOPpri細(xì)胞形態(tài)；圖2B是傳代50代后的mOP細(xì)胞形態(tài)；圖3A是mOP細(xì)胞在PM培養(yǎng)液中增殖并借助肝素傳代細(xì)胞；圖3B是2周后分化成熟的mOP細(xì)胞；圖3C是實時PCR分析膠質(zhì)干細(xì)胞Nestin，NG2及成熟少支膠質(zhì)細(xì)胞MBP，MAG，PLP，MOG，MOBP的表達(dá)情況對比分析。
具體實施例方式
材料和方法動物，細(xì)胞系和培養(yǎng)基C57BL/6J小鼠由Jackson實驗室購得。大鼠B104成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系由Kekule-Institutfur Organische Chemie und Biochemie，Bonn，De提供，培養(yǎng)基DMEM/F12，1％青霉素/鏈霉素，10％胎牛血清(Bottensteinand Sato 1979)增殖培養(yǎng)基(PM)10μg/ml生物素(Sigma)，5μl/ml N1(Sigma-Aldrich)，30％的B104條件培養(yǎng)基，溶于DMEM溶液中。細(xì)胞培養(yǎng)用試劑無特別說明均購于Invitrogen。細(xì)胞濾網(wǎng)和Falcon管購于Falcon Labware。
原代細(xì)胞培養(yǎng)出生一天的乳鼠深度麻醉，大腦轉(zhuǎn)移到未包被的培養(yǎng)皿內(nèi)。去掉腦膜小心分離出新皮層，轉(zhuǎn)移到含有Hanks平衡鹽溶液(HBSS)的培養(yǎng)皿內(nèi)。在50ml的Falcon管中用吸液管反復(fù)吹打，依次用70μm和40μm直徑的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。4℃，2000rpm離心2min，收集細(xì)胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育5min，進(jìn)一步分離細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)，以每孔5×104的密度種在未包被的六孔板內(nèi)，培養(yǎng)基為PM。
mOP細(xì)胞的分離和傳代原代培養(yǎng)18天后收集細(xì)胞，以1.0×102低密度種植到60mm未包被培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2-3星期，直到出現(xiàn)OP細(xì)胞群并擴(kuò)增。重新種植OP細(xì)胞的培養(yǎng)皿作為“母皿”，附在150mm培養(yǎng)皿底部(每個150mm培養(yǎng)皿中放置一個60mm“母培養(yǎng)皿”)。為了從母皿中獲得OP細(xì)胞，將空白未包被60mm“俘獲皿”(2-6個)用一滴無菌瓊脂糖粘在150mm大皿底部。在大皿內(nèi)加入PM淹沒60mm培養(yǎng)皿，置于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育?！胺@皿”，有單個細(xì)胞源OP細(xì)胞出現(xiàn)，則轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿到培養(yǎng)箱中使OP細(xì)胞進(jìn)一步增殖。此時的細(xì)胞定義為小鼠原代少突膠質(zhì)干(mOPpri)細(xì)胞。擴(kuò)增后分裝，在液氮中冷凍保存，備用。
mOPpri細(xì)胞每三天傳代，0.05％胰酶-EDTA37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)消化10min。消化后的細(xì)胞收集到15ml離心管中，4℃，2000rpm離心2min，種植于未包被的T75培養(yǎng)瓶中，種植液為新鮮PM，置于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。傳代20次獲得mOPpri細(xì)胞，傳代50次獲得小鼠少突膠質(zhì)干(mOP)細(xì)胞。
體外mOP細(xì)胞誘導(dǎo)分化體外誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)程序是1)mOP細(xì)胞用0.05％胰酶-EDTA消化，收集，用1×HBSS洗，重新種植于T75培養(yǎng)瓶中，密度1×105。2)每天用不含胰酶的PM培養(yǎng)基換液，未貼壁細(xì)胞被清除。3)偶爾會出現(xiàn)成團(tuán)細(xì)胞，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，更換不含胰酶的培養(yǎng)基可以消除這些細(xì)胞團(tuán)。2周后mOP細(xì)胞出現(xiàn)典型的分化表型。
