用于治療神經(jīng)變性癥狀的人類神經(jīng)細(xì)胞的移植的制作方法
【專利摘要】提供了治療神經(jīng)變性癥狀的方法?？梢栽谏窠?jīng)元變性區(qū)域和/或遠(yuǎn)離神經(jīng)元變性區(qū)域移植神經(jīng)干細(xì)胞。方法包括從生成與要替換的神經(jīng)元相對(duì)應(yīng)的特定類型神經(jīng)元的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。方法包括分離出分泌影響特定類型神經(jīng)元的生長(zhǎng)和/或再生的生長(zhǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞。在本發(fā)明中，我們公開了通過(guò)移植外部培養(yǎng)和擴(kuò)增的神經(jīng)祖細(xì)胞來(lái)治療這類病癥的方法，該病癥包括由于缺乏在神經(jīng)回路中產(chǎn)生特定神經(jīng)遞質(zhì)的細(xì)胞而出現(xiàn)的數(shù)種神經(jīng)變性病癥，上述神經(jīng)祖細(xì)胞在移植到神經(jīng)組織中時(shí)分化成能夠以足以制服神經(jīng)變性相關(guān)癥狀的量和方式結(jié)合和制造神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元。
【專利說(shuō)明】用于治療神經(jīng)變性癥狀的人類神經(jīng)細(xì)胞的移植
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00580039450. 0、發(fā)明名稱為"用于治療神經(jīng)變性癥狀的人類 神經(jīng)細(xì)胞的移植"的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，該母案申請(qǐng)是2005年11月17日提交的PCT申請(qǐng)PCT/ US2005/041631進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明所公開的方法涉及通過(guò)特別有益于這類治療方法的細(xì)胞的移植治療病癥 的方法。特別地，所公開的方法提供了用神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs)治療神經(jīng)變性病癥的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 神經(jīng)變性病癥以伴有由疾病、遺傳性癥狀或創(chuàng)傷（例如外傷性或缺血性脊髓或腦 損傷）引起的神經(jīng)元退化的癥狀為特征。
[0004] 控制肢干骨骼肌收縮的脊髓回路包括激感運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和抑制性GABA能（即生成 GABA的）和甘氨酸能（即生成甘氨酸的）中間神經(jīng)元。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是源自脊髓灰質(zhì)前角的 神經(jīng)。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突作為刺激肌肉纖維的傳出運(yùn)動(dòng)纖維自脊髓節(jié)段中出現(xiàn)。運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元進(jìn)行的搏動(dòng)刺激肌肉纖維收縮。GABA，γ-氨基丁酸，是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的天然生成的 代謝物，其充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)以抑制或壓制電勢(shì)的神經(jīng)傳導(dǎo)。GABA能中間神經(jīng)元的缺失導(dǎo)致運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元引起的肌肉收縮的抑制性調(diào)節(jié)異常（dysregulation)。在沒(méi)有抑制性中間神經(jīng)元 對(duì)興奮性神經(jīng)元的控制的情況下，發(fā)生興奮性神經(jīng)元的燒毀，這導(dǎo)致肢干肌肉的痙攣性不 受控收縮或不受控僵硬。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的缺失導(dǎo)致馳緩性截癱，在該疾病中，患者不能收縮肌 肉并因此不能移動(dòng)。
[0005] GABA能中間神經(jīng)元在脊髓中受損的一個(gè)例子包括與胸降或胸腹主動(dòng)脈的暫時(shí)阻 斷相關(guān)的并發(fā)癥。這種阻斷是血管手術(shù)中修復(fù)胸腹主動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤所必須的步驟。在阻斷 持續(xù)期間，部分脊髓不能獲得血液循環(huán)并可能變成缺血性的。根據(jù)缺血間隔的持續(xù)時(shí)間，隨 后的神經(jīng)變性機(jī)能障礙可能神經(jīng)變性地表現(xiàn)為下肢輕癱或完全形成的痙攣性或馳緩性截 癱。
[0006] 盡管只部分了解引起缺血誘發(fā)性神經(jīng)變性的機(jī)制且可能涉及興奮性氨基酸、前列 腺素和/或氧自由基的過(guò)度釋放/活性，受暫時(shí)缺血性損害影響的脊髓神經(jīng)元種群是確定 的。例如，從具有完全形成的痙攣性截癱的動(dòng)物中取出的脊髓的組織病理學(xué)分析表現(xiàn)出小 抑制性神經(jīng)元的選擇性損失；但是，α-神經(jīng)運(yùn)動(dòng)元仍然存在于之前缺血的脊柱節(jié)段中。已 經(jīng)描述了具有脊柱缺血性損傷的人類對(duì)象中類似的脊柱神經(jīng)元病理學(xué)。
[0007] 相反，在患有馳緩性截癱的動(dòng)物中，看出pan-necrotic神經(jīng)變性變化，這影響了 小的抑制性和興奮性中間神經(jīng)元以及腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在脊柱局部缺血后的神經(jīng)元變性期 間，如同在病灶性或全面腦缺血中那樣，也觀察到局部小神經(jīng)膠質(zhì)的損傷依賴型活化和炎 性變化，例如被巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)損傷程度，炎性變化通常在缺血性損傷后兩天至七天達(dá) 到頂峰，然后在兩周至四周的后缺血性期間表現(xiàn)出炎性成分的逐漸喪失。
[0008] 在過(guò)去二三十年，已經(jīng)作出相當(dāng)大的努力以在動(dòng)物模型中評(píng)估各種材料的脊柱移 植的治療潛力。因此，已經(jīng)在數(shù)種脊柱損傷（包括機(jī)械外傷性損傷、化學(xué)損傷的脊髓）的模 型或具有進(jìn)行性α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的遺傳控制動(dòng)物（ALS轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠）中使用直 接脊柱基因療法改善神經(jīng)變性機(jī)能障礙。
[0009] -般而言，研究證實(shí)神經(jīng)元表型在由胎兒組織，而不是由已經(jīng)在體外擴(kuò)增的神經(jīng) 前體生成的移植物中的長(zhǎng)期存活和保存。實(shí)際上，體外擴(kuò)增并移植到機(jī)械或化學(xué)損傷脊髓 中的神經(jīng)前體的僅僅有限的神經(jīng)元分化和成熟已經(jīng)得到證實(shí)。細(xì)胞優(yōu)先分化成非神經(jīng)元細(xì) 胞類型。盡管這種優(yōu)先的非神經(jīng)元分化的機(jī)制沒(méi)有被完全了解，但假設(shè)可能涉及促炎細(xì)胞 因子（例如TNF a、TGF β )在先前損傷位置的局部釋放。
[0010] 神經(jīng)變性代表細(xì)胞療法的特別具有挑戰(zhàn)性的生物環(huán)境，且既定神經(jīng)變性疾病中存 在的細(xì)胞死亡信號(hào)（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005)可能與 移植物存活不相容。此外，成人脊髓被視為缺乏允許再生的細(xì)胞和/或信號(hào)（Park等人， 2002)，且大部分NSC移植研究已經(jīng)表現(xiàn)出差的或有限的分化（Cao等人，2002 ;Yan等人， 2003 ;Yan 等人，2004)。
[0011] 細(xì)胞療法中的主要問(wèn)題之一是移植的細(xì)胞的低細(xì)胞存活（低于5% )。迄今所有 移植的細(xì)胞在體內(nèi)注射后不久就產(chǎn)生顯著的細(xì)胞死亡。因此，為了輸送有效劑量的細(xì)胞，最 終劑量必須以至少20倍注射。這又要求大得多的細(xì)胞制造規(guī)模，這引起更進(jìn)一步的規(guī)章和 經(jīng)濟(jì)障礙。此外，這類細(xì)胞在體內(nèi)的存活率不能保持。不能證明有效劑量的細(xì)胞療法的可 再現(xiàn)施用就不能被政府和其它管理機(jī)構(gòu)（例如食品和藥品管理局）批準(zhǔn)使用。
[0012] 當(dāng)治療神經(jīng)變性疾病和在大面積的身體、組織或器官（例如整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)）而非 單個(gè)局部區(qū)域上散布的癥狀時(shí)，產(chǎn)生更多挑戰(zhàn)。例如，在ALS中，神經(jīng)變性涉及沿整個(gè)脊髓 的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及運(yùn)動(dòng)皮層中的那些神經(jīng)元的緩慢死亡。同樣，在多數(shù)溶酶體病中，神經(jīng)元 破壞牽涉腦和脊髓的多數(shù)區(qū)域。阿爾茨海默氏癥牽涉大腦的大部分。即使在更局部的神經(jīng) 變性疾病，例如帕金森癥和亨廷頓氏舞蹈病中，受影響的紋狀體面積也相當(dāng)大，比手術(shù)可以 到達(dá)的移植區(qū)域大得多。因此，神經(jīng)變性疾病的細(xì)胞療法預(yù)計(jì)需要更寬的移植程序。
[0013] 因此，需要改進(jìn)的治療神經(jīng)變性癥狀的方法。還需要改進(jìn)的培養(yǎng)和移植動(dòng)物神經(jīng) 干細(xì)胞和人類神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，這類細(xì)胞一經(jīng)移植，就可以克服之前發(fā)現(xiàn)的所有限制并 提供功能益處。因此，這種治療神經(jīng)變性癥狀的方法在體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)勁的神經(jīng)元分化，能夠?qū)?現(xiàn)在各種變性條件下的長(zhǎng)期神經(jīng)元存活和在缺乏發(fā)育信號(hào)（developmental cues)的成人 組織中成熟成與治療相關(guān)的神經(jīng)元亞種群，并提供比細(xì)胞本身的位置寬的治療范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 所公開的方法包括治療神經(jīng)變性癥狀的方法。特別地，所公開的方法包括將已經(jīng) 體外擴(kuò)增的NSCs、神經(jīng)祖細(xì)胞或神經(jīng)前體移植到需要它們的對(duì)象體內(nèi)，從而使這些細(xì)胞可 以改善神經(jīng)變性癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括確認(rèn)、分離、擴(kuò)增并制備要用 于治療神經(jīng)變性癥狀的供體細(xì)胞?？梢赃x擇要移植的供體細(xì)胞以對(duì)應(yīng)于對(duì)該癥狀、其征候 和/或其效應(yīng)有作用的單元或其欠缺。
[0015] 所公開的方法的細(xì)胞包括在移植時(shí)產(chǎn)生足以結(jié)合到神經(jīng)元下部結(jié)構(gòu)中以改善病 狀或癥狀的量的神經(jīng)元的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括通過(guò)移植從哺乳動(dòng) 物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出的并已經(jīng)在體外擴(kuò)增的多能神經(jīng)祖細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)治療 神經(jīng)變性疾病或癥狀。例如，擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞的移植可用于在患有各種形式脊髓?。ò?有痙攣狀態(tài)、僵硬、抽搐、麻痹或任何其它肌肉活動(dòng)過(guò)度的征候）的對(duì)象中改進(jìn)行走功能。
[0016] 治療方法可以包括經(jīng)由移植向受損神經(jīng)區(qū)域供應(yīng)適當(dāng)數(shù)量的NSCs，其可以分化成 足量的GABA能神經(jīng)元和/或甘氨酸能神經(jīng)元以減弱有缺陷的神經(jīng)回路，包括活動(dòng)過(guò)度的神 經(jīng)回路。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病中恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能?？梢?向至少一個(gè)神經(jīng)變性區(qū)域，例如神經(jīng)變性脊髓供應(yīng)能夠分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的適當(dāng)數(shù)量或治 療有效量的NSCs或神經(jīng)祖細(xì)胞以恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能。NSCs通過(guò)取代變性的神經(jīng)肌肉接點(diǎn)來(lái)發(fā) 揮其治療效果。
[0018] 協(xié)同地或替代性地，NSCs通過(guò)表達(dá)和釋放出保護(hù)變性組織的神經(jīng)元以使它們更多 地存活更長(zhǎng)時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)分子來(lái)發(fā)揮其治療效果。可以促使NSC源神經(jīng)元投射到脊神經(jīng)前根 中并刺激肌肉，其中NSCs參與患有變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的患者體內(nèi)與宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的 廣泛相互聯(lián)系。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自人類胎兒脊髓的NSCs可以移植到腰索中，在 此這些細(xì)胞可以分化成與宿主神經(jīng)元形成突觸性接觸并表達(dá)和釋放出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)因 子的神經(jīng)元。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括提供神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞，它們與宿 主組織結(jié)合并為宿主神經(jīng)元提供一種或多種生長(zhǎng)因子以保護(hù)它們免受組織中存在的變性 影響。該方法包括在脊髓區(qū)域中引入足量的NSCs或神經(jīng)祖細(xì)胞以使NSCs分泌有效量的至 少一種生長(zhǎng)因子。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括提供在神經(jīng)變性癥狀中進(jìn)行細(xì)胞替換的干 細(xì)胞的臨床前評(píng)測(cè)中使用動(dòng)物模型的方法。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括提高移植的NSCs分化成神經(jīng)元的效力。該 方法包括使高度富集的NSCs或神經(jīng)祖細(xì)胞以其未分化狀態(tài)擴(kuò)增，從而在移植時(shí)，移植物中 足量（例如20% )的細(xì)胞選定神經(jīng)元方向（fate)。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括在不提高要移植的NSCs或神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù) 量的情況下提高分化細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下述方式制備擴(kuò)增的 供體種群--一經(jīng)移植，NSCs或神經(jīng)祖細(xì)胞就高達(dá)十倍地在體內(nèi)分裂且不形成腫瘤，由此 有效地提高輸送細(xì)胞的總數(shù)。
[0023] 所公開的方法的細(xì)胞可以分離自或獲自非人類的哺乳動(dòng)物的胎兒、新生兒、青少 年、成人或死后組織。所公開的方法的細(xì)胞可以分離自或獲自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液或分化成 神經(jīng)元的干細(xì)胞的任何其它合適來(lái)源。細(xì)胞也可以獲自胚胎干細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方 案中，細(xì)胞包括從發(fā)育中的胎兒脊髓中分離出的神經(jīng)上皮細(xì)胞。在某些例子中，神經(jīng)前體細(xì) 胞可以是從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定子區(qū)域中分離出的神經(jīng)祖細(xì)胞。
[0024] 根據(jù)所公開的方法，神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)前體細(xì)胞 可以是能夠在培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)增并能夠在分化時(shí)生成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的多能NSCs。
[0025] 在移植時(shí)，細(xì)胞可以是未分化的、在體外預(yù)分化或完全分化的。在一個(gè)實(shí)施方案 中，誘導(dǎo)細(xì)胞分化成神經(jīng)譜系（lineage)。所公開的方法的細(xì)胞可以在促炎細(xì)胞因子和受損 組織中存在的其它環(huán)境因子的存在下就地進(jìn)行神經(jīng)元分化。
[0026] 使用本方法，可以通過(guò)將細(xì)胞移植或引入適合改善疾病、失調(diào)或癥狀的區(qū)域來(lái)處 理神經(jīng)回路。通常，移植到支持移植細(xì)胞存活的神經(jīng)組織或非神經(jīng)組織中。在所公開的方 法中使用的NSC移植物在神經(jīng)變性環(huán)境中良好地存活，在此NSCs可以以延緩神經(jīng)變性癥狀 或疾病的發(fā)作和推進(jìn)的形式發(fā)揮有力的臨床作用。
[0027] 在一些情況下，可以移植到身體的邊遠(yuǎn)（remote)區(qū)域中，且細(xì)胞可以遷移到其預(yù) 計(jì)靶點(diǎn)。相應(yīng)地，所公開的方法也可以包括人類NSCs的部分移植。本文所用的術(shù)語(yǔ)"部分 移植"是指在部分神經(jīng)變性區(qū)域中移植擴(kuò)增的NSCs。例如，將人類NSCs部分移植到脊髓的 腰段中。NSCs對(duì)變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的至少部分作用包括將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞因子經(jīng)由典 型細(xì)胞機(jī)制輸送到變性宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中。為此，使用所公開的方法部分移植到脊髓腰段 中的NSCs在患有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中表現(xiàn)為存活、產(chǎn)生大量神經(jīng)元分化、促 進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活并在移植臨近區(qū)域以及遠(yuǎn)離移植區(qū)域的區(qū)域中發(fā)揮作用。
[0028] 相應(yīng)地，所公開的方法提供了治療痙攣狀態(tài)、僵硬或肌肉活動(dòng)過(guò)度癥狀的方法。該 方法包括從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞并使神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。 該方法還包括使擴(kuò)增種群濃縮并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū) 域。至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損傷、 中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢性局 部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，從選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、周圍血液和臍帶 血中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的非人類的哺乳動(dòng)物（developing mammal)〇
