專利名稱：在陣列上對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的鑒定和/或定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0001 本發(fā)明屬于探測(cè)領(lǐng)域，涉及對(duì)可能存在于生物樣品中的遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的鑒定和/或定量方法和手段，其中所述的核苷酸序列元件在不同的遺傳修飾植物中可能是同源的。
0002 本發(fā)明特別適于屬于相同屬或者相同科的生物體的鑒定和/或定量，并且適用于經(jīng)遺傳修飾的生物體的檢測(cè)和/或定量。
背景技術(shù)：
0003 生物芯片技術(shù)的發(fā)展可以使在給定檢測(cè)中對(duì)多個(gè)核苷酸序列同時(shí)檢測(cè)，這樣可以對(duì)相應(yīng)的生物體或該生物體的一部分進(jìn)行鑒定。但是檢測(cè)需要與PCR擴(kuò)增聯(lián)合進(jìn)行，而對(duì)每一種生物進(jìn)行一次PCR然后使用微陣列進(jìn)行檢測(cè)是沒有什么優(yōu)勢(shì)的。因此，需要有一個(gè)檢測(cè)大量生物體的策略，以降低PCR反應(yīng)的數(shù)量，同時(shí)保留對(duì)多個(gè)生物體的鑒定。
背景技術(shù)：
0004 Affymetrix Inc.公司已經(jīng)開發(fā)了通過在每步的處理中都使用掩蔽(mask)而在固相支持物上特定的位置直接合成寡聚核苷酸的方法。所述方法包括在不斷生長(zhǎng)的寡核苷酸中加入新的核苷酸，以在所需的位置得到所需的序列。該方法衍生自光刻技術(shù)(photolithographic technology)，與光保護(hù)基團(tuán)的使用結(jié)合，光保護(hù)基團(tuán)是在新核苷酸加入之前被釋放(EP-A1-0476014，US-A-5,445,934，US-A-5,143,854和US-5,510,270)。但是在表面上只存在小的寡核苷酸，所以所述的方法主要應(yīng)用于對(duì)應(yīng)于結(jié)合在陣列上的每個(gè)特異寡聚核苷酸的陽(yáng)性斑點(diǎn)型式的測(cè)序或鑒定。將這個(gè)型式與參照進(jìn)行比較，得到對(duì)靶標(biāo)序列的表征。所述的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因的鑒定(WO97/29212和WO98/28444)，其中捕獲核苷酸序列包含少于30個(gè)核苷酸，并且來(lái)自對(duì)兩個(gè)可能僅相差單個(gè)核苷酸的不同序列的分析(SNP的鑒定或基因定型)。優(yōu)選小的捕獲核苷酸序列(長(zhǎng)度包含10到20個(gè)核苷酸之間)，原因是如果核苷酸的長(zhǎng)度越短，則相差一個(gè)堿基的兩個(gè)寡聚核苷酸之間的差異越高。
0005 該方法缺少敏感性，表現(xiàn)在它不能直接檢測(cè)基因擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。使用具有T3或T7序列的引物進(jìn)行雙擴(kuò)增，然后用RNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。這些RNA被切割為大約40個(gè)堿基的片段，然后在陣列上檢測(cè)(WO97/29212的實(shí)施例1)。但是，長(zhǎng)的DNA或RNA片段與表面上的捕獲探針雜交非常緩慢。因此所述方法不適于檢測(cè)同源序列，因?yàn)樾蛄兄型葱圆煌?，這樣片段的一部分可能與相同的捕獲探針雜交。因此，應(yīng)該在方法中加入解釋結(jié)果的軟件，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。
0006 但是，對(duì)于基于mRNA的cDNA拷貝的基因表達(dá)陣列，在使用小的捕獲探針陣列時(shí)會(huì)遇到相同的問題雜交率低。因此，將片段切割成更小的片段，該方法要求使用幾個(gè)捕獲核苷酸序列，以獲得證明某個(gè)基因存在的信號(hào)型式(WO97/10364和WO97/27317)。所述的切割還降低了標(biāo)記核苷酸的數(shù)目，這樣降低了得到的信號(hào)。這時(shí)使用長(zhǎng)的捕獲核苷酸序列得到更好的檢測(cè)敏感性。在許多基因表達(dá)應(yīng)用中，如果待檢測(cè)的cDNA來(lái)自具有不同序列的基因，則使用長(zhǎng)的捕獲探針不是問題，因?yàn)樗鼈冎g沒有交叉反應(yīng)。長(zhǎng)的捕獲核苷酸序列提供了所需的敏感性，但是它們會(huì)與其他同源序列雜交。