實時RT-PCR從三個T75培養(yǎng)瓶中收集mOP細(xì)胞混合，用RNeasy mini試劑盒，依照制造商提供說明，提取總RNA。cDNA由400ng/90μl總RNA，SuperScriptFirst-Strand RT-PCR合成系統(tǒng)(Invitrogen)合成。表2列出了用于RT-PCR分析的引物序列。400ng反轉(zhuǎn)錄總RNA(用Sybr Green緩沖液稀釋)，正義、反義引物各200nM，終體積25μl，采用Sybr Green PCR核心試劑，以及ABIPRISM7700序列探測系統(tǒng)儀進(jìn)行實時定量RT-PCR分析。RT-PCR產(chǎn)物用溴化乙啶進(jìn)行瓊脂糖凝膠染色，確保只有預(yù)期大小的單一擴(kuò)增產(chǎn)物。對于mOP細(xì)胞基因表達(dá)分析，誘導(dǎo)后細(xì)胞任意給定基因的相對表達(dá)量用與對照細(xì)胞(未誘導(dǎo))的倍數(shù)變化來表示。
免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組化
A2B5雜交瘤由American Type Culture Collection獲得。NG2抗體，NeuN，GD3，和O4抗體購于Chemicon，GFAP，MBP，PLP，MAG抗體購于Santa Cruz Biotechnology。CD11b抗體購于Serotec。熒光二抗購于Jackson Immunoresearch，DAPI封片劑購于Vector Laboratories。mOPpri或mOP細(xì)胞在六孔板里未包被的玻片上培養(yǎng)，4％多聚甲醛固定30min，1-5％牛血清白蛋白(BSA)室溫終止0.5-2hrs，一抗用1％BSA-PBS稀釋，4℃孵育過夜。
抗體稀釋比例NG2(1∶1000)；NeuN(1∶2000)；GD3(1∶100)；O4(1∶100)；GFAP(1∶1000)；MBP(1∶100)；PLP(1∶100)；MAG(1∶100)；CD11b(1∶100)。PBS洗三次，熒光二抗用1％BSA-PBS(磷酸緩沖液磷酸鈉鹽50mM，NaCl 200mM，pH7.4)按1∶500稀釋，室溫避光孵育45min。玻片用PBS清洗3次，每次5min，之后用DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。
冷凍的動物大腦在Hacker低溫保持箱中切為8μm的切片，4％多聚甲醛固定10min，之后用0.1％的Triton-X100處理5min。多克隆兔抗EGFP血清(1∶1000，Molecular Probes)和山羊抗-MBP(1∶200，Santa Cruz)用于雙染。所有Cy2/Cy3標(biāo)記的熒光二抗都購于Jackson。
細(xì)胞計數(shù)和凋亡研究用96孔板中的六孔重復(fù)種植mOP細(xì)胞，密度5×103，種植液PM。從每一孔中任選三個獨(dú)立視野計數(shù)，計算平均值，得到細(xì)胞數(shù)目。對于保護(hù)作用實驗，mOP細(xì)胞以每孔1×104的密度種于96孔板。細(xì)胞凋亡用膜連蛋白-V-FITC和PI雙染色的方法評價(凋亡探測試劑盒，Biovision)。
用熒光計和熒光顯微鏡研究mOP細(xì)胞分化MBP/A2B5熒光比用來量化mOP細(xì)胞的分化程度。如前所述方法在24孔未包被培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)mOP細(xì)胞，并對MBP和A2B5做免疫染色。Cy2/MBP的激發(fā)/發(fā)射波長為485/528，Cy3/A2B5的激發(fā)/發(fā)射波長為530/590，用熒光計測量，KC4軟件(Bio-Tek)分析。
mOP細(xì)胞的體內(nèi)分化mOP細(xì)胞占培養(yǎng)皿底面積50％后，用慢病毒pSico-EGFP(由Dr.TylerJacks惠贈)轉(zhuǎn)染同時加入polybrene 8μg/ml。3天以后用熒光顯微鏡觀察，90％以上mOP細(xì)胞呈現(xiàn)EGFP陽性。mOP細(xì)胞用0.05％胰酶-EDTA消化，5mlHBSS洗三次，每次2000rpm，2min。最后一次離心后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以5×104/μl密度重懸于HBSS。