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)育中的非人類的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，從人類胎兒脊髓中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因子。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)GABA能 神經(jīng)元。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)甘氨酸 能神經(jīng)元。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少40 %的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少30 %的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
[0042] 在另一實(shí)施方案中，提供神經(jīng)干細(xì)胞。該神經(jīng)干細(xì)胞能夠治療痙攣狀態(tài)、僵硬和肌 肉活動(dòng)過(guò)度癥狀。該神經(jīng)干細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物中并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。將包括該神 經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增種群濃縮，并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域。 至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0043] 在所公開的方法的另一實(shí)施方案中，提供了治療慢性疼痛的方法。該方法包括從 哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞并將神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。該方法還包 括使擴(kuò)增種群濃縮并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域。至少20% 的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損 傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢性 局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)GABA能神經(jīng)元。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)甘氨酸能神經(jīng) J Li 〇
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少40 %的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，這些區(qū)域包括背角。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，這些區(qū)域包括鞘內(nèi)空間。
[0051] 在進(jìn)一步實(shí)施方案中，提供神經(jīng)干細(xì)胞。該神經(jīng)干細(xì)胞能夠治療慢性疼痛。該神 經(jīng)干細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物中并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增種群濃 縮，并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域。至少20%的擴(kuò)增種群能 夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0052] 在所公開的方法的另一實(shí)施方案中，提供了治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的方法。該方法 包括從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞并將神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。該方 法還包括使擴(kuò)增種群濃縮并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域。至 少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷 性腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化 癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū)域中分離出神經(jīng) 干細(xì)胞，其中該神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善運(yùn)動(dòng)缺陷的生長(zhǎng)因子。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的至 少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0057] 在進(jìn)一步實(shí)施方案中，提供能夠治療脊髓空洞癥的神經(jīng)干細(xì)胞。該神經(jīng)干細(xì)胞分 離自哺乳動(dòng)物并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增種群濃縮，并將治療 有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域。至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊 髓中生成神經(jīng)元。
[0058] 在所公開的方法的另一實(shí)施方案中，提供了治療脊髓空洞癥的方法。該方法包括 從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞并使神經(jīng)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。該方法 還包括使擴(kuò)增種群濃縮并將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20% 的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神經(jīng)元。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū)域中分離出神經(jīng) 干細(xì)胞，其中該神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長(zhǎng)因子。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包括從富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的至 少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1，000個(gè)神經(jīng)元。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將擴(kuò)增種群的至少100, 000個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞引入接受者脊髓的 脊髓空洞中。
[0065] 在再一實(shí)施方案中，提供能夠治療脊髓空洞癥的神經(jīng)干細(xì)胞。該神經(jīng)干細(xì)胞分離 自哺乳動(dòng)物并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群。將包括該干細(xì)胞的擴(kuò)增種群濃縮，并將治療有效量 的擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空 洞中生成神經(jīng)元。
[0066] 在所公開的方法的再一實(shí)施方案中，提供了將至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增成神經(jīng)干 細(xì)胞的擴(kuò)增種群的方法。每次神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增在不分化的情況下超過(guò)30次細(xì)胞倍增。該 方法包括從中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中離解神經(jīng)干細(xì)胞并向培養(yǎng)皿提供至少一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)。 細(xì)胞外蛋白質(zhì)包括至少大約10微克/毫升的聚-D-賴氨酸和大約1毫克/毫升纖連蛋白。 該方法還包括在培養(yǎng)皿中在不存在血清的情況下培養(yǎng)離解的神經(jīng)干細(xì)胞并在培養(yǎng)皿中添 加至少一種生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它們的組合。該方法進(jìn)一 步包括使培養(yǎng)的細(xì)胞在匯合之前傳代（passaging)。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)元。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增包括將纖連蛋白作為可溶因子添加到培養(yǎng) 基中。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，離解細(xì)胞并使細(xì)胞傳代包括酶促離解。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，酶促離解包括用胰蛋白酶處理細(xì)胞。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將治療有效量的擴(kuò)增種群引入接受者神經(jīng)系統(tǒng)的至少一個(gè)區(qū) 域中以治療神經(jīng)變性癥狀。
[0072] 因此，所公開的方法優(yōu)于現(xiàn)有藥理學(xué)方案的優(yōu)點(diǎn)是提供促進(jìn)移植的NSCs分泌營(yíng) 養(yǎng)分子的能力的方法，這些營(yíng)養(yǎng)分子可以在最佳生物利用率的條件下輸送到變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元中。
[0073] 所公開的方法的再一優(yōu)點(diǎn)包括提供實(shí)現(xiàn)NSCs種群的更高比例的神經(jīng)元分化的方 法。
[0074] 所公開的方法的再一優(yōu)點(diǎn)包括實(shí)現(xiàn)來(lái)自NSCs的部分移植的臨床作用。
[0075] 在本發(fā)明和附圖的下列詳述中描述并容易看出所公開的方法的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0076] 圖1.人類脊柱干細(xì)胞的擴(kuò)增。從7-8周大的死后胎兒脊髓組織中分離出人類脊 柱祖細(xì)胞（a. k. a. NSC)系，并連續(xù)傳代大約130天的純培養(yǎng)期。在每次傳代時(shí)，將收取時(shí)回 收的細(xì)胞數(shù)除以平板接種時(shí)的初始細(xì)胞數(shù)以獲得細(xì)胞數(shù)的增加倍數(shù)。將每次傳代時(shí)增加的 倍數(shù)相乘，由此獲得累積增加倍數(shù)（左Y軸）。將細(xì)胞數(shù)量的增加倍數(shù)除以每一培養(yǎng)期（X 軸），由此計(jì)算每次傳代時(shí)的細(xì)胞倍增次數(shù)（右Y軸）。將該方法重復(fù)三次（連續(xù)擴(kuò)增1、2 和3)。
[0077] 圖2.擴(kuò)增的人類脊柱干細(xì)胞的形態(tài)。（A)固定的未染色擴(kuò)增培養(yǎng)物的相襯圖，20x 物鏡，（B)抗巢蛋白（anti-nestin)抗體染色。
[0078] 圖3.獲自擴(kuò)增的人類脊柱干細(xì)胞的分化培養(yǎng)物的表征。使第15-16代的擴(kuò)增細(xì) 胞在培養(yǎng)時(shí)分化大約14天，固定并用各種神經(jīng)元特異性抗體染色。（A) Tau和MAP2 ; (B) 3型 β微管蛋白；(C) GABA; (D)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶。
[0079] 圖4.人類中腦干細(xì)胞的擴(kuò)增。從7-8周大的死后胎兒中腦組織中分離出人類中 腦祖細(xì)胞（a. k. a. NSC)系并連續(xù)傳代大約170天的純培養(yǎng)期。在每次傳代時(shí)，將收取時(shí)回 收的細(xì)胞數(shù)除以平板接種時(shí)的初始細(xì)胞數(shù)以獲得細(xì)胞數(shù)的增加倍數(shù)。將每次傳代時(shí)增加的 倍數(shù)相乘，由此獲得累積增加倍數(shù)（Y軸）。
[0080] 圖5.擴(kuò)增的人類中腦干細(xì)胞的多巴胺吸收（uptake)活性。活細(xì)胞中的多巴胺轉(zhuǎn) 運(yùn)體活性（DAT)由中腦干細(xì)胞系及其一種無(wú)性亞系（其在檢定時(shí)分化22或44天）決定。 在存在⑴或不存在（-)DAT抑制劑諾米芬辛（10 μ M)的情況下，用放射性同位素標(biāo)記的 多巴胺培養(yǎng)細(xì)胞。洗滌細(xì)胞以去除未并入的多巴胺并溶解在液態(tài)閃爍體（scintillation cocktail)中。然后使用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定總細(xì)胞放射性（dpm)。
[0081] 圖6.外因?qū)θ祟愔心X干細(xì)胞系的神經(jīng)元分化和多巴胺能分化的影響。將來(lái)自兩 個(gè)人類中腦干細(xì)胞系（527RMB和796RMB)的冷藏神經(jīng)干細(xì)胞解凍并以40,000個(gè)細(xì)胞/孔 的密度在存在bFGF的4孔小室載玻片中平板接種，使其增殖6天。隨后，取出細(xì)胞并使細(xì) 胞再分化8天。細(xì)胞根據(jù)與塞爾托利細(xì)胞條件培養(yǎng)基（SCCM，在N2中稀釋1 : 1)接觸的 時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間分成四組。一組在增殖和分化過(guò)程中接觸SCCM(條件1);第二組僅在增 殖過(guò)程中接觸（條件2);第三組僅在分化過(guò)程中接觸（條件3);第四組不接觸SCCM(對(duì)照 物，Cont.)。每隔一天改變培養(yǎng)基，并在增殖階段每天添加促細(xì)胞分裂劑。每種條件維持 四個(gè)孔以允許對(duì)多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行染色。在分化時(shí)，將細(xì)胞使用4%低聚甲醛固定，并使用抗 MAP2ab (圖6A)和酪氨酸羥化酶（圖6B)的抗體以及GFAP和Gale免疫染色。使用40x物 鏡計(jì)數(shù)免疫染色細(xì)胞，且每個(gè)孔計(jì)數(shù)至少三個(gè)視場(chǎng)。在分析保持在任何條件下的細(xì)胞時(shí)都 幾乎或完全沒(méi)有檢測(cè)到GFAP+或GalC+，因此從分析中排除這些抗原。
[0082] 圖7.人類脊柱干細(xì)胞移植引起的大鼠痙攣狀態(tài)/僵硬和運(yùn)動(dòng)缺陷的降低。通過(guò) 腰脊髓的缺血性損害制造痙攣大鼠。在一組（black circle)中，用培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)增的人脊柱干 細(xì)胞（16代）移植大鼠 （η = 9)，而另一對(duì)照組（white circle, η = 7)僅接受沒(méi)有細(xì)胞的 培養(yǎng)基。在研究持續(xù)期間（8周），每天以1毫克/千克向兩組施用免疫抑制劑FK506。每 周一次用ΒΒΒ評(píng)分法評(píng)估各個(gè)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。
[0083] 圖8.人類脊柱干細(xì)胞移植引起的大鼠痙攣狀態(tài)/僵硬和運(yùn)動(dòng)缺陷的降低。通過(guò) 腰脊髓的缺血性損害制造痙攣大鼠。在一組（black circle和black squire)中，用培養(yǎng)時(shí) 擴(kuò)增的人脊柱干細(xì)胞（16代）移植大鼠 （η = 13)，而另一對(duì)照組（filled triangle,η = 6) 僅接受沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基。在研究持續(xù)期間（12周），每天以3毫克/千克向兩組施用免疫 抑制劑FK506。每周一次用BBB評(píng)分法評(píng)估各個(gè)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。
[0084] 圖9.在使用活細(xì)胞（L，紅）和死細(xì)胞（對(duì)照物，C)移植物（藍(lán)）的情況下，用臨 床和病理學(xué)測(cè)量的級(jí)數(shù)（A-B)以及終點(diǎn)（C-E)分析表示的人類NSC治療對(duì)G93AS0D1大鼠 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病嚴(yán)重性的作用。
[0085] A-B.圖A是顯示在整個(gè)觀察過(guò)程中實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物之間的顯著區(qū)別的 Kaplan-Meier 圖（P = 0· 0003)。圖 B 顯示了兩組之間（P 分別=0· 00168 和 0· 00125)肌 肉衰弱的兩個(gè)主要測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)（BBB和斜面分?jǐn)?shù)）的區(qū)別。
[0086] C-E.實(shí)驗(yàn)和對(duì)照大鼠中的存活（C)、疾病發(fā)作時(shí)間（time-to-disease-onset) (D) 和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)（E)。圖C顯示了兩組之間（P = 0. 0005)顯著的11天壽命差異。圖D顯 示了兩組之間（P = 0. 0001)疾病發(fā)作時(shí)間顯著的7天差異。圖E顯示了活和死NSC組（P =0. 01)之間腰部隆突中3, 212個(gè)細(xì)胞的差異。（E)底部的插頁(yè)顯示了 128天大的代表性 實(shí)驗(yàn)（上）和對(duì)照（下）大鼠之間運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的差異；箭頭代表側(cè)向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元組。 Size bars :150 微米。

【具體實(shí)施方式】
[0087] 所公開的方法涉及治療神經(jīng)變性癥狀。此外，所公開的方法包括移植到有需要的 對(duì)象中的神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法。制備移植用的細(xì)胞可以包括在體外將特定細(xì)胞種群擴(kuò)增 至足以作為神經(jīng)變性癥狀的治療方法進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，變性或受 損神經(jīng)區(qū)域的治療方法包括向該區(qū)域供應(yīng)有效數(shù)量的足以改善神經(jīng)變性癥狀的神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0088] 本文所用的神經(jīng)變性癥狀可以包括伴有神經(jīng)元的損傷或退化的任何疾病或病 癥或征候或其病因或影響。神經(jīng)變性癥狀可以包括，但不限于，亞歷山大病、AlpeW s Disease、阿爾茨海默氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、腦白質(zhì)海綿 狀變性、科凱恩綜合征、皮質(zhì)基底節(jié)變性、克-雅氏病，亨廷頓氏舞蹈病、Kennedy' s Disease、克拉伯病、路易體癡呆、馬查多-約瑟夫病、多發(fā)性硬化、帕金森氏病、佩-梅氏 病、Niemann-Pick^ s Disease、原發(fā)性側(cè)索硬化、Refsum' s Disease、山德霍夫氏病， Schilder' s Disease、Steele-Richardson_01szewski Disease、脊髓瘦與受損神經(jīng)兀有關(guān) 的任何其它癥狀。其它神經(jīng)變性癥狀可以包括或由外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、中 風(fēng)、外傷性腦損傷和遺傳性癥狀引起。