0007 陣列非常適宜進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)，但是因?yàn)樯飿悠分械牟牧虾亢艿?，所以需要有一個(gè)策略，使PCR和陣列的組合有效。對(duì)被檢測(cè)的樣品中可能存在的每一個(gè)可能的生物體都進(jìn)行PCR然后分別檢測(cè)和/或鑒定擴(kuò)增的序列不是非常有效的，并且是本領(lǐng)域的一部分。如果在樣品中可能存在多個(gè)生物體，必須對(duì)要使用的引物的數(shù)目進(jìn)行限制，因?yàn)槿绻诓煌嚬苤羞M(jìn)行的話，這有可能導(dǎo)致大量數(shù)目的PCR；或者如果進(jìn)行多重引物PCR的話，會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增；因此，需要簡(jiǎn)化PCR，開發(fā)出組合PCR和陣列設(shè)計(jì)的策略。
0008 在對(duì)生物樣品中遺傳修飾(GM)的植物或生物體(GMO)進(jìn)行檢測(cè)和/或鑒定時(shí)就存在這樣的情況。
GMO由一個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)化事件確定，該事件通常是指向受體生物體中插入異源基因構(gòu)建體。整合基因構(gòu)建體由幾個(gè)元件組成，通常至少有一個(gè)目的基因，作為起始信號(hào)起作用的啟動(dòng)子以及作為停止信號(hào)的終止子，用于調(diào)控基因表達(dá)。此外，構(gòu)建體可以被來(lái)自克隆載體的DNA序列包圍。大部分遺傳修飾的植物用含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(P-35S)和/或CaMV 35S終止子(T-35S)或者根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合酶終止子(T-Nos)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。最常用的克隆載體是含有編碼氨芐青霉素抗生素抗性基因(bla)的pBR322，或者含有編碼新霉素/卡那霉素抗生素抗性基因(nptII)的載體。
0009 有一些國(guó)家對(duì)GMO和來(lái)自GM的食品有強(qiáng)制的標(biāo)注規(guī)定。特別地，歐洲的規(guī)定對(duì)由遺傳修飾生物組成或含有遺傳修飾生物(GMO)比例高于食物成分0.9％的食品和飼料，強(qiáng)制要求標(biāo)注(EC規(guī)定No.1829/203)。這個(gè)0.9％的標(biāo)注限度導(dǎo)致0.1％或者甚至更低的檢測(cè)限度，目的是考慮到檢測(cè)的變異性。這個(gè)限度相應(yīng)于樣品中含有幾百或者更少的基因組拷貝。
0010 為了遵守那些規(guī)定中的要求，并且通過準(zhǔn)確的信息保證消費(fèi)者可以進(jìn)行自由選擇，已經(jīng)描述了幾個(gè)GMO分析方法，這些方法目前在歐洲執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室中使用。由于實(shí)驗(yàn)室得到的用于進(jìn)行分析的產(chǎn)品經(jīng)常是加工過或者是精制過的，目標(biāo)被分析物的質(zhì)和量經(jīng)常對(duì)任何檢測(cè)方法的敏感性提出挑戰(zhàn)。在現(xiàn)有的方法中，PCR然后進(jìn)行電泳，一般被認(rèn)為是在常規(guī)應(yīng)用中檢測(cè)GM來(lái)源物質(zhì)最敏感可靠的方法。
0011 GMO檢測(cè)可能限于簡(jiǎn)單的篩選PCR。但是對(duì)DNA來(lái)源的GMO進(jìn)行特異鑒定，或者對(duì)GMO來(lái)源的DNA進(jìn)行可靠定量迅速增加了成本，特別是要檢測(cè)的GMO的數(shù)目持續(xù)增加的情況下。
0012 由于需要達(dá)到的敏感性，來(lái)自樣品的遺傳物質(zhì)在檢測(cè)前首先通過PCR擴(kuò)增。根據(jù)特異性的水平，基于PCR的GMO檢測(cè)可以劃分為至少四類。每一類對(duì)應(yīng)的是在PCR中擴(kuò)增的DNA片段組合物篩選靶標(biāo)、基因特異靶標(biāo)、構(gòu)建體特異和事件特異的靶標(biāo)。