激光捕獲微切片(LCM)來源細(xì)胞的切片，激光捕獲和RNA提取所有的步驟都在無RNase的情況下操作。植入EGFP-mOP細(xì)胞的小鼠腦徑向切片速凍于置于干冰上的異甲基丁烷中。冰凍腦片在沿紋狀體切成8um厚，立即放到位于干冰上的鋁箔紙上。立刻在剃度乙醇溶液脫水，然后在二甲苯中孵育兩次，每次兩分鐘進(jìn)行清洗。將切片置于封閉濕盒5分鐘，在使用PixCell II LCM系統(tǒng)進(jìn)行LCM之前可以將切片保存在切片盒置于干燥容器中最多3小時。如前所述，LCM系統(tǒng)使用功率為75mM，持續(xù)時間750us，點(diǎn)樣大小7.5um，靶電位為20mV?？俁NA的提取按照QIAGEN的RNA提取試劑盒的流程來進(jìn)行?？俁NA溶于無RNase水中，然后對其濃度進(jìn)行定量分析。將總RNA分裝-70度保存。
結(jié)果混合小鼠腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)培養(yǎng)取材于新生小鼠新皮層，擴(kuò)增OP細(xì)胞，在B104條件增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)到六天的時候，培養(yǎng)細(xì)胞有了顯著的增殖(圖1A)，并且形態(tài)各異的細(xì)胞都存在，OP細(xì)胞通過其胞體小，雙極或三極的形態(tài)特征和相差顯微鏡下的雙折射現(xiàn)象而得以識別。OP細(xì)胞的增殖將持續(xù)到18天培養(yǎng)皿長滿為止(圖1B)。
二次混合培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠OP細(xì)胞為了從18天的原代培養(yǎng)中純化OP細(xì)胞，將細(xì)胞胰酶消化下來，重新以低濃度(1.0×102)種到含PM培養(yǎng)基的未經(jīng)包被處理的60mm培養(yǎng)盤中，促進(jìn)單細(xì)胞增殖集落的形成(“二次培養(yǎng)”)。經(jīng)過1-2周的生長，我們可以檢測到單細(xì)胞增殖集落(圖1C)。在這些集落中的細(xì)胞表現(xiàn)出類似原代培養(yǎng)18天觀察到的OP細(xì)胞具有雙極或三極形態(tài)，以及相差顯微鏡下雙折射的特征。當(dāng)把非貼附細(xì)胞收集重新種在新的培養(yǎng)盤后，一周后就可以觀察明顯的OP細(xì)胞生長。
小鼠OP細(xì)胞的高純度培養(yǎng)在原代和二次培養(yǎng)中觀察到的OP細(xì)胞相對于其他腦細(xì)胞的低貼附性，并被用于在高純度OP細(xì)胞培養(yǎng)中。將未包被的60mm培養(yǎng)盤(俘獲皿)放在一個更大的培養(yǎng)盤底部。一個二次原代培養(yǎng)盤(母皿)也放在這個大培養(yǎng)盤的底部，大培養(yǎng)盤內(nèi)加上PM培養(yǎng)基直到母皿和俘獲皿都被浸沒。觀察俘獲皿，直到出現(xiàn)單細(xì)胞增殖集落，這時候?qū)⒎@皿移出來，放回到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增和分化。用這個方法得到早期傳代小鼠OP細(xì)胞，在下文就叫做mOPPri細(xì)胞(圖1D)。
早期傳代mOPPri細(xì)胞的鑒定當(dāng)把OP細(xì)胞在PM培養(yǎng)基中傳大概20代后，用多種OP細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物來鑒定mOPPri細(xì)胞的成熟程度。完全分化成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)髓磷脂形成所需的特異成分，包括半乳糖苷(GalC)，髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)，髓磷脂基礎(chǔ)蛋白(MBP)，髓磷脂蛋白(PLP)，髓磷脂相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)蛋白(MOBP)。
mOPPri細(xì)胞種在未包被的玻璃片上，PM培養(yǎng)2天，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測其成熟程度。所有的mOPPri細(xì)胞為A2B5陽性，而98.6％的細(xì)胞表現(xiàn)GD3陽性，97.2％的細(xì)胞表現(xiàn)O4陽性。82％的mOPPri細(xì)胞為NG2陽性。mOPPri細(xì)胞中高比例的A2B4和O4陽性細(xì)胞表明大多數(shù)細(xì)胞處于OP少突膠質(zhì)母細(xì)胞的晚期。4％-6％的細(xì)胞為MAG，MBP和PLP陽性，但沒有細(xì)胞染上小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD11b。小部分細(xì)胞染上了星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(＜0.2％)和神經(jīng)元標(biāo)志蛋白NeuN(＜0.1％)，(圖2A，圖2B，表1mOPPri)。OP細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在培養(yǎng)細(xì)胞中的分布范圍，表明處于早期傳代的mOPPri細(xì)胞在PM培養(yǎng)基中培養(yǎng)有自發(fā)分化的趨勢。將mOPPri細(xì)胞種到未包被培養(yǎng)盤中，連續(xù)8天不更換PM培養(yǎng)基來進(jìn)一步鑒定這種自發(fā)成熟趨勢。2天后mOPPri細(xì)胞開始表現(xiàn)出分化的形態(tài)特征。4至8天后基本所有的細(xì)胞都被觀察到有復(fù)雜的多分枝形成。