[0089] 所公開的方法包括使用NSCs改善神經(jīng)變性癥狀。本文所用的術(shù)語(yǔ)"NSCs"也可以 指神經(jīng)或神經(jīng)元祖蛋白，或神經(jīng)上皮前體?？梢愿鶕?jù)它們分化成三種主要CNS細(xì)胞類型（神 經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）的能力在功能上定義NSCs。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs是多能的以使各個(gè)細(xì)胞具有分化成神經(jīng)元、星形細(xì)胞或 少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs是雙能的以使各個(gè)細(xì)胞具有分化成三種 CNS細(xì)胞類型中的兩種的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs包括在體外生成神經(jīng)元和星形細(xì) 胞的至少雙能細(xì)胞并包括在體內(nèi)生成神經(jīng)元的至少單能細(xì)胞。
[0091] 生長(zhǎng)條件可以影響細(xì)胞向一種或另一種細(xì)胞類型分化的方向，這意味著細(xì)胞沒(méi)有 被限定為單一譜系。在有利于神經(jīng)元分化的培養(yǎng)條件中，細(xì)胞，特別是來(lái)自人類CNS的細(xì)胞 大部分對(duì)于神經(jīng)元和星形細(xì)胞是雙能的，且極少分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。因此，所公開的方法 的分化細(xì)胞培養(yǎng)物可以產(chǎn)生神經(jīng)元和星形細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)元與星形細(xì)胞的 比率可以達(dá)到50 : 50比率。
[0092] 所公開的方法包括獲得位于哺乳動(dòng)物CNS區(qū)域（例如神經(jīng)上皮）中的NSCs。其它 可以分離出NSCs的CNS區(qū)域包括CNS的腦心室和subventricular區(qū)域和包括有絲分裂前 體以及后有絲分裂神經(jīng)元的其它CNS區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法可以使用位 于發(fā)育中的哺乳動(dòng)物CNS區(qū)域中的NSCs。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs獲自對(duì)所需神經(jīng)元種群天然為神經(jīng)原性的區(qū)域。所需細(xì) 胞種群可以包括特定神經(jīng)元表型的細(xì)胞，其可以取代或增補(bǔ)在神經(jīng)病癥狀中缺失或失活的 這類表型。
[0094] 通過(guò)從CNS的不同區(qū)域并跨越胎兒發(fā)育期間的不同胎齡分離出NSCs，可以獲得各 種不同的神經(jīng)元亞型，包括可用于治療特定神經(jīng)變性疾病或癥狀的那些。針對(duì)最佳擴(kuò)增和 神經(jīng)元分化能力，從CNS的不同區(qū)域并跨越不同胎齡分離出的NSCs。哺乳動(dòng)物CNS的標(biāo)志 之一是神經(jīng)元亞型的多樣性。單一的NSCs種群可能在培養(yǎng)時(shí)自發(fā)產(chǎn)生僅僅少數(shù)截然不同 的神經(jīng)元亞型。此外，來(lái)自特定胎兒胎齡的細(xì)胞可以建立培養(yǎng)的細(xì)胞的生理相關(guān)性。
[0095] 在所公開的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，要移植到對(duì)象中的細(xì)胞源自受損神經(jīng)區(qū)域 的人類胎兒對(duì)應(yīng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs分離自胎齡大約6. 5至大約20周的人類 胎兒CNS區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，在大約7至大約9周的胎齡分離來(lái)自胎兒脊髓的細(xì) 胞。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可分離神經(jīng)干細(xì)胞種群的比例可以隨供體年齡而變。細(xì)胞種群的擴(kuò)增 能力也可以隨供體年齡而變。NSCs的這類區(qū)域和時(shí)間特異性表明NSCs起到命運(yùn)限制性 (fate-restricted)祖細(xì)胞而非空白細(xì)胞或單一細(xì)胞種群的作用。
[0096] 包括GABA能神經(jīng)元的體外種群的比例通常恒定在大約5-10%。
[0097] 腹側(cè)中腦的NSCs與獲自相同妊娠期的脊髓的NSCs不同。特別地，來(lái)自腹側(cè)中腦 的NSCs只產(chǎn)生表達(dá)酪氨酸-羥化酶的多巴胺能神經(jīng)元，而來(lái)自脊髓的NSCs只產(chǎn)生生成乙 酰膽堿的膽堿能神經(jīng)元。但兩種細(xì)胞類型均同時(shí)生成更普遍存在的gluamate能和GABA能 神經(jīng)元。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括從腹側(cè)中腦中獲得NSCs以治療通過(guò) 表達(dá)酪氨酸-羥化酶的多巴胺能神經(jīng)元的移植至少部分改善或減緩的癥狀。
[0098] 因此，對(duì)于運(yùn)動(dòng)障礙，例如以多巴胺能神經(jīng)元缺失為特征的帕金森病的治療，所公 開的方法的一個(gè)實(shí)施方案包括使用源自腹側(cè)中腦之類區(qū)域（在此，多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng) 發(fā)生充足）的NSCs。此外，NSCs可以在人類胎兒發(fā)育中多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生充足的 胎齡獲得。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括從來(lái)自大約7至大約9周胎齡的腹 側(cè)中腦中獲得NSCs以治療運(yùn)動(dòng)障礙。
[0099] 為了治療由腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺失引起的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，例如肌萎縮性脊髓側(cè)索 硬化癥或馳緩性截癱，所公開的方法的一個(gè)實(shí)施方案包括使用源自脊髓之類區(qū)域（在此， 腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生充足）并獲自人類胎兒發(fā)育中腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生充 足的胎齡的NSCs。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，從大約7至大約9周胎齡的脊髓中分離出NSCs 以治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病。
[0100] 但是，應(yīng)該理解的是，在一些情況下，這類區(qū)域特異性的限制對(duì)于實(shí)際用途而言相 當(dāng)寬。因此，來(lái)自脊髓各個(gè)區(qū)域，例如頸部、胸部、腰部和骶骨節(jié)段的NSCs可以互換使用以 移植并治療NSCs相應(yīng)來(lái)源以外的位置。例如，源自頸部脊髓的NSCs可通過(guò)將這些細(xì)胞移 植到患者腰段中來(lái)治療痙攣狀態(tài)和/或僵硬。
[0101] 也可以從出生后的和成人的組織中分離出NSCs。源自出生后和成人組織的NSCs 在量上與其分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的能力以及其生長(zhǎng)和分化特征相當(dāng)。但是，來(lái)自各種 出生后和成人CNS的NSCs的體外分離效力遠(yuǎn)低于來(lái)自胎兒組織的NSCs的分離效力，后者 含有更豐富的NSCs種群。無(wú)論如何，與胎兒源NSCs相同，所公開的方法能夠使至少大約 30 %的源自新生兒和成人來(lái)源的NSCs體外分化成神經(jīng)元。因此，出生后和成人組織可如上 文在胎兒源NSCs的情況中所述的那樣使用，但胎兒組織的使用是優(yōu)選的。
[0102] 可以從在培養(yǎng)中擴(kuò)增的胚胎干細(xì)胞的操作中獲得各種神經(jīng)元亞型。因此，根據(jù)所 公開的方法，可以根據(jù)需要從其它不相關(guān)或不需要的細(xì)胞中分離并提純特定的神經(jīng)元亞型 以改進(jìn)結(jié)果，并可用于治療相同的神經(jīng)變性癥狀。
[0103] 所公開的方法中的NSCs可以來(lái)自一個(gè)位置并作為自體移植物移植到相同對(duì)象體 內(nèi)的另一位置。此外，所公開的方法中的NSCs可以源自遺傳相同的供體并作為同系移植物 移植。再進(jìn)一步，所公開的方法中的NSCs可以源自遺傳不相同的同種成員，并作為同種異 體移植物移植?；蛘?，NSCs可以獲自非人類來(lái)源并作為異種移植物移植。隨著有力的免疫 抑制劑的發(fā)展，同種異體移植物和非人類神經(jīng)前體的異種移植物，例如豬來(lái)源的神經(jīng)前體， 可以移植到人類對(duì)象種。
[0104] 樣品組織可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)方法離解。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織通過(guò)溫和機(jī)械研 制使用吸移管和不含二價(jià)陽(yáng)離子的鹽水緩沖液離解以形成離解細(xì)胞的懸浮液。需要足以獲 得主要單細(xì)胞的離解以避免過(guò)高的局部細(xì)胞密度。
[0105] 對(duì)于NSCs的成功商業(yè)應(yīng)用，保持強(qiáng)勁一致的培養(yǎng)是合意的，其具有通過(guò)許多連續(xù) 傳代而穩(wěn)定擴(kuò)增和分化的能力。如上所述，培養(yǎng)方法可以被優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)來(lái)自不同區(qū)域和CNS 發(fā)展期的各個(gè)NSCs細(xì)胞系的長(zhǎng)期穩(wěn)定擴(kuò)增，同時(shí)保持它們截然不同的祖細(xì)胞性質(zhì)。
[0106] 為此，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)NSCs (NSCs)與底物的粘合有助于加速NSC或祖 細(xì)胞的有絲分裂速率，從而提供顯著改進(jìn)--即更強(qiáng)勁的NSC或祖細(xì)胞培養(yǎng)。特別地，除了 避免過(guò)高的局部細(xì)胞密度和保持促細(xì)胞分裂劑濃度外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的濃度 影響NSCs的長(zhǎng)期有絲分裂和分化能力。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以包括聚-D-賴氨酸、聚-L-賴 氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L-鳥氨酸、纖連蛋白和它們的組合。其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以包 括纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白及其組合的各種同種型、片段、重組形式或合成模擬物。 或者或此外，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，所公開的方法可以包括能夠促進(jìn)有效細(xì)胞粘合的任何其它合適 的物質(zhì)，從而使各個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞在不會(huì)毒害細(xì)胞或阻礙細(xì)胞分裂的情況下在整個(gè)培養(yǎng)期間 粘附到培養(yǎng)底物上。
[0107] 盡管細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以有效地促進(jìn)細(xì)胞粘合，但不同的氨基酸聚合物，例如 聚-L/D-鳥氨酸或聚-L/D-賴氨酸可能在某些濃度下對(duì)各個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞是毒性的。培養(yǎng) 持續(xù)時(shí)間也會(huì)影響沉積在盤表面上的聚合物的最終量，這影響了細(xì)胞的存活力。對(duì)于所公 開的方法中使用的NSCs，聚合物的濃度可以在大約0. 1微克/毫升至大約1毫克/毫升的 范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將100微克/毫升聚-D-賴氨酸溶于中性pH值的0. 01M HEPES 緩沖液或水中并施加到培養(yǎng)皿上。將培養(yǎng)皿在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。然后將培養(yǎng)皿用水充分漂 洗并在使用前干燥。
[0108] 所公開的方法也可以包括用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白兩次涂布培養(yǎng)皿。在一個(gè)實(shí)施方案 中，將培養(yǎng)皿用纖連蛋白或纖連蛋白衍生物處理，然后如上所述施加聚-L/D-鳥氨酸或 聚-L/D-賴氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用由人類血漿制成的纖連蛋白。但是，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到， 可以使用任何其它合適形式或來(lái)源的纖連蛋白，例如豬或牛纖連蛋白、重組纖連蛋白、纖連 蛋白片段、合成肽或纖連蛋白的其它化學(xué)模擬物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以施加大約〇. 1微 克/毫升至大約1毫克/毫升的纖連蛋白。
[0109] 在包括來(lái)自人類脊髓的NSCs的擴(kuò)增的一個(gè)實(shí)施方案中，用100微克/毫升 聚-D-賴氨酸將培養(yǎng)皿處理足以使細(xì)胞外蛋白質(zhì)粘合到培養(yǎng)皿上并涂布培養(yǎng)皿的時(shí)長(zhǎng)。該 時(shí)長(zhǎng)可以為大約5分鐘至大約3小時(shí)。然后用水洗滌培養(yǎng)皿。在將培養(yǎng)皿風(fēng)干后，將培養(yǎng) 皿在室溫下用大約25毫克/毫升纖連蛋白處理大約5分鐘至數(shù)小時(shí)或在37 °C用大約1毫 克/毫升纖連蛋白處理大約1小時(shí)至數(shù)天。隨后，取出纖連蛋白并將培養(yǎng)皿洗滌至少一次 或儲(chǔ)存在PBS中直至使用。
[0110] 或者，可以將纖連蛋白作為直接供應(yīng)給細(xì)胞的可溶因子添加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在 該實(shí)施方案中，可以通過(guò)在用纖連蛋白處理培養(yǎng)皿之外或代替這種處理在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添 加1微克/毫升纖連蛋白來(lái)使NSCs擴(kuò)增。由于涂有纖連蛋白的器皿的相對(duì)較短的貯存期 限，在細(xì)胞平板接種時(shí)將附著蛋白作為可溶因子供應(yīng)到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)于NSCs的商業(yè)大 規(guī)模培養(yǎng)特別有利。該方法還可用于制造要求相當(dāng)精確的條件和可再現(xiàn)性（如在cGMP規(guī) 程下所要求的那樣）的神經(jīng)干細(xì)胞系和用于制造治療用神經(jīng)干細(xì)胞系。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將分離出的NSCs以大約1，000至大約20, 000個(gè)細(xì)胞/平方 厘米的密度添加到培養(yǎng)皿中。這種密度有利于各個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的均勻分布和粘合，避 免細(xì)胞的局部密集，來(lái)富集NSCs的培養(yǎng)。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs在不存在血清的情況下擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，NSCs 在指定的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)以避免NSCs暴露在足以使NSC的有絲分裂和分化能力失穩(wěn) 的血清濃度下。此外，NSCs與某些生長(zhǎng)因子，例如白血病抑制因子（LIF)或睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子（CNTF)的接觸也會(huì)使NSCs失穩(wěn)并應(yīng)該避免。
[0113] 可以在培養(yǎng)過(guò)程的任何階段向培養(yǎng)物中添加促細(xì)胞分裂劑以增強(qiáng)NSCs的生長(zhǎng)。 促細(xì)胞分裂劑包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（aFGF)、表 皮生長(zhǎng)因子（EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a (TGFa)和它們的組合。
[0114] 所公開的方法的NSCs可以以至少兩種不同的培養(yǎng)形式生長(zhǎng)和擴(kuò)增。一種培養(yǎng)形 式包括被稱作懸浮培養(yǎng)的聚集形式，通常被稱作簇生聚集形式。另一培養(yǎng)形式包括被稱作 粘附培養(yǎng)的分散的非聚集形式。
[0115] 在所公開的方法的NSCs的分散粘附培養(yǎng)中，細(xì)胞形成單層，其中各個(gè)細(xì)胞最初直 接接觸培養(yǎng)底物。最后，在培養(yǎng)周期后，細(xì)胞可以零星形成簇，其中在底層上形成至少一層 附加細(xì)胞層，即使底層中的細(xì)胞單獨(dú)粘附到底物上。當(dāng)培養(yǎng)物以高細(xì)胞密度培養(yǎng)或允許達(dá) 到高細(xì)胞密度時(shí)，尤其發(fā)生這種簇生，這在一種實(shí)施方案中被最小化以實(shí)現(xiàn)NSCs或祖細(xì)胞 的最佳擴(kuò)增或NSCs多能能力的最佳保持。在所公開的方法的一個(gè)實(shí)施方案的分散粘附培 養(yǎng)中，對(duì)于每次細(xì)胞分裂，能夠使人類NSCs在少于大約4天內(nèi)分裂。
[0116] 分散粘附培養(yǎng)的另一顯著特征在于，所公開的方法的NSCs分裂以生成各自保持 其多能能力的子細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法的NSCs的分散粘附培養(yǎng)包括在不 存在顯著分化情況下至少20次細(xì)胞倍增的擴(kuò)增能力。多數(shù)NSCs可以在損失其神經(jīng)原性潛 能之前擴(kuò)增超過(guò)至少50次細(xì)胞倍增。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所公開的方法的分散粘附培養(yǎng) 中擴(kuò)增的NSCs表現(xiàn)出改進(jìn)的神經(jīng)元分化，其在一個(gè)實(shí)施方案中產(chǎn)生至少大約30%的神經(jīng) 元分化。在許多情況下，至少50%的NSCs分化成神經(jīng)元。盡管分散粘附形式的培養(yǎng)是更優(yōu) 選的培養(yǎng)形式，但不同培養(yǎng)方法能夠分離在體外或體內(nèi)具有不同分化潛能的先天不同的細(xì) 胞種群。
[0117] 本發(fā)明還能夠在沒(méi)有基因變異或飼養(yǎng)細(xì)胞并入的情況下從各種來(lái)源中無(wú)性分離 NSCs。因此，可以在如上制成的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種非常低量，優(yōu)選少于1000個(gè)細(xì)胞/平方 厘米的細(xì)胞。
[0118] 在NSCs接種后的數(shù)天，細(xì)胞可以形成充分分離的群落。群落生長(zhǎng)至所需尺寸，例 如至少大約250至大約2000個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，手工選取至少一個(gè)細(xì)胞群落并單 獨(dú)接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)皿，例如多孔板上。
[0119] 分離的無(wú)性系種群可以通過(guò)連續(xù)傳代擴(kuò)增并用于建立多個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞系。已經(jīng)從 人類CNS的各個(gè)區(qū)域（包括脊髓、中腦和后腦）中分離出許多這類無(wú)性細(xì)胞系。無(wú)性細(xì)胞 系可用于富集特定細(xì)胞表型，例如更高比例的神經(jīng)元亞型。例如，可以用所公開的方法分離 使表達(dá)酪氨酸羥化酶的多巴胺能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元和其它特異性表型 的神經(jīng)元富集的無(wú)性細(xì)胞系。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多克隆或單克隆神經(jīng)干細(xì)胞系可以被誘導(dǎo)以進(jìn)一步富集神經(jīng) 元的特定亞型。已經(jīng)篩選出許多生長(zhǎng)因子、化學(xué)品和天然物質(zhì)以從中腦或脊髓的NSCs中識(shí) 別特定神經(jīng)元（例如表達(dá)酪氨酸羥化酶的多巴胺能神經(jīng)元和生成乙酰膽堿的膽堿能神經(jīng) 元）的有效誘導(dǎo)劑。該因子或化學(xué)品或其組合可以在NSCs的有絲分裂階段和/或分化階 段中引入。在一個(gè)實(shí)施方案中，多巴胺能表型的神經(jīng)干細(xì)胞系作為供體種群進(jìn)一步富集以 治療帕金森病。