0013 第一類PCR方法以P-35S、T-35S、T-Nos、bla或者nptII遺傳元件作為靶標(biāo)，在篩選遺傳修飾物質(zhì)時(shí)有廣泛應(yīng)用(Matsuoka等，2002，J.Agric.Food Chem.9335-38)。但是，這些篩選方法不能用于鑒定GMO，因?yàn)橐粋€(gè)篩選靶標(biāo)的存在并不一定表明GMO來(lái)源的DNA的存在。P-35S或者T-35S的來(lái)源可能是天然存在的CaMV(Wolf等2000，Eur.Food Res Technol.210367-372)。
0014 第二類PCR方法，以目標(biāo)基因(例如CryIA(b)基因)為靶標(biāo)，比篩選方法更為特異(Va tilingom等，1999，J.Agric.Food Chem.475261-5266)。對(duì)已有基因的選擇大于對(duì)已有啟動(dòng)子和終止子的選擇。通常對(duì)特定基因擴(kuò)增的陽(yáng)性信號(hào)表明存在來(lái)自GM的DNA，許多情況下可以確定該DNA來(lái)自哪種GMO。
0015 第三類PCR方法以基因構(gòu)建體(特異構(gòu)建體)相鄰元件的連接為靶標(biāo)，例如在啟動(dòng)子和目標(biāo)基因之間的連接(例如Mon810玉米P-35S-hsp70內(nèi)含子I)(Zimmerman等，1998，Lebensm-Wissu Technol.31664-667)。使用這些方法時(shí)只有存在來(lái)自GMO的物質(zhì)才會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。但是，全部的基因構(gòu)建體可能已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到一個(gè)以上的GMO中，或者可能用于以后的轉(zhuǎn)化中。
在目前技術(shù)的限制條件下，轉(zhuǎn)化事件唯一的獨(dú)特標(biāo)記是受體基因組和插入DNA之間的整合基因座處的連接。這個(gè)連接是第四類PCR方法的靶標(biāo)。不幸的是，即使是事件特異的方法也有它們的局限性。當(dāng)兩種GMO雜交時(shí)(例如兩種不同的GM玉米例如T25和Mon810)，產(chǎn)生的雜種后代可能含有包括兩個(gè)事件的標(biāo)記的遺傳修飾，這樣在PCR檢測(cè)中不能與它的兩個(gè)親本區(qū)別開來(lái)。這種檢測(cè)的一個(gè)重要限制是對(duì)于每一個(gè)要鑒定的GMO需要一個(gè)特異的引物對(duì)。
0016 這些檢測(cè)中的一些基于常規(guī)PCR，可以對(duì)給定樣品中的GMO進(jìn)行定性測(cè)定。其他檢測(cè)例如實(shí)時(shí)PCR(Hernández等，2003，Transgenic Research 12179-189)可以對(duì)樣品中的GMO定量。
0017 基于PCR的對(duì)來(lái)自GMO的DNA檢測(cè)的主要局限在于獲得關(guān)于可以使用的PCR引物的信息以及獲得適宜用于可靠分析的DNA。盡管已經(jīng)開發(fā)和公布了用于GMO分析的一些PCR引物對(duì)，但是這些引物中許多只有有限的應(yīng)用范圍(例如只適于篩選或者鑒定一種GMO的引物)。
0018 食品加工例如研磨、加熱、酸處理和其他加工迅速使DNA降解為大約200-400bp的小片段，而且精制可以有效除去DNA。因此，許多產(chǎn)物幾乎沒有來(lái)自GMO的DNA，而且這樣的DNA經(jīng)常被片段化。所以，為了能夠檢測(cè)加工后的食品中的GMO，引物對(duì)應(yīng)該靶向小的片段(100-200bp)。
0019 需要擴(kuò)大對(duì)在單一檢測(cè)中檢測(cè)出的GMO的數(shù)目。還需要能夠輕易升級(jí)包括新GMO的方法。多重引物PCR在理論上允許同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)GMO。但是，這種檢測(cè)不易實(shí)施，因?yàn)橐恍┬〉臄U(kuò)增產(chǎn)物通過電泳不容易區(qū)別。而且，多個(gè)PCR與單一擴(kuò)增相比通常靈敏度更低，這對(duì)GMO檢測(cè)是一個(gè)重要缺陷。