具有穩(wěn)定OP細(xì)胞特征的mOP細(xì)胞篩選盡管存在mOPPri細(xì)胞的自發(fā)成熟，在每次傳代后都可以觀察到較多數(shù)目的雙極mOPPri細(xì)胞(圖3A)。這些細(xì)胞是進(jìn)行了自我更新重新成為早期OP細(xì)胞。第50代的mOP細(xì)胞表現(xiàn)出整個培養(yǎng)過程中一致出現(xiàn)的雙極或三極OP細(xì)胞的形態(tài)(圖3B)。
另外，對mOPPri細(xì)胞的免疫組化分析表明其自發(fā)成熟的趨勢顯著減少。很明確的一點(diǎn)是，100％的培養(yǎng)mOP細(xì)胞為OP標(biāo)志物Nestin，A2B5和NG2染色陽性。82％的細(xì)胞染上了GD3，只有36％的細(xì)胞染上了晚期OP階段標(biāo)志物O4(圖2A，圖2B，表1mOP)。MBP，MAG，或PLP均未觀察到陽性染色，也沒有任何GFAP或NeuU染色的存在。
另外根據(jù)mOP細(xì)胞有穩(wěn)定的OP細(xì)胞形態(tài)，在不更換PM培養(yǎng)基的連續(xù)5天觀測細(xì)胞數(shù)目翻倍時間與MBP/A2B5染色比例的關(guān)系(圖略)，在3天和5天的時候可以觀察到凋亡細(xì)胞的增多(圖略)。
mOP細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中的分化為了分離富含已分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的mOP細(xì)胞，用選擇培養(yǎng)基來篩選高度貼壁的細(xì)胞。先用胰酶將mOP細(xì)胞消化下來，重新以一個低密度種到未包被培養(yǎng)盤中。漂浮細(xì)胞通過每天換PM培養(yǎng)基的方法去除。在培養(yǎng)過程中偶爾可見少突膠質(zhì)細(xì)胞球，輕搖培養(yǎng)皿，使少突膠質(zhì)細(xì)胞球脫離皿底漂浮，更換培養(yǎng)基從而去除這些細(xì)胞聚集物。兩周后，培養(yǎng)皿中絕大多數(shù)的細(xì)胞具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征。為進(jìn)一步確認(rèn)這種分化，使用即時RT-PCR技術(shù)在未分化mOP細(xì)胞和分化mOP細(xì)胞中分析少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因的mRNA水平。
檢驗bHLH轉(zhuǎn)錄因子Olig1和Olig2的mRNA水平依據(jù)Olig1在脫髓鞘損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用，而Olig2在OP細(xì)胞的特化中起作用。在分化mOP細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異基因表達(dá)的誘導(dǎo)是通過計算分化mOP細(xì)胞mRNA與mOPPri細(xì)胞mRNA的比例來確定的。當(dāng)在分化mOP細(xì)胞中編碼Nestin和NG2的mRNAs表達(dá)水平低時，編碼少突膠質(zhì)細(xì)胞特異MBP，MAG，PLP，MOG和MOBP的mRNA顯著地上升。另外，Olig2(而不是Oligl)的mRNA在分化mOP細(xì)胞中有上升，GFAP(星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白)，βIIITublin(神經(jīng)元標(biāo)志蛋白)和CD11b(小膠質(zhì)細(xì)胞)的mRNA則未見上升(圖3C)。
mOP細(xì)胞在小鼠腦中的分化將mOP細(xì)胞用慢病毒pSico標(biāo)記上EGFP(mOP-EGFP)，將它們立體注射到成年小鼠胼胝體和右腦室中檢驗其體內(nèi)分化潛能。移植三周后，處死動物做大腦切片，用EGFP-Cy2和MBP-Cy3兩種抗體做雙標(biāo)?？梢詸z測到在整個大腦內(nèi)植入mOP-EGFP細(xì)胞的遷移(圖略)。