[0121] 可以由具有所需體外分化型式（pattern)的干細(xì)胞的分離獲得各種神經(jīng)元亞型。 體外結(jié)果可以在體內(nèi)基本再現(xiàn)。這意味著干細(xì)胞的體內(nèi)潛在效力可以通過(guò)干細(xì)胞的體外分 化型式預(yù)測(cè)。在注入活的出生后對(duì)象中時(shí)，未分化或預(yù)分化狀態(tài)的NSCs在很大程度上在體 內(nèi)產(chǎn)生在體外觀察到的分化型式。因此，在體外產(chǎn)生生成酪氨酸羥化酶的神經(jīng)元的NSC也 會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生生成酪氨酸羥化酶的神經(jīng)元。相反，在體外不組成性地產(chǎn)生生成酪氨酸羥化 酶的神經(jīng)元的NSC也不會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生生成酪氨酸羥化酶的神經(jīng)元。
[0122] 但是，體外存在的分化信號(hào)與體內(nèi)的相比是有限的。因此相當(dāng)一部分的分化神經(jīng) 元可能不表達(dá)主要神經(jīng)遞質(zhì)表型。在NSCs的有絲分裂階段中或在其分化過(guò)程中可以使用 其它信號(hào)（例如來(lái)自傳入或傳出神經(jīng)元的信號(hào)或模擬這類天然信號(hào)的試劑）重構(gòu)分化表 型。NSCs具有響應(yīng)體內(nèi)以及體外存在的信號(hào)的能力。因此，一旦移植到缺血性損傷的脊 髓中，脊柱NSCs與在體外相比，生成比例高得多的GABA能神經(jīng)元。因此，NSCs是可塑的。 NSCs的這種可塑性質(zhì)是它們的多能性的特征，因此，這種可塑性可用于識(shí)別表型誘導(dǎo)劑和 識(shí)別可以進(jìn)一步與NSC種群結(jié)合以改變其性質(zhì)的方向的條件。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方案中，這種改編程序包括處理來(lái)自脊髓組織的NSCs以獲得運(yùn)動(dòng)神 經(jīng)元表型的增強(qiáng)的表達(dá)。處理?xiàng)l件包括與各種肌肉細(xì)胞或外圍神經(jīng)系統(tǒng)衍生細(xì)胞（例如神 經(jīng)嵴細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元）一起培養(yǎng)NSCs或其分化細(xì)胞。也可以用已知在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 或在脊髓中表達(dá)并生成的分子的cocktails處理NSCs以增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表型的NSC表達(dá)。
[0124] 為了誘導(dǎo)人類中腦的多巴胺能表型的NSC表達(dá)，用來(lái)自塞爾托利細(xì)胞之類細(xì)胞或 通過(guò)其篩選或組合獲得的任何其它合適的化學(xué)品或細(xì)胞的分子（例如鋰、GDNF、BDNF、多效 蛋白、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、條件培養(yǎng)基）處理NSCs。這種誘導(dǎo)能夠使移植的NSCs在體內(nèi)表達(dá) 并保持多巴胺表能表型。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法的NSCs可以包括用于移植的預(yù)分化細(xì)胞。為 了細(xì)胞的最大產(chǎn)量和為了程序的簡(jiǎn)化，收取主要包含未分化細(xì)胞種群的匯合培養(yǎng)物用于移 植。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，由于提高的細(xì)胞密度，也可以存在次要的剛開始自發(fā)分化的細(xì)胞種群。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使NSCs傳代包括從底物中收取或分離細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所公開的方法包括使用至少一種酶從底物中收取或分離細(xì)胞。當(dāng)NSCs的細(xì)胞周期時(shí)間 短到足以使細(xì)胞表面上的促細(xì)胞分裂劑受體失活時(shí)，就要避免酶處理。但是，人類NSCs的 細(xì)胞周期時(shí)間比嚙齒動(dòng)物NSCs長(zhǎng)得多，因此人類NSCs對(duì)酶處理沒(méi)有那么敏感。因此，在所 公開的方法中，使用酶處理收取來(lái)自人類的NSCs。盡管人類NSCs可以在酶處理存在下變得 臨時(shí)對(duì)促細(xì)胞分裂劑不起反應(yīng)，但促細(xì)胞分裂劑受體的反復(fù)失活會(huì)導(dǎo)致NSCs比例的降低。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在收取細(xì)胞時(shí)，通過(guò)簡(jiǎn)短離心來(lái)濃縮細(xì)胞。細(xì)胞可以進(jìn)一步在 最終臨床可用溶液（例如鹽水、緩沖鹽水）中洗滌并再懸浮，或者再懸浮在儲(chǔ)存或休眠溶液 (hibernation solution)中?；蛘?，細(xì)胞可以再懸浮在冷凍介質(zhì)，例如加有二甲亞砜的介 質(zhì)，或任何其它合適的冷凍保護(hù)劑中，并冷凍儲(chǔ)存。
[0128] 配制休眠溶液以更長(zhǎng)時(shí)間保持活細(xì)胞的存活力。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以改造儲(chǔ) 存溶液以便將活性細(xì)胞在即用制劑中船運(yùn)到移植手術(shù)地點(diǎn)以立即使用。適合將活細(xì)胞船運(yùn) 到遙遠(yuǎn)地點(diǎn)的條件還包括可以將大約〇°C至大約20°C的溫度范圍保持至少24小時(shí)的保溫 設(shè)備。在大約〇°C至大約8°C儲(chǔ)存大約24小時(shí)至大約48小時(shí)的活細(xì)胞能夠移植以治療疾 病或癥狀。
[0129] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在溶液，例如如上所述的臨床上可用的休眠或冷凍溶液中濃 縮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞濃縮至可以與細(xì)胞施用時(shí)的細(xì)胞密度相同或不同的適 當(dāng)細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用時(shí)的細(xì)胞密度可以為大約1，〇〇〇個(gè)細(xì)胞/毫升至大 約1，000, 000個(gè)細(xì)胞/毫升，這取決于諸如注射位置、注射位置的神經(jīng)變性狀況、產(chǎn)生有益 效果所必須的最小劑量和毒副作用考慮因素之類的因素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方 法包括以大約5, 000至大約50, 000個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度注射細(xì)胞。
[0130] 用于使擴(kuò)增的細(xì)胞懸浮以輸送到治療區(qū)域的介質(zhì)體積在此被稱作注射量。注射量 取決于注射位置和組織的變性狀況。更具體地，注射量的下限可以由高細(xì)胞密度的粘性懸 浮液的實(shí)際液體操作以及細(xì)胞的簇生趨勢(shì)決定。注射量的上限可以由注射量所施加的避免 損傷宿主組織所必須的壓力限度以及實(shí)際手術(shù)時(shí)間決定。
[0131] 使用已知方法的供體細(xì)胞的低細(xì)胞存活導(dǎo)致必須將大量細(xì)胞輸送到相對(duì)較小的 區(qū)域上以努力實(shí)現(xiàn)有效治療。但是，注射量是施加在宿主組織上的靜水壓力，與高注射量聯(lián) 系在一起的長(zhǎng)注射時(shí)間加劇了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。此外，供體細(xì)胞的過(guò)量注射導(dǎo)致宿主薄壁組織的 受壓和隨后的損傷。在試圖補(bǔ)償體積限制時(shí)，已知方法要求制備高細(xì)胞密度的注射用懸浮 液。但是，高細(xì)胞密度促進(jìn)了移植的細(xì)胞的緊密簇生并抑制了細(xì)胞遷移或擴(kuò)散，從而使有效 治療不能超出有限區(qū)域并損害了無(wú)縫結(jié)合到宿主組織中。
[0132] 相反，由于通過(guò)本公開的方法制成的細(xì)胞的改進(jìn)的體內(nèi)存活，每次注射需要較少 數(shù)量的細(xì)胞。實(shí)際上，在從注射時(shí)間開始六個(gè)月后，已經(jīng)證明存在多達(dá)三至四倍的注射細(xì)胞 數(shù)，這表明使用本公開的方法顯著的量化存活。此外，由于這種量化存活，可以實(shí)現(xiàn)所需細(xì) 胞劑量的可再現(xiàn)施用。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞濃縮至大約1，〇〇〇至大約200, 000 個(gè)細(xì)胞/毫升的密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于有效移植，使用大約5, 000至大約50, 000 個(gè)細(xì)胞/毫升。在另一實(shí)施方案中，使用大約10, 〇〇〇至30, 000個(gè)細(xì)胞/毫升。在一個(gè)實(shí) 施方案中，細(xì)胞可以以每個(gè)注射位置小于大約100毫升的注射量懸浮輸送到治療區(qū)域。例 如，在人類對(duì)象的神經(jīng)變性癥狀的治療中，可以沿脊柱束雙側(cè)進(jìn)行多次注射，可以使用每個(gè) 注射位置0. 1和大約100暈升的注射量。
[0133] 在所公開的方法中可以使用任何適用于將細(xì)胞注入所需區(qū)域的器件。在一個(gè)實(shí)施 方案中，使用能夠隨時(shí)間經(jīng)過(guò)以基本恒定的流速輸送亞微升量的注射器。細(xì)胞可以通過(guò)針 或軟管或任何其它合適的輸送裝置裝載到該器件中。
[0134] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療神經(jīng)變性癥狀的所需注射位置包括至少一個(gè)脊髓區(qū) 域。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞移植到脊髓的至少一個(gè)特定節(jié)段或區(qū)域中，例如脊髓的頸 部、胸部或腰部區(qū)域。在腰部區(qū)域中，例如，僅有5對(duì)神經(jīng)根橫穿椎骨的多骨管道，其中每對(duì) 神經(jīng)根在大范圍分布的每一腰部level處離開脊柱。由于脊髓腰部區(qū)域中較低的神經(jīng)根密 度，腰部區(qū)域特別適合提供細(xì)胞注射的安全位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在脊髓薄壁組織 的中間區(qū)域中移植。
[0135] 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在大約5至大約50個(gè)位置注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì) 胞在脊髓每側(cè)各大約10至大約30個(gè)位置注射。至少兩個(gè)位置可以相隔大約100微米至大 約5000微米。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射位置之間的距離為大約400至大約600微米?？梢?根據(jù)在整個(gè)脊柱段中生成基本不間斷和鄰接的供體細(xì)胞和根據(jù)經(jīng)證實(shí)在大鼠或豬之類的 動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)現(xiàn)大約2-3個(gè)月存活的注射平均量來(lái)確定注射位置之間的距離。在一個(gè)實(shí) 施方案中，沿脊髓中線的兩側(cè)注射細(xì)胞以跨越可用于治療痙攣癥狀/僵硬或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存 活的至少數(shù)個(gè)腰段的長(zhǎng)度?？梢杂蓜?dòng)物模型中的結(jié)果推斷在人體內(nèi)的確切注射量。
[0136] 在一個(gè)實(shí)施方案中，注射的目標(biāo)位置是脊髓的灰質(zhì)。在灰質(zhì)內(nèi)，可以插入針尖，從 而在特定的薄層（lamina)位置沉積NSCs。例如，為了輸送GABA/甘氨酸能神經(jīng)元以治療痙 攣狀態(tài)/僵硬，將NSC輸送到包含薄層V-VII的區(qū)域中?；蛘撸梢詫SC輸送到各種脊柱 節(jié)段（從頸部到腰部）的灰質(zhì)的背角中或其附近，以治療神經(jīng)性疼痛或慢性疼痛。或者，可 以將NSCs輸送到各種脊柱節(jié)段（從頸部到腰部）的灰質(zhì)的腹角中或其附近，以治療運(yùn)動(dòng)神 經(jīng)元疾病，例如ALS。
[0137] 所公開的方法的細(xì)胞可以在體內(nèi)生成大量神經(jīng)元。當(dāng)NSC在移植之前沒(méi)有明顯 預(yù)分化時(shí)，NSCs可以在分化之前在體內(nèi)增殖多達(dá)2至4次細(xì)胞分裂，由此進(jìn)一步增加有效 供體細(xì)胞的數(shù)量。在分化時(shí)，神經(jīng)元分泌特定神經(jīng)遞質(zhì)。此外，神經(jīng)元將生長(zhǎng)因子、酶和對(duì) 不同癥狀有益的其它蛋白質(zhì)或物質(zhì)分泌到體內(nèi)移植物周圍的環(huán)境（mileu)中。因此，因?yàn)?移植的細(xì)胞在體內(nèi)生成大量神經(jīng)元的能力和由于神經(jīng)變性癥狀可以由包括神經(jīng)元衍生成 分（element)在內(nèi)的成分缺失引起或?qū)е逻@種成分缺失，可以通過(guò)所公開的方法治療多種 病癥。因此，通過(guò)所公開的方法可以有效地治療由于缺乏這類神經(jīng)元衍生成分，例如生長(zhǎng)因 子、酶和其它蛋白質(zhì)而患有CNS組織變性的患者。
[0138] 與移植的神經(jīng)元分泌的生長(zhǎng)因子、酶和其它蛋白質(zhì)或物質(zhì)響應(yīng)的癥狀包括遺傳性 溶酶體病，例如 Tay-Sach' s 病、Niemann-Pick' s 病、Batten' s 病、Crabb' s 病、共濟(jì)失調(diào) 和其它。
[0139] 此外，所公開的治療方法包括移植體外擴(kuò)增的細(xì)胞，其可以替換受損或變性的神 經(jīng)元，提供對(duì)其它神經(jīng)元的抑制性或刺激性作用和/或釋放出有助于神經(jīng)元再生的營(yíng)養(yǎng)因 子。
[0140] -個(gè)實(shí)施方案包括供應(yīng)其它運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作為受損或變性神經(jīng)元的替代物。例如， 所公開的方法包括在脊髓空洞內(nèi)提供充足的神經(jīng)下部構(gòu)造以填充空穴。神經(jīng)下部構(gòu)造如果 能夠減緩與由外傷性脊柱損傷、遺傳性癥狀或任何其它病因引起的脊髓空洞癥有關(guān)的脊髓 空洞擴(kuò)大，其就是適當(dāng)?shù)摹?yīng)該認(rèn)識(shí)到，提供適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)下部構(gòu)造也有助于緩解變性脊髓引 起的其它并發(fā)癥。
[0141] 并非所有NSCs都可治療給定疾病。在不同疾病中受影響的神經(jīng)元種群的類型可 以不同。因此，治療有效性的NSCs供體種群有助于替換缺失的神經(jīng)單元。例如，痙攣狀態(tài)、 癲癇發(fā)作、運(yùn)動(dòng)障礙和其它肌肉活動(dòng)過(guò)度障礙的治療可以包括提供治療有效量的能夠分化 成生成GABA或甘氨酸的抑制性神經(jīng)元的細(xì)胞。通過(guò)檢查分化的神經(jīng)元表型，可以在體外評(píng) 估NSCs的不同種群。然后不僅在適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)遞質(zhì)表型方面，還在神經(jīng)元的適當(dāng)形態(tài)、遷移 和其它表型特征方面，使用體外分化型式預(yù)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生適當(dāng)表型的效力。
[0142] 在一個(gè)實(shí)施方案中，移植能夠生成與癥狀病因相關(guān)性受損或受傷神經(jīng)元亞型相對(duì) 應(yīng)的神經(jīng)元亞型的NSCs。例如，對(duì)象中激感回路的活動(dòng)過(guò)度可能由遺傳癥狀或神經(jīng)元損傷 引起--該神經(jīng)元損傷來(lái)自脊髓外傷、胸/胸腹主動(dòng)脈手術(shù)、中風(fēng)、癲癇、腦外傷、亨廷頓氏 舞蹈癥、膀胱失禁、活動(dòng)過(guò)度的腸運(yùn)動(dòng)和由受傷或遺傳性癥狀引起的肌肉的任何其它不受 控收縮。與脊髓不同地，痙攣狀態(tài)、癲癇發(fā)作或其它活動(dòng)過(guò)度在腦中由于許多不同的病源而 出現(xiàn)。病灶性癲癇被認(rèn)為起因于缺乏對(duì)回路的GABA exerting tonal控制而引起的失調(diào)活 動(dòng)過(guò)度。為此，公開的方法包括通過(guò)移植體外擴(kuò)增的NSCs在受影響的區(qū)域中提供抑制性神 經(jīng)遞質(zhì)，例如GABA或甘氨酸。在痙攣狀態(tài)、癲癇發(fā)作和其它活動(dòng)過(guò)度的情況下，在體內(nèi)生成 能夠分化成抑制性神經(jīng)元，例如GABA能或甘氨酸能神經(jīng)元的許多NSC以待移植，從而減弱 與痙攣狀態(tài)、癲癇發(fā)作和其它神經(jīng)活動(dòng)過(guò)度相關(guān)的至少一條活動(dòng)過(guò)度的神經(jīng)回路。所公開 的方法因此可用于治療癲癇癥和類似的癲癇發(fā)作癥狀。
[0143] 所公開的方法還可用于治療由腦缺血引起的局部麻痹、麻痹、痙攣狀態(tài)、僵硬或任 何其它運(yùn)動(dòng)、表達(dá)或認(rèn)知征候。腦缺血可以由于腦部中風(fēng)引起或由心臟病發(fā)作引起，在此腦 血液循環(huán)中斷相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。因此，其與上述脊髓缺血類似。一些中風(fēng)患者產(chǎn)生中樞來(lái)源 的發(fā)作以及其它缺陷，例如記憶喪失、麻痹或局部麻痹。這些來(lái)自腦缺血的缺陷也可能由于 海馬狀突起和/或腦區(qū)域中抑制性中間神經(jīng)元的選擇性缺失引起。因此，所公開的方法可 用于治療患有局部麻痹、麻痹、痙攣狀態(tài)或其它運(yùn)動(dòng)、表達(dá)或認(rèn)知征候的中風(fēng)患者。
[0144] 在局部麻痹、馳緩性截癱和其它與肌肉收縮控制的損失相關(guān)的癥狀（例如由ALS、 外傷性脊髓損傷、缺血性損傷或遺傳性癥狀引起的那些）中，所公開的方法包括提供神經(jīng) 元移植以發(fā)揮充足的營(yíng)養(yǎng)影響，從而減緩運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失。特別地，所公開的方法促進(jìn) 了移植的NSCs分泌營(yíng)養(yǎng)分子的能力，這些營(yíng)養(yǎng)分子可以在最佳生物利用率的條件下輸送 到變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中。這類營(yíng)養(yǎng)分子包括exocitosed超氧化物歧化酶，例如超氧化物歧 化酶（S0D1)、溶酶體酶、和非proteinatious分子，例如細(xì)胞生成的抗氧化劑。移植的細(xì)胞 分泌的其它營(yíng)養(yǎng)因子可以包括global細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子（BDNF)、血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、多效蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、促紅細(xì)胞生長(zhǎng) 素、midkine、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (IGF-1)、和胰島素樣生長(zhǎng)因子2 (IGF-2)或任何 其它有益的營(yíng)養(yǎng)成分。
[0145] 對(duì)所公開的方法治療多種神經(jīng)變性癥狀的能力有所幫助的另一因素包括NSC分 化細(xì)胞沿現(xiàn)有神經(jīng)元纖維大面積遷移的能力。移植細(xì)胞的遷移導(dǎo)致供體神經(jīng)元和/或神經(jīng) 膠質(zhì)的全面分布和結(jié)合以及這類細(xì)胞分泌的治療成分的全面或分散性供應(yīng)。
[0146] 細(xì)胞的廣泛遷移能夠使關(guān)鍵的治療性蛋白質(zhì)和物質(zhì)全面和穩(wěn)定地輸送到有需要 的對(duì)象的整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)和體內(nèi)。由此，所公開的細(xì)胞是治療性蛋白質(zhì)和物質(zhì)的有效輸送載 體。對(duì)于這類輸送目的，所公開的方法包括將細(xì)胞移植到神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的各個(gè)位置，包括CNS 薄壁組織、心室、硬膜下、鞘內(nèi)和硬膜外腔、外圍神經(jīng)系統(tǒng)位置，以及移植到神經(jīng)系統(tǒng)外的區(qū) 域中，例如腸、肌肉、血管內(nèi)系統(tǒng)和皮下位置。