0020 專利申請(qǐng)US-20030198943A1描述了使用共有引物在生物芯片上對(duì)PCR擴(kuò)增的GMO進(jìn)行檢測(cè)的方法。如實(shí)施例15中描述的擴(kuò)增子的大小包含約1000到約3000bp。所以該方法只適于新鮮葉片或者種子，因?yàn)橥ㄟ^研磨、加熱或酸處理獲得的加工過的食品使DNA降解為大約200-400bp的小片段。在不同的遺傳元件中選擇正向和反向共有引物(例如啟動(dòng)子35S中的有義引物，SEQ ID No192和終止子35S中的反義引物，SEQ ID No193)或者一個(gè)位于遺傳元件中，另一個(gè)位于植物基因組中邊界區(qū)域中(例如章魚堿左邊界中的有義引物，SEQ IDNo198和EPSPS中的反義引物，SEQ ID No199)。引物的序列在實(shí)施例15中給出。捕獲探針選自由通常在遺傳元件(例如CTP1、CTP2、EPSPS、Cry1ab、hsp70內(nèi)含子、Pat)中的共有引物確定的序列。GMO通過對(duì)應(yīng)于陣列中的一個(gè)斑點(diǎn)信號(hào)的捕獲探針鑒定。但是很難得到明確的鑒定，因?yàn)樵S多GMO含有相同的遺傳元件。
0021 這個(gè)現(xiàn)有技術(shù)方法的第一個(gè)限制是能夠被鑒定的GMO數(shù)量少，而且很難得到明確的鑒定，因?yàn)樵S多GMO含有相同的遺傳元件。
0022 這個(gè)現(xiàn)有技術(shù)方法的第二個(gè)限制是其不能在通過研磨、加熱、酸處理和其他加工過程加工的食品上實(shí)施，這些加工過程使DNA迅速降解為大約200-400bp的小片段。所以許多產(chǎn)物含有少量的來(lái)自GMO的DNA，并且回收的DNA序列通常是片段化的。而且，該方法只適于新鮮葉片或者種子。該P(yáng)CR基于使用不同的遺傳元件中的共有引物(例如啟動(dòng)子35S中的有義引物，SEQ ID No192和終止子35S中的反義引物，SEQ ID No193)或者一個(gè)位于遺傳元件中，另一個(gè)位于植物基因組邊界區(qū)域中(例如章魚堿左邊界中的有義引物，SEQ ID No198和EPSPS中的反義引物，SEQ ID No199)。引物的序列在實(shí)施例15中給出(第22列)。
發(fā)明目的0023 本發(fā)明的目的是提供新方法(和裝置)以改善微陣列和生物芯片技術(shù)，使大量生物體或者生物體的部分(它們的部分核苷酸序列同源)的鑒定(檢測(cè)和/或定量)變得容易。
0024 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種基于簡(jiǎn)化技術(shù)的方法(和裝置)，需要在擴(kuò)增步驟中使用有限數(shù)目的引物，通過檢測(cè)和/或記錄所述的微陣列上的單一斑點(diǎn)信號(hào)從而鑒定(檢測(cè)和/或定量)特異的擴(kuò)增靶標(biāo)序列，所述的信號(hào)由靶標(biāo)序列與其相應(yīng)的捕獲序列的特異結(jié)合產(chǎn)生。
0025 本發(fā)明的另一個(gè)目的是鑒定其序列的一些部分相同或者高度同源的生物體，特別是遺傳修飾植物(GM植物)或者生物體(GMO)的檢測(cè)。
0026 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提出了方法，該方法簡(jiǎn)化了對(duì)生物樣品(特別是獲得遺傳修飾植物的生物樣品)中存在的遺傳物質(zhì)的來(lái)源鑒定。
定義0027 術(shù)語(yǔ)“核酸、寡核苷酸、陣列、探針、靶標(biāo)核酸、基本結(jié)合、與......特異雜交、背景、定量”是在國(guó)際專利申請(qǐng)WO97/27317中描述的術(shù)語(yǔ)，在此引用作為參考。
0028 術(shù)語(yǔ)“核苷酸三磷酸，核苷酸、引物序列”是在文獻(xiàn)WO00/72018和PCT/BE00/00123中描述的術(shù)語(yǔ)，在此引用作為參考。
0029 術(shù)語(yǔ)“同源的遺傳序列”或者“同源的核苷酸序列元件”指的是在對(duì)應(yīng)位置具有相同氨基酸或者核苷酸的百分比高于完全隨機(jī)的比對(duì)。當(dāng)它們顯示最低同源性(或序列一致性)時(shí)，它們被認(rèn)為是同源的，同源性定義為在考慮到要比較的兩個(gè)序列中的一個(gè)中具有添加或者缺失(如缺口)對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)后，在每一個(gè)位置發(fā)現(xiàn)的相同核苷酸或氨基酸占全部核苷酸或氨基酸的百分比。編碼給定蛋白、但是存在于遺傳上不同來(lái)源例如不同生物體中的基因，通常是同源的。在給定的生物體中，編碼同一家族蛋白或酶(白細(xì)胞介素，細(xì)胞色素b，p.450)的基因也通常是同源的。由于同源序列可以只在一部分、幾個(gè)部分或者全部序列同源，所以同源的程度(或者序列一致性)可以有很大差異。序列中相同的序列的同源部分是完全同源的，也被稱為保守或者相同的。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的遺傳構(gòu)建可能含有相同或者同源部分，例如此后定義為核苷酸序列元件的序列部分。