免疫組化的結(jié)果表明mOP-EGFP細(xì)胞可以成為髓鞘形成細(xì)胞，尤其在小鼠腦的白質(zhì)區(qū)域。進(jìn)一步用激光捕獲胼胝體或皮層處單個EGFP陽性細(xì)胞研究其區(qū)域特異分化，用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異引物對進(jìn)行即時RT-PCR。各自的標(biāo)志物mRNA表達(dá)(誘導(dǎo))水平通過mOP-EGFP-胼胝體和mOP-EGFP-皮層的比值來確定。在胼胝體和皮層分布的mOP-EGFP細(xì)胞編碼α-actin，Nestin，NG2，Olig1，GFAP，βIIITublin和CD11b的mRNA水平基本沒有變化。但是，比起皮層處的mOP-EGFP細(xì)胞，胼胝體處的mOP-EGFP細(xì)胞有MBP，MAG，PLP和Olig2的mRNA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)(圖略)。
表1MOP細(xì)胞的表形及特征

表2實時PCR的引物

權(quán)利要求
1.一種分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于a.原代細(xì)胞培養(yǎng)乳鼠大腦皮層，移入含有HBSS的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)吸液管吹打，細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，4℃，2000rpm離心2min，收集細(xì)胞，加入0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育；分離的細(xì)胞以每孔5×104的密度種在未包被的六孔板內(nèi)增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b.mOP細(xì)胞的分離和傳代收集原代培養(yǎng)18天后的原代培養(yǎng)細(xì)胞，低密度重新種植到未包被培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2-3星期，直到出現(xiàn)OP細(xì)胞群，分離；置于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，傳代20次獲得為mOPpri細(xì)胞，傳代50次獲得mOP細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于低密度種植是以1.0×102低密度種植到60mm未包被培養(yǎng)皿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于重新種植OP細(xì)胞的培養(yǎng)皿作為“母皿”，附在150mm培養(yǎng)皿底部，在每個150mm培養(yǎng)皿中放置一個60mm“母皿”，為了從“母皿”中獲得OP細(xì)胞，將2-6個空白未包被的60mm“俘獲皿”用一滴無菌瓊脂糖粘分別在150mm大皿底部，在大皿內(nèi)加入PM淹沒60mm培養(yǎng)皿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞的方法，屬于人類或物細(xì)胞的培養(yǎng)，或基因工程技術(shù)。本發(fā)明首先進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，將乳鼠大腦皮層，經(jīng)細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，孵育，分離的細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；然后將原代培養(yǎng)細(xì)胞種植、培養(yǎng)2－3星期至出現(xiàn)OP細(xì)胞，分離，孵育，傳代20次獲得為mOPpri細(xì)胞，傳代50次獲得mOP細(xì)胞。經(jīng)這樣的設(shè)計，本發(fā)明已經(jīng)開發(fā)出一種新的少支膠質(zhì)干細(xì)胞模型及分離方法，大大方便了少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟、分化和功能的體內(nèi)體外研究。本發(fā)明采用多階段細(xì)胞培養(yǎng)的分選步驟，獲得高純度OP細(xì)胞，適用于各種基因敲除型小鼠，其表型穩(wěn)定，解決了在體內(nèi)、外少支膠質(zhì)干(op)細(xì)胞分化為成熟的少支膠質(zhì)細(xì)胞問題。
文檔編號C12N5/06GK101033459SQ200610082339
公開日2007年9月12日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者林彤 申請人:林彤