[0147] 實(shí)施例1.人類脊髓神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的擴(kuò)增
[0148] 獲得來(lái)自大約7-8. 5周胎齡的至少一個(gè)供體的脊髓。使用機(jī)械研制在不合Ca++ 和Mg++的磷酸鹽緩沖鹽水中離解該脊髓的單一連續(xù)組織。然后將所得細(xì)胞懸浮液接種到 用聚-L-鳥氨酸或聚-D-賴氨酸和人類纖連蛋白或其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白預(yù)涂的組織培養(yǎng)板 中。將組織培養(yǎng)物處理過(guò)的板或燒瓶用100微克/毫升聚-D-賴氨酸在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。 然后將它們用水洗滌三次并干燥。然后將它們用25毫克/毫升在室溫培養(yǎng)5分鐘。有時(shí)， 在室溫使用10毫克/毫升纖連蛋白1小時(shí)。有時(shí)，在37°C使用1毫克/毫升纖連蛋白18小 時(shí)。用1種人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)補(bǔ)充由N2(DMEM/F12加上胰島素、轉(zhuǎn)鐵 蛋白、硒、腐胺和孕酮）構(gòu)成的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用〇. 1納克/毫升-100 納克/毫升的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，最好使用10納克/毫升的bFGF。
[0149] 所得初始培養(yǎng)物由后有絲分裂和增殖NSCs以單層形式構(gòu)成。隨后，在培養(yǎng)大約5 至大約20天后，分裂的巢蛋白陽(yáng)性NSCs在培養(yǎng)物中超過(guò)未分裂的神經(jīng)元或緩慢分裂的神 經(jīng)膠質(zhì)。在這些培養(yǎng)條件下，NSCs選擇性地偏向擴(kuò)增。通過(guò)溫和酶處理，例如使用胰朊酶， 使擴(kuò)增的NSC種群傳代。將細(xì)胞在不含血清或基本不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。盡管細(xì)胞可 以忍受低濃度血清，但最好避免使細(xì)胞接觸血清，因?yàn)檠搴性S多促進(jìn)NSCs的神經(jīng)膠質(zhì) 分化的細(xì)胞因子，例如LIF和CNTF。由此，在傳代過(guò)程中，通過(guò)添加特定酶抑制劑，例如胰朊 酶抑制劑而非血清，終止所用的酶。在每次傳代時(shí)，計(jì)數(shù)收取細(xì)胞的數(shù)量，并將一部分重新 接種以進(jìn)一步擴(kuò)增。如圖1中所示，使用本發(fā)明的方法，人類NSCs可以在數(shù)量上擴(kuò)增1018 倍，同時(shí)保持其生長(zhǎng)和分化性能。細(xì)胞可以可再現(xiàn)地?cái)U(kuò)增。如圖1中所示，以細(xì)胞的可再現(xiàn) 生長(zhǎng)曲線和倍增時(shí)間將細(xì)胞的連續(xù)傳代重復(fù)三次。在擴(kuò)增過(guò)程中，幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)巢 蛋白--有絲分裂神經(jīng)上皮細(xì)胞的體內(nèi)標(biāo)記物，且不含分化神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的抗原，例 如3型β微管蛋白和GFAP。該細(xì)胞通過(guò)免疫染色對(duì)PSA-NCAM(committed神經(jīng)元族蛋白 的一種可能的標(biāo)記物）、〇4和GalC (少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物）和RC2 (放射神經(jīng)膠質(zhì)的標(biāo)記 物）呈陰性。因此，通過(guò)免疫染色測(cè)定，NSCs在整個(gè)延長(zhǎng)的擴(kuò)增周期內(nèi)穩(wěn)定地保持它們的 抗原profile表達(dá)。形態(tài)和桌蛋白表達(dá)的例子分別顯不在圖2A和B中。
[0150] 實(shí)施例2.人類脊髓神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的分化
[0151] 在NSCs擴(kuò)增過(guò)程中的任何時(shí)候，通過(guò)提取培養(yǎng)物中的促細(xì)胞分裂劑，例如bFGF， 可以使培養(yǎng)物分化。NSCs的分化在去除促細(xì)胞分裂劑后大約1-3天發(fā)生，并表現(xiàn)出獨(dú)特 的異源（heterogeneous)細(xì)胞形態(tài)。到分化大約4-7天，可以通過(guò)免疫染色使非特異性抗 原，例如MAP2c、tau和III型β微管蛋白直觀化。到大約12-14天，在整個(gè)培養(yǎng)物中明顯 表現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的束狀軸突以及亞細(xì)胞蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)那宄O化。到大約28天，突觸蛋白，例如 synapsin和synaptophysin，局限到軸突終端，表現(xiàn)為點(diǎn)狀染色?？梢蕴峁┬切渭?xì)胞的另一 飼養(yǎng)層以進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元的長(zhǎng)期成熟。如圖3中所示，人類脊柱NSCs的分化產(chǎn)生神經(jīng)元 與神經(jīng)膠質(zhì)的混合培養(yǎng)物,其中神經(jīng)元強(qiáng)勁地表達(dá)神經(jīng)元特異性抗原，例如tau、MAP2ab (A) 和3型β微管蛋白（B)，并構(gòu)成培養(yǎng)物的大約50%。如圖3B中所示，培養(yǎng)物自發(fā)生成伸長(zhǎng) 數(shù)厘米的長(zhǎng)的成束的軸突束。如圖3C中所示，相當(dāng)大比例的神經(jīng)元是GABA能的。培養(yǎng)物 中也存在膽堿能的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（圖3D)。培養(yǎng)物中明顯存在GABA神經(jīng)元預(yù)示了人類脊柱 NSCs用于治療由特定回路中GABA生成量的降低引起的各種神經(jīng)病癥狀的有用性。同樣地， 膽堿能神經(jīng)元的存在表明人類脊髓NSCs能夠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化并預(yù)示了其用于治療由 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的逐漸變性引起的各種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的有用性。對(duì)治療而言，使NSC在有或 沒(méi)有進(jìn)一步表型增強(qiáng)狀況的情況下擴(kuò)增，收取并注入有缺陷的神經(jīng)區(qū)域。
[0152] 實(shí)施例3.人類中腦神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的擴(kuò)增
[0153] 獲得7-8. 5周胎兒胎齡的一個(gè)中腦組織。如實(shí)施例1所述獲得來(lái)自中腦組織的 NSCs。細(xì)胞經(jīng)過(guò)160天純培養(yǎng)期連續(xù)傳代，且所得擴(kuò)增顯示在圖4中。在整個(gè)擴(kuò)增期間，NSCs 穩(wěn)定地保持其多能性和神經(jīng)原性潛能以及它們的分化潛能，從而產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元。通 過(guò)酪氨酸羥化酶（TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT)的神經(jīng)元表達(dá)評(píng)定多巴胺能神經(jīng)元。
[0154] DAT表達(dá)是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志。通過(guò)測(cè)量其穿過(guò)培養(yǎng)中的分化神經(jīng)元的突觸 膜輸送放射性同位素標(biāo)記的多巴胺的作用，可以評(píng)定神經(jīng)元中的DAT表達(dá)。通過(guò)放射性同 位素標(biāo)記的多巴胺吸收（uptake)檢定法，評(píng)定DAT在來(lái)自分化人類中腦NSCs和單克隆衍 生人類中腦NSCs的培養(yǎng)物中的作用。檢定結(jié)果表明了人類中腦NSCs的強(qiáng)勁的功能性多巴 胺能活性。此外，其表明，特別傾向于在分化時(shí)產(chǎn)生更高比例多巴胺能神經(jīng)元的分離出的 NSC單克隆種群可以使多巴胺能表型富集（圖5)。
[0155] 產(chǎn)生富集的多巴胺能神經(jīng)元的NSCs特別可用于治療帕金森病。類似地，在從用于 特定表型的增強(qiáng)的分化的組織中分離出來(lái)時(shí)預(yù)編程的NSCs可用于分離其它特定的所需神 經(jīng)元，例如可用于治療阿爾茨海默氏癥的前腦膽堿能神經(jīng)元、可用于治療神經(jīng)元疾?。ɡ?如ALS)的脊柱膽堿能神經(jīng)元、可用于治療抑郁的血清素能神經(jīng)元、和可用于治療癲癇和亨 廷頓氏舞蹈病的GABA能神經(jīng)元。
[0156] 實(shí)施例4.人類中腦神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的分化。
[0157] 人類中腦NSCs/祖細(xì)胞可以如實(shí)施例2中所述分化。在NSCs的有絲分裂過(guò)程中或 在其分化過(guò)程中，可以通過(guò)用含有各種外源因子的培養(yǎng)物處理來(lái)增加所需表型的比例。能 夠增加來(lái)自人類中腦NSCs的多巴胺能表型的這類因子的例子是如圖6A和6B所示的來(lái)自 塞爾托利細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
[0158] 在圖6A和6B所示的研究中，將冷藏的神經(jīng)干細(xì)胞解凍并以每孔40, 000個(gè)細(xì)胞 的密度在存在促細(xì)胞分裂劑的4-孔室載玻片中平板接種，并使其增殖6天，此時(shí)取出促細(xì) 胞分裂劑并使細(xì)胞分化8天。細(xì)胞根據(jù)與塞爾托利細(xì)胞條件培養(yǎng)基（SCCM，在N2a中稀釋 1 : 1)接觸的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間分裂成四組。一組在增殖和分化期間與SCCM接觸（條件 1);第二組僅在增殖期間接觸（條件2);第三組僅在分化期間接觸（條件3);第四組不接 觸SCCM(對(duì)照物或cont.)。每隔一天更換培養(yǎng)基，并在增殖階段每天添加促細(xì)胞分裂劑。 每種條件維持四個(gè)孔以允許對(duì)多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行染色，并測(cè)試三個(gè)細(xì)胞系：796MB、527MB和 566SC。來(lái)自脊髓的566SC細(xì)胞不具有可測(cè)得的TH陽(yáng)性神經(jīng)元，從圖中省略。
[0159] 在分化時(shí)，使用4%低聚甲醛固定細(xì)胞并使用抗MAP2抗體[AP20無(wú)性系（Sigma)， 其識(shí)別MAP2ab亞型]、神經(jīng)元特異性β -微管蛋白[Tujl (Covance)]和酪氨酸輕化酶 (Pel-Freez)以及GFAP(Dako)和GalC(Chemicon)免疫染色。使用40x物鏡計(jì)數(shù)免疫染色 的細(xì)胞，且對(duì)于每個(gè)孔，計(jì)數(shù)至少三個(gè)視場(chǎng)。在分析保持在任何條件下的細(xì)胞時(shí)都幾乎或完 全沒(méi)有檢測(cè)出GFAP+或GalC+細(xì)胞，因此這些抗原從分析中排除。此外，566SC細(xì)胞在保持 在所述條件下之后太密而不能測(cè)定數(shù)量，其不包括在最終分析中。
[0160] 分析表明，用外源因子處理可以影響人類中腦NSCs，從而搜尋有用的蛋白質(zhì)因子 或化學(xué)品以進(jìn)一步富集多巴胺能神經(jīng)元。由此，可以使用人類NSCs有效篩選新型合成/天 然化學(xué)品和蛋白質(zhì)因子以獲得特別有用的用于治療特定適應(yīng)癥（例如帕金森氏病）的種 群。
[0161] 實(shí)施例5.通過(guò)人類脊柱神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的移植治療大鼠的痙攣狀態(tài)和僵硬
[0162] 為了引發(fā)暫時(shí)脊髓缺血，使用之前在Taira，（1996)中所述的技術(shù)。Sprague Dawley(SD)大鼠在氟烷（1. 5% )中麻醉。將2Fr Fogarty 導(dǎo)管穿入左股動(dòng)脈并經(jīng)降主 動(dòng)脈到達(dá)左側(cè)鎖骨下動(dòng)脈位置。為了測(cè)量主動(dòng)脈血流阻斷下方的遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓力（DBP)，在尾 動(dòng)脈中插入聚乙烯（PE-50)導(dǎo)管。
[0163] 在用0. 05毫升鹽水充填主動(dòng)脈內(nèi)氣囊導(dǎo)管時(shí)引發(fā)脊髓缺血。通過(guò)從插有PE-50 導(dǎo)管的頸動(dòng)脈中抽取一部分動(dòng)脈血（10. 5-llcc)，再現(xiàn)主動(dòng)脈血流阻斷期間的全身低血壓。 用此方法可以引發(fā)大約40mm Hg的全身低血壓。血流阻斷的效力表現(xiàn)為在尾動(dòng)脈中測(cè)得的 DBP的立即和持續(xù)下降。在引發(fā)脊髓缺血大約10分鐘后，使氣囊癟塌，重新輸入從頸動(dòng)脈中 提取的血液。當(dāng)動(dòng)脈血壓穩(wěn)定（在回流后大約20-30分鐘內(nèi)），去除動(dòng)脈管路，并將創(chuàng)口封 閉。
[0164] 在引發(fā)脊髓缺血后，以大約2天間隔使用改性21點(diǎn)戶外運(yùn)動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)（BBB標(biāo)準(zhǔn)）評(píng) 定運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。僅選擇BBB分?jǐn)?shù)為0-4的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組的移植研究。
[0165] 在缺血性損害后的大約7-21天，將BBB分?jǐn)?shù)為0-4的痙攣大鼠在室內(nèi)空氣中用 1.5-2%氟烷麻醉并放在脊柱裝置上。然后進(jìn)行Thll-L2椎骨的部分椎板切除術(shù)。將頂圓 直徑為80至100微米的玻璃毛細(xì)管連接到壓控微量注射器上。每次注射時(shí)對(duì)大鼠注射0. 5 微升含有5, 000、10, 000、15, 000或20, 000個(gè)人類神經(jīng)干細(xì)胞/組細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。每 一大鼠在脊髓各側(cè)（左側(cè)和右側(cè)）上接受總共6-8次注射，它們均勻分布在暴露出的L2-L6 節(jié)段之間。注射中心定為中心灰質(zhì)（薄層V-VII)(與L3位置的脊髓背部表面的距離：1毫 米）。在移植之后，用3% H202和青霉素/鏈霉素混合物清洗并用2層封閉。然后使大鼠 恢復(fù)。
[0166] 在脊柱移植之前大約3天，在所有動(dòng)物中開始用FK_506(Prograf ;Fujisawa ;1毫 克/千克；腹腔內(nèi)注射）進(jìn)行免疫抑制治療。在移植之后，動(dòng)物在整個(gè)存活期內(nèi)每天接受 免疫抑制治療?？梢杂肍K-506有效防止這些移植物的免疫排斥。大鼠存活大約2或7周 (對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，η = 5)。
[0167] 在存活期結(jié)束時(shí)，將大鼠用戊巴比妥（40毫克/千克；腹腔內(nèi)注射）麻醉并用肝素 化鹽水經(jīng)心臟灌注1-2分鐘，然后用在0. 1M磷酸鹽緩沖液（PB)中的4%低聚甲醛經(jīng)心臟灌 注。切開脊髓并在相同的固定劑中在4°C后固定過(guò)夜。在后固定之后，將脊髓組織冷藏在分 級(jí)蔗糖溶液（10、20和30%)中總共三天。然后切割冷凍的冠狀、縱側(cè)或水平切片（10-20微 米）。對(duì)于免疫組織化學(xué)，將自由浮動(dòng)切片（30微米）在含有5 %正常羊血清（NGS)，0. 2 % TritonXlOO(TX)的PBS，0. 1Μ(ρΗ = 7.4)中在室溫下放置2小時(shí)以阻斷非特異性蛋白質(zhì)活 性。然后在4°C用各種人類特異性一抗培養(yǎng)過(guò)夜。
[0168] 在用一抗培養(yǎng)之后，將切片在PBS中洗滌3遍，并用結(jié)合到熒光標(biāo)記（Alexa488或 594 ;4微升/毫升；Molecular Probes)上的第二羊抗兔或鼠抗體培養(yǎng)。所有阻斷和抗體 制品在0. 1M PBS/0. 2% TX/5% NGS中制造。對(duì)于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，同時(shí)施用來(lái)自不同物種的一 抗，然后施用與不同熒光標(biāo)記結(jié)合的二抗。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，省略一抗。對(duì)于普通核染色，將 DAPI (3微升/毫升）添加到最終二抗溶液中。在染色后，將切片在室溫干燥并用Prolong anti-fade 試劑盒（Molecular Probes)覆蓋。
[0169] 使用Leica突光顯微鏡分析載玻片。用Olympus數(shù)碼相機(jī)捕捉圖象（512X512象 素）并用 Adobe Photoshop5. 5 (Adobe Systems，MountainView，CA)加工。為了證實(shí)不同 抗體在雙重染色切片中的共位性，用包括安裝在Nikon顯微鏡（Applied Precision, Inc.) 上的PhotometricsCO)的DeltaVision deconvolution顯微鏡系統(tǒng)捕捉圖象。一般而言， 截取相隔〇. 1或〇. 2微米的六十個(gè)光學(xué)切面。所用透鏡是2〇X、4〇X和60x(NA1.3)。使用 SoftWorx 軟件（Applied Precision, Inc)在 Silicon Graphics Octane 工作站上將數(shù)據(jù)組 去卷積和進(jìn)行分析。
[0170] 使用體視學(xué)無(wú)偏見和系統(tǒng)的采樣，評(píng)估對(duì)人類核NUMA抗體呈免疫反應(yīng)性的 移植神經(jīng)元的總數(shù)。在應(yīng)用fractionator采樣方案后，使用取自L2-L6脊柱節(jié)段 的各個(gè)第十預(yù)先染色的切片進(jìn)行體視學(xué)量化。使用數(shù)值孔徑1. 3的ΙΟΟχ油浸物鏡 通過(guò)Leica DMLB顯微鏡獲得光學(xué)圖象（1微米厚）。使用與StagePro-control led motorized Z stage (MediaCybernetics) 一起供應(yīng)的數(shù)碼相機(jī)（Olympus)和 ImagePro 軟 件（MediaCybernetics)捕捉光學(xué)圖象。然后米用 fractionator 公式 N = QX 1/hsf X 1/ asf X 1/ssf計(jì)算移植細(xì)胞數(shù)，其中N是陽(yáng)性核總數(shù)，Q是計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)，hsf是height sampling fraction, asf 是 area sampling fraction, ssf 是 slice sampling fraction。
[0171] 為了提供移植人類NSCs在缺血性脊髓中的三維重建視圖，使用取自連續(xù)切割的 脊髓的預(yù)存圖象。對(duì)于三維重建，平均使用大約60-100個(gè)連續(xù)切片。在第一步驟中，使用 Ellipase軟件打開一堆連續(xù)圖象，并使用客戶研發(fā)的排列組件（custom developed Align module) (VidiTo，SK)排列。排列方法包括在所有連續(xù)脊髓圖象中確定兩個(gè)形態(tài)參考點(diǎn)（第 一點(diǎn)：中央管的中心；第二點(diǎn)：背角的內(nèi)側(cè)緣），隨后進(jìn)行所有圖象的電腦加工的排列。為了 確定背角和腹角的邊緣，使用Laminar Mapmodule (Ellipse)在預(yù)先排列的圖象堆上畫出線 條。最后，使用3-D構(gòu)造器（Media Cybernetics)將這堆預(yù)先排列和laminar maps標(biāo)記過(guò) 的圖象用于三維重建。
[0172] 人類脊柱NSCs在大鼠星形細(xì)胞上培養(yǎng)2至3周，這表現(xiàn)出多數(shù)培養(yǎng)物中神經(jīng)元表 型的時(shí)間依賴型成熟和發(fā)育。這通過(guò)用抗NSE或M0C的人類特異性抗體染色來(lái)證實(shí)。還識(shí) 別出具有充分形成的軸樹的許多神經(jīng)元。多數(shù)（85-90% )NSE陽(yáng)性神經(jīng)元是GABA陽(yáng)性的。 在一些MOC陽(yáng)性神經(jīng)元中觀察到在軸突和樹突中的突觸體素表達(dá)。