0030 這些核苷酸序列元件包括調(diào)控序列，例如終止子、啟動(dòng)子或者摻入到植物基因組中的目標(biāo)基因(抗生素標(biāo)記)或者涉及目標(biāo)分子產(chǎn)生的序列或者這些序列的部分。這些核苷酸序列元件還可能是重復(fù)序列和/或編碼特異酶活性的序列或者這些序列的部分。呈現(xiàn)保守三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通常由同源序列編碼，更經(jīng)常由獨(dú)特外顯子編碼。
0031 在序列中顯示高度恒定性的序列被稱為高度保守的，并且它們具有高度同源性。
“遺傳圖”是這些各種不同核苷酸序列元件在生物體基因組中，優(yōu)選在植物基因組中的組織。
0032 “生物樣品”指的是可以包含不同和多個(gè)遺傳修飾植物特異的或具有遺傳修飾植物來(lái)源的核苷酸序列元件的任何介質(zhì)。
0033 例如，這種生物樣品可以是食品、食品組分或者食品添加劑。
0034 生物樣品還可以是可能被遺傳修飾植物污染的固體或液體提取物?？梢詫?duì)生物樣品進(jìn)行這些遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的提取步驟。
0035 術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾植物”指的是所有類型的經(jīng)過一定遺傳修飾的植物，特別是向植物中插入了包含對(duì)于該植物為外源元件(包圍目標(biāo)基因和/或遺傳標(biāo)記的啟動(dòng)子和終止子序列)的盒序列。
發(fā)明概述0036 本發(fā)明涉及對(duì)生物樣品中不同的多種核苷酸序列元件進(jìn)行鑒定和/或定量的方法，該序列元件是遺傳修飾植物特異的，方法包括以下步驟a.可能從生物樣品中提取核苷酸序列元件；b.使用能夠擴(kuò)增所述核苷酸序列元件的引物對(duì)將核苷酸序列元件擴(kuò)增或者復(fù)制成靶標(biāo)核苷酸序列，所述的核苷酸序列元件與存在于至少兩種不同的遺傳修飾植物中的核苷酸序列元件是同源的；c.可能對(duì)獲得的靶標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行標(biāo)記；d.將獲得的靶標(biāo)核苷酸序列與通過共價(jià)連接結(jié)合在固相支持物表面上特定位置的不溶性固體支持物的單鏈捕獲核苷酸序列接觸；e.通過檢測(cè)所述靶標(biāo)核苷酸序列與其位于特定位置的相應(yīng)的捕獲序列互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交產(chǎn)生的信號(hào)，檢測(cè)所述靶標(biāo)核苷酸序列的結(jié)合，其中捕獲核苷酸序列被結(jié)合在不溶性固相支持物上根據(jù)陣列(陣列的密度是每cm2固相支持表面4個(gè)不同的結(jié)合單鏈捕獲核苷酸序列)的特定位置上，其中的捕獲核苷酸序列包含的序列具有10到200個(gè)堿基，優(yōu)選在10到49個(gè)堿基，這使捕獲核苷酸與待檢測(cè)的和/或定量的靶標(biāo)核苷酸之間發(fā)生特異雜交；f.對(duì)于第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)或者更多所述遺傳修飾植物特異的不同核苷酸序列元件，重復(fù)步驟b)到e)；g.通過生物樣品中這些不同和多個(gè)核苷酸序列元件的存在或者不存在，確定遺傳修飾的植物。
0037 本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)對(duì)于一些應(yīng)用可以通過使用特殊擴(kuò)增與微陣列檢測(cè)相組合的策略確定生物體的遺傳圖而大幅度簡(jiǎn)化對(duì)可能存在于具有同源序列的分析樣品中的其他許多生物體中的一種或者幾種生物體的鑒定。該方法組合了使用共存引物對(duì)進(jìn)行有限數(shù)目擴(kuò)增的步驟以及檢測(cè)、定量和/或記錄陣列上與靶標(biāo)核苷酸序列存在相對(duì)應(yīng)的單一信號(hào)(捕獲核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核苷酸序列之間的結(jié)合)，以及將所檢測(cè)的核苷酸序列的存在與進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的生物樣品中這些(微)生物體特異核苷酸序列元件(存在或者不存在)的鑒定相互聯(lián)系起來(lái)。
0038 根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置使得可以從其他同源序列元件中，容易地鑒定/檢測(cè)生物體特異的核苷酸序列元件，也可能使其容易地定量(對(duì)在生物樣品中的這些生物體的拷貝或者存在的數(shù)目進(jìn)行表征)。
0039 在與支持物或者基質(zhì)上存在的特異捕獲核苷酸序列(優(yōu)選以陣列的形式)結(jié)合之后，獲得鑒定。在洗掉可能的污染物(未結(jié)合的序列)之后，通過檢測(cè)和可能記錄一個(gè)靶標(biāo)序列、在一個(gè)特定位置的單一斑點(diǎn)信號(hào)(其中對(duì)應(yīng)的捕獲核苷酸序列是以前結(jié)合上的)，直接獲得對(duì)靶標(biāo)序列的鑒定，但是其中靶標(biāo)序列的確定不是對(duì)微陣列上復(fù)雜斑點(diǎn)型式分析的結(jié)果，并且其中不需要擴(kuò)增的靶標(biāo)序列的片段化。
0040 通過使用結(jié)合的捕獲核苷酸序列(至少由兩部分組成，一是通過單一并且便利地是預(yù)先確定的(確定的)連接與固相支持物表面結(jié)合的間隔物，優(yōu)選是無(wú)孔的支持物；另一部分是能夠通過與擴(kuò)增的核苷酸靶標(biāo)序列互補(bǔ)堿基配對(duì)而特異雜交的特異核苷酸序列)，可以以高敏感性在陣列上將單鏈甚至是雙鏈靶標(biāo)序列有利地與其他同源序列區(qū)別開來(lái)。
0041 而且，如果高濃度的捕獲核苷酸序列結(jié)合在固相支持物表面，則該檢測(cè)被極大地增加。
0042 本發(fā)明涉及將對(duì)于生物體或者其部分(可能存在于生物樣品中)特異的核苷酸序列元件，從其他不同的生物體或者變種中獲得的至少4種同源(或者相同)核苷酸序列中鑒定出來(lái)，所述的其他生物體可能存在于同一生物樣品中并且具有與樣品中待檢測(cè)和/或定量的元件同源或者相同的核苷酸序列元件。
0043 所述的鑒定(在樣品中存在或者不存在這些元件)是如下得到的，即首先通過幾個(gè)共有引物對(duì)對(duì)核苷酸序列元件遺傳擴(kuò)增，然后(在洗滌之后)對(duì)來(lái)自這些擴(kuò)增步驟的可能不同的擴(kuò)增靶標(biāo)序列進(jìn)行區(qū)別。該區(qū)別通過在結(jié)合在固相支持物表面給定(特異和預(yù)先確定的)位置的捕獲核苷酸序列的陣列上進(jìn)行雜交而便利地獲得。
0044 通過對(duì)這些靶標(biāo)序列與它們位于預(yù)期位置的對(duì)應(yīng)捕獲核苷酸序列特異結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)(對(duì)于特定靶標(biāo)序列結(jié)合特異的單一位置信號(hào))進(jìn)行檢測(cè)和可能的記錄，不同靶標(biāo)核苷酸序列的存在和/或不存在使得可以對(duì)樣品中不同特異核苷酸序列元件的存在和/或不存在進(jìn)行確定。
0045 根據(jù)本發(fā)明的方法還包括將樣品中核苷酸序列元件的存在和/或不存在與下列各項(xiàng)的存在和/或鑒定聯(lián)系起來(lái)-特異的生物體，-遺傳修飾的生物體(GMO)，特別是遺傳修飾的植物，-序列中的遺傳特征(突變、缺失、插入)，-遺傳疾病探測(cè)的誘因或發(fā)展(監(jiān)測(cè))，包括生物樣品來(lái)源的患者(包括人)的癌癥。
0046 該方法特別適于在生物樣品中檢測(cè)和篩選GMO或者其他生物體或者其部分，這些生物樣品的基因組序列一些部分(元件)相同或者高度同源(優(yōu)選具有80％以上甚至90％以上的同源性)，一些部分不同，由于這個(gè)原因樣品中可能存在大量這些生物體。
0047 本發(fā)明使得可以在一次單一檢測(cè)中在陣列上對(duì)核苷酸序列元件進(jìn)行鑒定(在它們擴(kuò)增為靶標(biāo)核苷酸序列之后)，在檢測(cè)后確定存在和不存在。所述檢測(cè)優(yōu)選與確定這些生物體遺傳圖相當(dāng)。