[0173] 觀察到在缺血性損傷后21天移植的細(xì)胞的強(qiáng)勁存活。這表現(xiàn)為清楚識(shí)別出的對(duì) NUMA、M0C或NSE，所有人類特異性抗體呈免疫反應(yīng)性的雙側(cè)移植物。取自移植脊髓節(jié)段的 水平切片的分析顯示出NUMA陽(yáng)性細(xì)胞在各個(gè)注射位置之間的清楚遷移。大部分NUMA陽(yáng)性 細(xì)胞表現(xiàn)出共位性以及M0C免疫反應(yīng)性。
[0174] 用共焦顯微術(shù)分析的帶有NUMA和GABA抗體的脊髓切片的雙標(biāo)記顯露出平均 25-35% GABA陽(yáng)性細(xì)胞。在存活七周的所有移植動(dòng)物中看到GABA能表型的一致表達(dá)。
[0175] 在相同時(shí)間點(diǎn)（S卩，移植后七周），用突觸體素和NUMA抗體的雙重染色顯示移植物 內(nèi)致密的突觸體素陽(yáng)性網(wǎng)絡(luò)。
[0176] NUMA陽(yáng)性細(xì)胞只偶爾表現(xiàn)出與GFAP抗體的共位性。這些細(xì)胞通常局限在移植物 外圍。
[0177] NUMA陽(yáng)性細(xì)胞的體視學(xué)評(píng)測(cè)表明在各個(gè)移植物中平均75, 460±5, 697個(gè)持久介 質(zhì)細(xì)胞。這表明比最初注射的細(xì)胞多了平均3-3. 6倍。細(xì)胞周期抗原，Ki67,是積極有絲 分裂細(xì)胞的標(biāo)記物。在移植后2或7周時(shí)脊髓節(jié)段的染色僅在移植后2周時(shí)表現(xiàn)出hKi67 免疫反應(yīng)性。在存活7周時(shí)，細(xì)胞只偶爾為Ki67陽(yáng)性的。這些結(jié)果表明，移植的人類脊柱 NSCs和它們的后代以等于最初兩周的平均大約三次細(xì)胞倍增的數(shù)量擴(kuò)增，其隨后變成后有 機(jī)分裂性的并穩(wěn)定地并入。
[0178] 使用取自用M0C抗體和DAPI染色的40微米厚連續(xù)脊髓切片（總數(shù)為150-200個(gè) 切片）的圖象進(jìn)行移植的LE-L5區(qū)段的體積重建。三維移植物重建顯示出分布在灰質(zhì)范圍 內(nèi)的充分識(shí)別的rostrocaudally取向M0C陽(yáng)性移植。如圖7和圖8中所示，移植細(xì)胞并用 BBB評(píng)分測(cè)量恢復(fù)運(yùn)動(dòng)益處，由此評(píng)估人類脊髓NSCs的功能作用。
[0179] 對(duì)于在本研究中觀察到的行為恢復(fù)程度，我們已經(jīng)在移植后觀察了三個(gè)主要組。 第一，表現(xiàn)出最強(qiáng)勁的恢復(fù)和行走能力的動(dòng)物（BBB < 16)，第二，下肢所有3個(gè)關(guān)節(jié)的積極 運(yùn)動(dòng)性表現(xiàn)出改進(jìn)但不能站立的動(dòng)物（BBB大約8)，和第三組，沒(méi)有表現(xiàn)出任何恢復(fù)的動(dòng)物 (即，無(wú)響應(yīng)者）。盡管對(duì)移植的響應(yīng)性不同的原因尚不清楚，但我們推測(cè)，與dysinhibited 初級(jí)神經(jīng)末端和/或α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相對(duì)的移植位置的差異可能起到一定作用。此外，應(yīng) 該指出，動(dòng)物在本研究中僅存活3個(gè)月。我們推測(cè)，移植后的長(zhǎng)期存活和持續(xù)身體康復(fù)可能 與較高的功能恢復(fù)程度相關(guān)。無(wú)論如何，與治療組相反，在僅注射介質(zhì)的任何動(dòng)物中都沒(méi)有 觀察到顯著的恢復(fù)。
[0180] 實(shí)施例6.通過(guò)人類脊柱NSCs的移植治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病
[0181] 所公開的方法的NSCs提供了有力和顯著的臨床和生物學(xué)益處。為此，所公開的 方法能夠治療在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中散布的癥狀，例如ALS，以及局限在特定區(qū)域中的癥 狀，例如上述脊髓缺血。在ALS中，盡管腰索中的移植可能省略節(jié)段性運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的其它重要 部分，即負(fù)責(zé)呼吸運(yùn)動(dòng)的頸部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元柱，但所公開的在脊髓中移植NSCs的方法促進(jìn)了 BDNF和⑶NF和其它因子從移植細(xì)胞中釋放到CSF中，在此對(duì)整個(gè)脊髓中的宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 產(chǎn)生更廣的作用。
[0182] 已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，移植到神經(jīng)變性脊髓環(huán)境的腰段的人類NSCs的部分移植 物存活，進(jìn)行大量的神經(jīng)元分化并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和在移植位置和其它位置發(fā)揮作 用。NSCs顯著延緩癥狀的發(fā)作并延長(zhǎng)S0D1G93A大鼠，人類ALS (肌萎縮性側(cè)索硬化癥）模 型的壽命。
[0183] S0D1G93A大鼠代表了尤其積極形式的ALS的神經(jīng)病理學(xué)和臨床癥狀的綜合模 型。[(Nagai等人，2001;H0wland等人，2002)]。來(lái)自人類胎兒脊索的NSCs可以移植到 S0D1G93A大鼠和小鼠的腰索中，在此發(fā)生神經(jīng)元的大量分化，且在此分化的神經(jīng)元隨后與 宿主神經(jīng)元形成突觸接觸并表達(dá)和釋放⑶NF和BDNF。表現(xiàn)出急性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的大鼠 S0D1G93A模型可用于研究和證實(shí)NSCs在疾病中的有益作用。為此，所公開的方法中使用的 NSC移植物在神經(jīng)變性環(huán)境中很好地存活并發(fā)揮有力的臨床作用。
[0184] 這些作用至少一部分與這些移植物表達(dá)和釋放運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)因子的能力有關(guān)。 因此，所公開的方法的移植NSCs延緩了急性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病的發(fā)作并將這些動(dòng)物的壽命延 長(zhǎng)了 10天以上，盡管移植方案受限--其被限定至腰部隆突。
[0185] 來(lái)自8周胎齡的死后人胎兒的脊髓組織的人類HSCs(NSI_566RSC)在含有成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF-2)的無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增大約12-12代，然后移植。用抗人體核 抗原（Hnu)的抗體可靠地追蹤這些細(xì)胞的命運(yùn)（fate) (Johe等人，1996)。使用這些細(xì) 胞的所有手術(shù)程序均根據(jù) Animal Care and Use Committee of the JohnsHopkins Medical Institution s批準(zhǔn)并經(jīng)此引用并入本文的規(guī)程進(jìn)行，使用氣體麻醉（安氟醚：氧：一氧化 二氮=1 : 33 : 66)和無(wú)菌法進(jìn)行。
[0186] 在顯微鏡引導(dǎo)下，將活和死NSCs移植到放在Kopf脊柱立體定位裝置上的9周 大（220-300克）混合性別S0D1G93A大鼠的腰部隆突（L4&L5)中。死細(xì)胞通過(guò)在移植之 前反復(fù)冷凍和解凍來(lái)制備。用經(jīng)由硅橡膠管連接到10微升Hamilton微量注射器上的 pulled-beveled玻璃微量吸移管，將細(xì)胞懸浮液在無(wú)菌條件下經(jīng)由對(duì)腹角兩側(cè)上的腹角的 大約8次注射（每個(gè)注射位置5X10 4NSC，每側(cè)四個(gè)注射位置）輸送。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（其表 明在未治療的動(dòng)物或接受環(huán)孢菌素的動(dòng)物中，移植物存活不超過(guò)一個(gè)月），所有大鼠均接受 FK-506(1毫克/千克，腹腔注射）以防止免疫排斥。
[0187] 每周兩次測(cè)試大鼠的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和重量。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度試驗(yàn)包括basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（Basso 等人，1995)，和斜面標(biāo)準(zhǔn)（Rivlin 和 Tator，1977)。 對(duì)于BBB分?jǐn)?shù)測(cè)試，在戶外測(cè)試動(dòng)物大約4或5分鐘。所有運(yùn)動(dòng)性能均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)記錄和分 級(jí)。對(duì)于斜面測(cè)試，將大鼠放在斜面氈子上，并將角度調(diào)節(jié)至使它們的位置穩(wěn)定大約5秒的 最大角度。然后記錄該角度作為動(dòng)物的斜面分?jǐn)?shù)。通過(guò)MAN0VA然后通過(guò)Fisher LSD post hoc試驗(yàn)分析BBB和斜面分?jǐn)?shù)。疾病發(fā)作是指體重開始急劇降低的時(shí)點(diǎn)。通過(guò)在兩組之間 比較疾病發(fā)作時(shí)的年齡和死亡年齡（用學(xué)生實(shí)驗(yàn)）以及用Kaplan-Meier存活分析然后用 long-rank試驗(yàn)，分析受移植物類型（活或死細(xì)胞移植物）影響的疾病進(jìn)程。
[0188] 當(dāng)BBB分?jǐn)?shù)（見下文）低于3時(shí)--此時(shí)只有一個(gè)關(guān)節(jié)具有運(yùn)動(dòng)性或完全沒(méi)有運(yùn) 動(dòng)性且動(dòng)物被視為垂死，用灌流固定對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死。
[0189] 從用4%中性緩沖低聚甲醛灌注的動(dòng)物上制備組織。通過(guò)在相同固定劑中再浸漬 4小時(shí)，進(jìn)一步固定帶有連接的根部和腰神經(jīng)的胸-腰脊髓節(jié)段。將含有整個(gè)移植區(qū)域加上 該區(qū)段上下1毫米的邊緣的區(qū)段冷藏并冷凍以進(jìn)一步加工。L3-S1根部作為整標(biāo)本制品單 獨(dú)加工或在用玻璃吸移管的熱凝頂端分離支根后進(jìn)行加工。在橫剖面或矢面將這些區(qū)段切 片（35微米）。用雙標(biāo)記免疫熒光（其在多數(shù)情況下將Hnu (-種人特異性標(biāo)記物）與另一 細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合）研究NSC存活和分化，并如Yan等人，2004中所述進(jìn)行。
[0190] 使用在來(lái)自我們的免疫熒光制品的任選高放大率（ΙΟΟχ)視場(chǎng)上計(jì)數(shù)HNu(+)細(xì) 胞以及用HNu和表型標(biāo)記物雙重標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)的非體視學(xué)方法研究NSC分化。在每一 動(dòng)物中，在被移植區(qū)域隔開大約1毫米的六個(gè)切片中各使用一個(gè)視場(chǎng)。HNu(+)與雙重標(biāo)記 profiles的數(shù)量匯集自在每種情況中計(jì)數(shù)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)程分組的所有六個(gè)視場(chǎng)。對(duì)于每一 治療組（η = 6/組），生成單和雙重標(biāo)記的細(xì)胞的平均數(shù)。
[0191] 為了在移植活或死細(xì)胞（η = 4)的大鼠中評(píng)估運(yùn)動(dòng)神經(jīng)存活，評(píng)測(cè)在128天大時(shí) 犧牲的動(dòng)物的組織。根據(jù)體視學(xué)要求在來(lái)自每一動(dòng)物的L3-S1區(qū)域中每6個(gè)切片進(jìn)行一次 采樣（Yan等人，2004)，并用如Yan等人，2004中所述的光學(xué)fractionator計(jì)數(shù)α -運(yùn)動(dòng)神 經(jīng)元，其被確定為具有明確的核和大于35微米的體細(xì)胞直徑的多級(jí)細(xì)胞。用學(xué)生t試驗(yàn)分 析移植活細(xì)胞與死細(xì)胞的動(dòng)物之間的差別。
[0192] 對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的ELISA測(cè)定，用25G注射器從氣體麻醉下的動(dòng)物的第四 室中進(jìn)行CSF取樣。從1毫米厚的新鮮脊髓切片上橫向切下含有移植位置和與其相鄰的區(qū) 域的組織樣品。處理CSF或組織樣品，并如Sheng等人，2003中所述首先測(cè)量總蛋白質(zhì)。在 CSF 和脊髓樣品中使用 E-MAX ImmunoAssay 系統(tǒng)（Promega，Madison，WI)測(cè)量⑶NF 和 BDNF 含量。在450納米讀取TMB-色原體吸光度。來(lái)自活移植物、與移植物相鄰的區(qū)域和死細(xì)胞 移植物的樣品之間的濃度差異用one-way AN0VA然后用Tukey's Multiple Comparison post hoc test分析。用學(xué)生t試驗(yàn)分析移植活細(xì)胞與死細(xì)胞的動(dòng)物之間的CSF濃度差異。
[0193] 對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的免疫印跡法，用分子量標(biāo)記物使如對(duì)于ELISA那樣 制成的來(lái)自CSF活脊髓的蛋白質(zhì)樣品發(fā)生電泳，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。在含有5% 驢血清的TBS，pH7. 4中阻斷印跡，然后首先在⑶NF和BDNF抗體中（1 : 500;過(guò)夜， 4°C)，然后在HRP-linked驢抗羊IgG(對(duì)于⑶NF)和抗兔IgG(對(duì)于BDNF)中（1 : 200; 如〇1^〇1111111]11111〇1^8631'〇11)(1小時(shí)，室溫）培養(yǎng)。所有抗體均在含有5(%驢血清的1133中 稀釋。將印跡用 SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Pierce)顯影并曝光到 Kodak-XAR底片（EastmanKodak，Rochester，NY)上。然后去除（strip)印跡并用 β-肌動(dòng)蛋 白抗體（1 : 500，Sigma)和 HRP-linked 驢抗鼠 IgG(l : 10000，JacksonImmunoResearch) 重新印跡。用 Bio-Rad Quantity One 軟件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)分析免 疫反應(yīng)帶。對(duì)每個(gè)動(dòng)物計(jì)算帶密度比率（⑶NF活BDNF : β -肌動(dòng)蛋白），且如在ELISA實(shí)驗(yàn) 中那樣，輸入組平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0194] 通過(guò)用人特異性HNu抗體進(jìn)行免疫染色，識(shí)別移植后22周的SOD 1G93A大鼠的脊 髓中的人NSCs。HNu(+)細(xì)胞表現(xiàn)為存活在腹角（A)中，并極大部分被神經(jīng)元譜系標(biāo)記物， 例如微管相關(guān)性表位TUJ-1染色。通過(guò)人類核蛋白（HNu)標(biāo)記識(shí)別人類NSCs，且對(duì)于HNu 和對(duì)神經(jīng)前體、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性的表位，用雙重免疫細(xì)胞化學(xué)追蹤它們的表 型命運(yùn)。在S0D1G93A大鼠中實(shí)驗(yàn)的最后，人類NSCs表現(xiàn)出強(qiáng)勁的移植和優(yōu)異的長(zhǎng)期存 活。大部分HNu (+)細(xì)胞（70. 4±6. 4% )基于它們的TUJ-1共位性分化成神經(jīng)元譜系。大 約1/5(19.2±5.6%)!^1^+)細(xì)胞與巢蛋白共位且非常少（1.3±0.9%)的!^11(+)細(xì)胞為 GFAP陽(yáng)性。
[0195] 用移植物/宿主細(xì)胞的perikaryal標(biāo)記物和對(duì)宿主或移植末端呈選擇性的標(biāo) 記物測(cè)試人類NSCs結(jié)合到宿主回路中的能力。將切片進(jìn)行HNu染色以建立移植物來(lái)源， 進(jìn)行TUJ-1染色以建立神經(jīng)元分化，以及識(shí)別大鼠和小鼠表位而非人類表位的突觸前蛋白 Bassoon(BSN)的單克隆抗體。據(jù)發(fā)現(xiàn)，大鼠來(lái)源的突觸小結(jié)接觸到薄壁組織位置的大量 HNu(+)、TUJ-l(+)細(xì)胞。
[0196] 在共焦顯微法中，帶有HNU(+)核和TUJ-1 (+)細(xì)胞質(zhì)的NSC源神經(jīng)元細(xì)胞被大鼠 末端接觸。相反，用TUJ-1和人特異性突觸體素染色的制品表現(xiàn)出與宿主神經(jīng)元，尤其是大 和小運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元并置的小突觸小結(jié)的致密末端場(chǎng)。大量來(lái)自移植物的突觸小結(jié)接觸宿主運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元。針對(duì)HNu和人NF-70染色的水平切片顯示出大量來(lái)自移植物的軸突，移植物留 在左側(cè)并優(yōu)先沿腹索的白質(zhì)運(yùn)行。使用具有ChAT免疫反應(yīng)性的細(xì)胞/處理法從腹角中的 白質(zhì)中描繪出灰質(zhì)。與移植位置相聯(lián)地發(fā)現(xiàn)用抗神經(jīng)絲表位NF70的人特異性抗體標(biāo)記的 大量軸突，表明許多人類NSCs分化成投射神經(jīng)元；這些軸突對(duì)腹角的白質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)選性。
[0197] 移植到S0D1G93A大鼠腹索中的NSC移植物延長(zhǎng)了壽命并延緩了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡 和疾病發(fā)作和發(fā)展。在活細(xì)胞（L)和死細(xì)胞（對(duì)照物，C)移植物的情況下，臨床和病理學(xué) 測(cè)量的進(jìn)程分析顯示在圖9中。通過(guò)Kaplan-Meier和端點(diǎn)分析，移植活NSCs的動(dòng)物表現(xiàn) 出顯著提高的存活。Kaplan-Meier圖（圖9A)表明在整個(gè)觀察期（P = 0. 0003)實(shí)驗(yàn)和對(duì) 照動(dòng)物之間的顯著區(qū)別。BBB戶外和斜面試驗(yàn)分?jǐn)?shù)的時(shí)間圖（圖9B)表明與接受死NSCs的 動(dòng)物相比，移植活NSCs的動(dòng)物的肌肉軟弱的發(fā)展明顯緩慢。
[0198] 在接受活或死NSCs并在128天大時(shí)安樂(lè)死的一小組動(dòng)物中，檢查NSCs對(duì)Tg 大鼠的腰部隆突（L3-S1)中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)存活的影響。移植死NSCs的動(dòng)物的平均壽命 為138天，而移植活NSCs的大鼠的平均壽命為149天。因此，在實(shí)驗(yàn)和對(duì)照大鼠 （P = 0.0005)之間存在11天的顯著壽命差異。對(duì)于接受死細(xì)胞的動(dòng)物，平均疾病發(fā)作時(shí)間 (time-t〇-disease-〇nset)為115天，而對(duì)于移植活NSCs的動(dòng)物則為122天。在兩組之間 (P = 〇. 0001)觀察到疾病發(fā)作時(shí)間的7天的顯著差異。
[0199] α -運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體視學(xué)評(píng)估數(shù)量對(duì)于接受活NSCs的動(dòng)物而言為6, 418,對(duì)于移 植死NSCs的大鼠而言為3, 206,即實(shí)驗(yàn)組的腰部隆突中神經(jīng)元的數(shù)量為相同年齡的對(duì)照動(dòng) 物的兩倍之多。在128天大的代表性實(shí)驗(yàn)大鼠和對(duì)照大鼠中，在活和死NSC組之間觀察到 在腰部隆突中3, 212個(gè)細(xì)胞的差異（P = 0. 01)。
[0200] 人類NSCs對(duì)變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)提供的神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制包括表達(dá)和釋放出兩種 對(duì)哺乳動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有典型營(yíng)養(yǎng)作用的肽，[BDNF和⑶NF] (Henderson等人，1994 ; Koliatsos等人，1993)。測(cè)定⑶NF和BDNF在移植S0D1G93A大鼠的脊髓中的表達(dá)和釋放。 通過(guò)免疫印跡法和ELISA評(píng)測(cè)脊髓制品和CSF樣品的BDNF和⑶NF。通過(guò)ELISA測(cè)定移植 活細(xì)胞的大鼠（L1和L2)和移植死細(xì)胞的動(dòng)物（C)的薄壁組織和CSF中的GDNF濃度。L1 代表通過(guò)移植位置的濃度，而L2反映高或低一節(jié)段的組織中的濃度。各組之間的差異是顯 著的，并由L1或L2與C組之間的極大不同引起。