0048 實(shí)際上，被檢測(cè)元件的一些或者全部在生物體不同遺傳圖中存在或者不存在使得可以對(duì)存在于生物樣品中的特異生物體進(jìn)行鑒定。還可以將這些元件存在或者不存在與數(shù)據(jù)庫(kù)或者表格相關(guān)聯(lián)，數(shù)據(jù)庫(kù)或者表格包含被查詢?cè)乃羞z傳圖，用于對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的每一種生物體進(jìn)行正確鑒定。
0049 在特定的實(shí)施方案中，該方法還提供了檢測(cè)和/或鑒定屬于一個(gè)家族(family)一部分的生物體的手段，該生物體具有特定的遺傳元件，但是被分類為不屬于具有每一個(gè)被檢測(cè)生物體遺傳圖的數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分。
0050 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還提供了計(jì)算機(jī)程序形式的用于對(duì)從不同元件的檢測(cè)和/或鑒定以及生物體的鑒定中獲得的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析的手段。該程序還優(yōu)選地提供了數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)具有可能的可檢測(cè)的生物體的元件組成。
0051 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不同生物體遺傳圖的元件排列成為表格，檢測(cè)的結(jié)果逐一與表格的數(shù)據(jù)比較。
0052 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明適于對(duì)具有一個(gè)或者幾個(gè)被查詢的元件的生物體進(jìn)行確定，但是不適于確定被查詢生物體的所有特征性元件。然后該生物體被引用稱為未知生物體。
0053 本發(fā)明優(yōu)選需要包括所述元件的表格以及從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分選出生物體鑒定的方法。
0054 在特定的實(shí)施方案中，使用相同的引物對(duì)來(lái)自不同生物體的序列進(jìn)行全部或者部分?jǐn)U增，得到的靶標(biāo)序列在通用的(common)捕獲序列上進(jìn)行檢測(cè)。
0055 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用相同的引物對(duì)來(lái)自不同生物體的靶標(biāo)序列進(jìn)行全部或者部分?jǐn)U增，但是在特異的捕獲序列上檢測(cè)。
0056 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，陣列含有對(duì)不同生物體的相同(擴(kuò)增的)靶標(biāo)核苷酸序列特異的捕獲序列以及對(duì)來(lái)自不同生物體的相同(擴(kuò)增的)靶標(biāo)核苷酸序列通用的捕獲序列。
0057 特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明對(duì)插入了如表I和II所示的外源核苷酸序列元件的GMO植物實(shí)施。GMO的元件根據(jù)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。在特定的應(yīng)用中，6個(gè)元件(或者它們的部分)分別是P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab、EPSPS，使用實(shí)施例2中提供的6個(gè)引物對(duì)在3個(gè)不同試管中對(duì)上述6個(gè)元件進(jìn)行擴(kuò)增。該方法有利地包括了檢測(cè)CaMV可能存在以及鑒定植物物種的適宜對(duì)照。
0058 在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定數(shù)目多于(擴(kuò)增的)靶標(biāo)核苷酸靶標(biāo)序列數(shù)目的生物體的方法，能夠被檢測(cè)的生物體數(shù)目是擴(kuò)增的數(shù)目加上至少2，較好加上5，更好加上10。
0059 本方法應(yīng)用于(表1的)9個(gè)GMO檢測(cè)和/或鑒定，以及應(yīng)用于(表2的)21個(gè)GMO的檢測(cè)和/或鑒定。