[0201] 通過(guò)t試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)（活細(xì)胞，L)和對(duì)照（死細(xì)胞，C)組之間的CSF濃度差異也是明 顯的。在移植活NSC的動(dòng)物中，ELSA表現(xiàn)出在移植位置0. 912±0. 050pg/μ g的濃度和在 脊髓中相距一節(jié)段的位置0. 819±0. 115pg/y g的濃度。在移植死NSCs的動(dòng)物中，含移植 物的脊髓節(jié)段中的這些濃度為〇. 368±0. 026pg/μ g的濃度。在CSF中，實(shí)驗(yàn)組中⑶NF濃 度為0. 027±0. 012pg/y 1和0. 006±0. 002pg/y 1。這些數(shù)據(jù)表明⑶NF在脊髓中的表達(dá)和 釋放增加三倍，且在帶有活NSCs的動(dòng)物的CSF中⑶NF分泌增加五倍。
[0202] 免疫印跡法也顯示了移植活NSCs的動(dòng)物中較高的標(biāo)準(zhǔn)化GDNF濃度。GDNF免疫印 跡法通過(guò)檢測(cè)16kDa蛋白質(zhì)證實(shí)ELISA的提高狀況。免疫印跡法還表現(xiàn)出在活細(xì)胞移植物 中0. 860 ±0. 007和在死細(xì)胞移植物中0. 708 ±0. 052的標(biāo)準(zhǔn)化⑶NF密度。
[0203] 測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠和對(duì)照組的薄壁組織和CSF中BDNF的ELISA染色。ELISA分析表現(xiàn) 出在移植位置（L1)0. 086±0. OHpg/μ g的濃度和在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中與移植物相距一節(jié)段的位 置α2)0.054±0.009ρ8/μ8的濃度。在對(duì)照大鼠中，含移植物的節(jié)段中的BDNF濃度為 O.OlOiO.OOSpg/yg的濃度。實(shí)驗(yàn)和對(duì)照CSF濃度之間的差異明顯。在CSF中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中BDNF濃度為(λ 041±(X 013pg/y 1，在對(duì)照物中為(λ 010±(X 008pg/y 1。這些發(fā)現(xiàn)表明 BDNF濃度在脊髓中增加八倍且在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的CSF中增加四倍。同時(shí)，ELISA數(shù)據(jù)表明在移 植活NSCs的動(dòng)物中，尤其是在CSF中，⑶NF與BDNF相比具有分布更廣的分泌。
[0204] 免疫細(xì)胞化學(xué)還表明，極大部分的移植HNu(+)細(xì)胞表達(dá)GDNF。帶有活移植物的動(dòng) 物中的⑶NF源是移植細(xì)胞本身。在HNu (紅色）和⑶NF(綠色）的雙重染色制品中，顯示 出移植NSCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GDNF免疫反應(yīng)性的充足性。在接受活移植物的動(dòng)物中，在宿主運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)類似分泌泡囊的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)周圍具有強(qiáng)烈的GDNF免疫反應(yīng)性，
[0205] 用⑶NF和人突觸體素（后者用于標(biāo)記源自移植物的末端）染色的宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元的共焦顯微術(shù)表明⑶NF局限在泡囊結(jié)構(gòu)中而非位于所示宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表面上的源自 移植物的末端中。用人突觸體素抗體（用于標(biāo)記刺激宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的所有移植物末端） 和GDNF染色的片段表明，在接觸宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的突觸小結(jié)中缺乏兩種蛋白質(zhì)的任何共 位性。
[0206] 帶有活移植物的大鼠表現(xiàn)出起源于移植物并刺激中央管中及其周圍的結(jié)構(gòu)的精 密通路。與接觸宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的末端中不存在GDNF蛋白質(zhì)的情況相反，極大部分的刺激 中央管的NSC源軸突末端與GDNF免疫反應(yīng)性共位（co-localize)。在刺激中央管中的室管 膜細(xì)胞的源自移植物的末端中，觀察到人類突觸體素和GDNF的廣泛共位。這些解剖學(xué)狀況 表明，⑶NF可能經(jīng)由逆轉(zhuǎn)運(yùn)被刺激移植物的宿主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元吸收且不經(jīng)由跨突觸傳輸而被 輸送到這些神經(jīng)元上（Rind等人，2005)。
[0207] 移植NCSs對(duì)SOD 1G93A大鼠腹角中正在進(jìn)行的變性過(guò)程的明顯抵抗尤為具有發(fā)展 前景。在此報(bào)道的NSCs的存活和大量分化有利地表明，與含S0D1G93A的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有關(guān)的 炎性/興奮毒性信號(hào)傳輸（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005) 對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。這種因素本身提高了對(duì)使用移植物恢復(fù)變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病中的運(yùn) 動(dòng)功能的未來(lái)細(xì)胞策略的信心。
[0208] 實(shí)施例7.通過(guò)移植人脊髓神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞治療外傷性脊髓損傷.治療脊髓 空洞癥
[0209] 將擴(kuò)增的人脊柱干細(xì)胞注入免疫抑制的成熟雌性Sprague-Dawley或免疫缺陷的 無(wú)胸腺裸鼠中。在移植前1個(gè)月，在兩組中均制造 C4-5挫傷。移植物受體（η = 24)在移 植后存活60-150天。人源NSCs形成由神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的大的細(xì)胞 聚集體。這些移植物總是完全填充每一損傷。Immature-appearing,NeuN+/人類核+神經(jīng) 元通常構(gòu)成供體細(xì)胞種群的50 %。這些神經(jīng)元將人類神經(jīng)絲+過(guò)程輸送通過(guò)與移植物位置 相距至少2厘米的灰質(zhì)核白質(zhì)。在宿主和移植物神經(jīng)元附近均注意到強(qiáng)烈的人特異性突觸 體素免疫反應(yīng)性，且似乎非反應(yīng)性的GFAP+細(xì)胞與供體神經(jīng)元并置。此外，這些移植物支持 似乎來(lái)自宿主來(lái)源的TH+和5HT+纖維的生長(zhǎng)。這種NSC' s系由此似乎具有有利于脊柱內(nèi) 灰質(zhì)修復(fù)的類似初生胎兒CNS的質(zhì)量。
[0210] 應(yīng)該理解的是，對(duì)本文所述的優(yōu)選實(shí)施方案的各種變動(dòng)和修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員 顯而易見的。這類變動(dòng)和修改可以在不背離所公開的方法的精神和范圍且不減損其預(yù)期優(yōu) 點(diǎn)的情況下進(jìn)行。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了這類變動(dòng)和修改。
[0211] 以下內(nèi)容對(duì)應(yīng)本申請(qǐng)母案的原始權(quán)利要求書
[0212] 1.治療痙攣狀態(tài)、僵硬或肌肉活動(dòng)過(guò)度癥狀的方法，包括：a)從哺乳動(dòng)物中分離 出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞；b)將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群；c)濃縮該擴(kuò)增種群； 和d)將治療有效量的所述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20%的擴(kuò) 增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0213] 2.項(xiàng)1的方法，其中所述癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損 傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢性 局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0214] 3.項(xiàng)1的方法，其中從選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶血 和至少一個(gè)胚胎的來(lái)源中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0215] 4.項(xiàng)3的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
[0216] 5.項(xiàng)4的方法，其中所述發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0217] 6.項(xiàng)4的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0218] 7.項(xiàng)1的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0219] 8.項(xiàng)1的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因子。
[0220] 9.項(xiàng)8的方法，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0221] 10.項(xiàng)1的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)GABA能 神經(jīng)元。
[0222] 11.項(xiàng)1的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)甘氨酸 能神經(jīng)元。
[0223] 12.項(xiàng)1的方法，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
[0224] 13.項(xiàng)1的方法，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0225] 14.項(xiàng)1的方法，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
[0226] 15.能夠治療痙攣狀態(tài)、僵硬和肌肉活動(dòng)過(guò)度癥狀的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述神經(jīng)干 細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物中并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群，其中將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的所述擴(kuò)增種 群濃縮，且其中將治療有效量的所述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少 20 %的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0227] 16.治療慢性疼痛的方法，包括：a)從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞；b) 將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群；c)濃縮擴(kuò)增種群；和d)將治療有效量的所述擴(kuò)增 種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成 神經(jīng)元。
[0228] 17.項(xiàng)16的方法，其中慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0229] 18.項(xiàng)16的方法，其中從選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶 血、至少一個(gè)胚胎和它們的任意組合的來(lái)源中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0230] 19.項(xiàng)18的方法，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
[0231] 20.項(xiàng)19的方法，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0232] 21.項(xiàng)19的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0233] 22.項(xiàng)16的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0234] 23.項(xiàng)16的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
[0235] 24.項(xiàng)23的方法，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0236] 25.項(xiàng)16的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)GABA能神經(jīng) J Li 〇
[0237] 26.項(xiàng)16的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)甘氨酸能神經(jīng) J Li 〇
[0238] 27.項(xiàng)16的方法，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
[0239] 28.項(xiàng)16的方法，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0240] 29.項(xiàng)28的方法，其中這些區(qū)域包括背角。
[0241] 30.項(xiàng)28的方法，其中這些區(qū)域包括鞘內(nèi)空間。
[0242] 31.項(xiàng)16的方法，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
[0243] 32.能夠治療慢性疼痛的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物中并 在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群，其中將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的所述擴(kuò)增種群濃縮，并將治療有效量 的所述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者 脊髓中生成神經(jīng)元。
[0244] 33.治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的方法，包括：a)從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干 細(xì)胞；b)將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群；c)濃縮擴(kuò)增種群；和d)將治療有效量的 所述擴(kuò)增種群的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞引入接受者脊髓的一個(gè)區(qū)域，其中至少20%的擴(kuò)增種 群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0245] 34.項(xiàng)33的方法，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外 傷性腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬 化癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0246] 35.項(xiàng)33的方法，其中從選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶 血和至少一個(gè)胚胎的來(lái)源中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0247] 36.項(xiàng)35的方法，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
[0248] 37.項(xiàng)36的方法，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0249] 38.項(xiàng)36的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0250] 39.項(xiàng)33的方法，包括從富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞， 其中所述神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善運(yùn)動(dòng)缺陷的生長(zhǎng)因子。
[0251] 40.項(xiàng)33的方法，其中擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的 至少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0252] 41.項(xiàng)33的方法，其包括從富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0253] 42.項(xiàng)33的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0254] 43.項(xiàng)33的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
[0255] 44.項(xiàng)43的方法，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0256] 45.項(xiàng)33的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)GABA能神經(jīng) J Li 〇
[0257] 46.項(xiàng)33的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)甘氨酸能神經(jīng) J Li 〇
[0258] 47.項(xiàng)33的方法，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0259] 48.項(xiàng)33的方法，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0260] 49.項(xiàng)33的方法，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
[0261] 50.能夠治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自哺乳動(dòng) 物并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群，其中將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的所述擴(kuò)增種群濃縮，且其中將治 療有效量的所述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠 在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
[0262] 51.治療脊髓空洞癥的方法，包括：a)從哺乳動(dòng)物中分離出至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞； b)將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群；c)濃縮該擴(kuò)增種群；和d)將治療有效量的所 述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓的脊 髓空洞中生成神經(jīng)元。
[0263] 52.項(xiàng)51的方法，其中脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性 腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、 慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0264] 53.項(xiàng)51的方法，其中從選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶 血、至少一個(gè)胚胎和它們的任意組合的來(lái)源中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0265] 54.項(xiàng)53的方法，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
[0266] 55.項(xiàng)54的方法，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0267] 56.項(xiàng)54的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0268] 57.項(xiàng)51的方法，其包括從富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì) 胞，其中所述神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長(zhǎng)因子。
[0269] 58.項(xiàng)51的方法，其包括從富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。
[0270] 59.項(xiàng)51的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
[0271] 60.項(xiàng)51的方法，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
[0272] 61.項(xiàng)60的方法，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF_a、aFGF和它們的組合。
[0273] 62.項(xiàng)51的方法，其中擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的 至少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0274] 63.項(xiàng)51的方法，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)神經(jīng)元。
[0275] 64.項(xiàng)51的方法，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
[0276] 65.項(xiàng)51的方法，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
[0277] 66.項(xiàng)51的方法，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
[0278] 67.項(xiàng)51的方法，其中將擴(kuò)增種群的至少100, 000個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞引入接受者脊髓 的脊髓空洞中。
[0279] 68.能夠治療脊髓空洞癥的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物中 并在體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群，其中將包括該神經(jīng)干細(xì)胞的所述擴(kuò)增種群濃縮，且其中將治療 有效量的所述擴(kuò)增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受 者脊髓的脊髓空洞中生成神經(jīng)元。
[0280] 69.將至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增成神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增種群的方法，其中每次神經(jīng) 干細(xì)胞擴(kuò)增在不分化的情況下超過(guò)30次細(xì)胞倍增，所述方法包括：從中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中 離解神經(jīng)干細(xì)胞；向培養(yǎng)皿提供至少一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，其中該細(xì)胞外蛋白質(zhì)包括至少大 約10微克/毫升的聚-D-賴氨酸和大約1毫克/毫升纖連蛋白；在所述培養(yǎng)皿中在不存在 血清的情況下培養(yǎng)離解的神經(jīng)干細(xì)胞；在培養(yǎng)皿中添加至少一種選自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它們的組合的生長(zhǎng)因子；和使培養(yǎng)的細(xì)胞在匯合之前傳代。
[0281] 70.項(xiàng)69的方法，其中擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)元。
[0282] 71.項(xiàng)69的方法，其中將所述神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增包括將纖連蛋白作為可溶因子添加 到培養(yǎng)基中。
[0283] 72.項(xiàng)69的方法，其中離解細(xì)胞并使細(xì)胞傳代包括酶促離解。
[0284] 73.項(xiàng)72的方法，其中酶促離解包括用胰蛋白酶處理細(xì)胞。
[0285] 74.項(xiàng)69的方法，其中將治療有效量的所述擴(kuò)增種群引入接受者神經(jīng)系統(tǒng)的至少 一個(gè)區(qū)域中以治療神經(jīng)變性癥狀。
【權(quán)利要求】
1. 分離自哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞在制備用于治療痙攣狀態(tài)、僵硬或肌肉活動(dòng) 過(guò)度癥狀的藥物中的用途，其中： a) 將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群； b) 濃縮該擴(kuò)增種群；和 c) 治療有效量的所述擴(kuò)增種群用于引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20% 的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
3. 權(quán)利要求1的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、 骨髓、周圍血液、臍帶血和至少一個(gè)胚胎的來(lái)源。
4. 權(quán)利要求3的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
5. 權(quán)利要求4的用途，其中所述發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
6. 權(quán)利要求4的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自人類胎兒脊髓。
7. 權(quán)利要求1的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì) 胞。
8. 權(quán)利要求1的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
9. 權(quán)利要求8的用途，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
10. 權(quán)利要求1的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)GABA 能神經(jīng)元。
11. 權(quán)利要求1的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠在體內(nèi)生成至少1000個(gè)甘氨 酸能神經(jīng)元。
12. 權(quán)利要求1的用途，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
13. 權(quán)利要求1的用途，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
14. 權(quán)利要求1的用途，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
15. 分離自哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞在制備用于治療慢性疼痛的藥物中的用 途，其中： a) 將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群； b) 濃縮擴(kuò)增種群；和 c) 治療有效量的所述擴(kuò)增種群用于引入接受者脊髓的至少一個(gè)區(qū)域，其中至少20% 的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
16. 權(quán)利要求15的用途，其中慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性 腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、 慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
17. 權(quán)利要求15的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系 統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶血、至少一個(gè)胚胎和它們的任意組合的來(lái)源。
18. 權(quán)利要求17的用途，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
19. 權(quán)利要求18的用途，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
20. 權(quán)利要求18的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自人類胎兒脊髓。
21. 權(quán)利要求15的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干 細(xì)胞。
22. 權(quán)利要求15的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
23. 權(quán)利要求22的用途，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
24. 權(quán)利要求15的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)GABA能神 經(jīng)元。
25. 權(quán)利要求15的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)甘氨酸能神 經(jīng)元。
26. 權(quán)利要求15的用途，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
27. 權(quán)利要求15的用途，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
28. 權(quán)利要求27的用途，其中這些區(qū)域包括背角。
29. 權(quán)利要求27的用途，其中這些區(qū)域包括鞘內(nèi)空間。
30. 權(quán)利要求15的用途，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
31. 分離自哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞在制備用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的藥物中 的用途，其中： a) 將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群； b) 濃縮擴(kuò)增種群；和 c) 治療有效量的所述擴(kuò)增種群的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞用于引入接受者脊髓的一個(gè)區(qū) 域，其中至少20%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
32. 權(quán)利要求31的用途，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、 夕卜傷性腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻搏、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索 硬化癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
33. 權(quán)利要求31的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系 統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶血和至少一個(gè)胚胎的來(lái)源。
34. 權(quán)利要求33的用途，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
35. 權(quán)利要求34的用途，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
36. 權(quán)利要求34的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自人類胎兒脊髓。
37. 權(quán)利要求31的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū)域 中，其中所述神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善運(yùn)動(dòng)缺陷的生長(zhǎng)因子。
38. 權(quán)利要求31的用途，其中擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量 的至少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
39. 權(quán)利要求31的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域。
40. 權(quán)利要求31的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干 細(xì)胞。
41. 權(quán)利要求31的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
42. 權(quán)利要求41的用途，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
43. 權(quán)利要求31的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)GABA能神 經(jīng)元。
44. 權(quán)利要求31的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)甘氨酸能神 經(jīng)元。
45. 權(quán)利要求31的用途，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在接受者脊髓中生成神經(jīng)元。
46. 權(quán)利要求31的用途，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
47. 權(quán)利要求31的用途，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
48. 分離自哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞在制備用于治療脊髓空洞癥的藥物中的用 途，其中： a) 將所述神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增成擴(kuò)增種群； b) 濃縮該擴(kuò)增種群；和 c) 治療有效量的所述擴(kuò)增種群用于引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴(kuò) 增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神經(jīng)元。
49. 權(quán)利要求48的用途，其中脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷 性腦損傷、中風(fēng)、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化 癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
50. 權(quán)利要求48的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系 統(tǒng)、骨髓、周圍血液、臍帶血、至少一個(gè)胚胎和它們的任意組合的來(lái)源。
51. 權(quán)利要求50的用途，其中哺乳動(dòng)物是發(fā)育中的哺乳動(dòng)物。
52. 權(quán)利要求51的用途，其中發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
53. 權(quán)利要求51的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自人類胎兒脊髓。
54. 權(quán)利要求48的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自富含至少一種神經(jīng)元亞型的區(qū) 域，其中所述神經(jīng)元亞型產(chǎn)生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長(zhǎng)因子。
55. 權(quán)利要求48的用途，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞分離自富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的區(qū)域。
56. 權(quán)利要求48的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括在不存在血清的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干 細(xì)胞。
57. 權(quán)利要求48的用途，其中擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞包括使神經(jīng)干細(xì)胞接觸至少一種生長(zhǎng)因 子。
58. 權(quán)利要求57的用途，其中生長(zhǎng)因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
59. 權(quán)利要求48的用途，其中擴(kuò)增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量 的至少一種生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
60. 權(quán)利要求48的用途，其中治療有效量的擴(kuò)增種群能夠生成至少1000個(gè)神經(jīng)元。
61. 權(quán)利要求48的用途，其中至少40%的擴(kuò)增種群能夠在脊髓中生成神經(jīng)元。
62. 權(quán)利要求48的用途，其中引入治療有效量的擴(kuò)增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個(gè)區(qū)域。
63. 權(quán)利要求48的用途，其中至少30%的擴(kuò)增種群能夠在體外分化成神經(jīng)元。
64.權(quán)利要求48的用途，其中擴(kuò)增種群的至少100, 000個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞用于引入接受者 脊髓的脊髓空洞中。
【文檔編號(hào)】A61P25/02GK104042629SQ201410240718
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2004年11月17日
【發(fā)明者】M·馬莎拉, K·K·喬, T·G·黑茲爾, 垣花修, V·科利亞索斯, 閻軍, P·J·賴爾, M·J·維拉多 申請(qǐng)人:神經(jīng)干公司