0060 在實(shí)施例3中通過兩兩比較要檢測(cè)的遺傳元件對(duì)GMO生物體進(jìn)行鑒定的實(shí)例在表3中給出。在該實(shí)施例中以及給定的在微陣列上檢測(cè)的特定元件中，除了3個(gè)與另外一個(gè)生物體具有相同作圖的生物體以外，遺傳圖對(duì)每個(gè)GMO都是特異的。表4中顯示的結(jié)果顯示GMO可以被定量，并且檢測(cè)水平低于樣品中存在的0.1％ GMO。該方法特別適于在生物樣品中低濃度存在的生物體進(jìn)行多重和綜合分析。
0061 根據(jù)本發(fā)明，遺傳擴(kuò)增的優(yōu)選方法是使用兩個(gè)反平行引物進(jìn)行的PCR，引物對(duì)于要被擴(kuò)增的特定序列而言是共有的。
0062 要被檢測(cè)和/或被定量的生物體可能存在于任何生物材料中，包括獲得的遺傳物質(zhì)(病毒、真菌、細(xì)菌、植物或者動(dòng)物細(xì)胞包括人)。生物樣品也可以是任何培養(yǎng)基，其中也存在微生物體、異生物(xenobiotic)或者污染物，以及這些來(lái)自植物或者動(dòng)物(包括人)器官、組織、細(xì)胞或生物體液(血液、血清、尿等等)的這些提取物。
0063 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或者裝置也可以摻入各種不同培養(yǎng)基或裝置，用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。所述的試劑盒(或裝置)也可以包括在自動(dòng)化的裝備中，例如用于檢測(cè)和/或定量待分析生物樣品中存在的多個(gè)核苷酸序列的高通量篩選設(shè)備。所述的試劑盒或設(shè)備可以進(jìn)行調(diào)整，用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明方法的全部步驟或者只進(jìn)行幾個(gè)特定的步驟。
0064 本發(fā)明的探測(cè)和/或定量試劑盒可以包含用于進(jìn)行本發(fā)明的手段和介質(zhì)，優(yōu)選是不溶性固相支持物，在其上結(jié)合單鏈捕獲核苷酸序列，所述的單鏈捕獲核苷酸序列含有大約10到大約200個(gè)堿基的序列，這些序列對(duì)待檢測(cè)和/或定量的總長(zhǎng)度在大約30和大約600個(gè)堿基之間的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab、EPSPS核苷酸序列中的至少三個(gè)是特異的，所述單鏈捕獲核苷酸序列置于根據(jù)陣列的固相支持物表面，密度至少是每cm2固相支持物表面4個(gè)單鏈捕獲核苷酸序列。
0065 可以使用特異鑒定(探測(cè)和/或定量)試劑盒或裝置實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法，試劑盒或裝置至少包含不溶性固相支持物，其上以陣列結(jié)合一些單鏈捕獲核苷酸序列(優(yōu)選地是通過直接共價(jià)結(jié)合或者通過間隔物的結(jié)合至固體支持物表面)，密度至少是每cm2不溶性固相支持物表面4，優(yōu)選至少是10、16、20、50、100、1000、4000、10000或者更多不同的捕獲核苷酸序列，所述的捕獲核苷酸序列有利地具有的長(zhǎng)度包含大約30和大約600個(gè)堿基(包括間隔物)并且含有大約10到大約60個(gè)堿基的序列，所述的序列對(duì)靶標(biāo)是特異的(這表示所述序列的所述堿基能夠通過互補(bǔ)雜交，與它們?cè)诎袠?biāo)序列上的互補(bǔ)堿基形成結(jié)合)。優(yōu)選地，所述雜交在嚴(yán)謹(jǐn)條件下獲得(在本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的條件下)。
0066 在根據(jù)本發(fā)明的該方法、(試劑盒(裝置)或者設(shè)備)，與靶標(biāo)互補(bǔ)的捕獲核苷酸序列的部分(或者部分)包含大約10到大約60個(gè)堿基，優(yōu)選大約15到大約40個(gè)堿基，更優(yōu)選大約20到大約30個(gè)堿基。這些堿基優(yōu)選地為位于靶標(biāo)核苷酸序列末端或者靠近末端的連續(xù)序列。該序列被認(rèn)為是對(duì)檢測(cè)特異的序列。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，位于特異捕獲核苷酸序列和支持物之間的序列是非特異的序列。
0067 在根據(jù)本發(fā)明的該方法、(試劑盒(裝置)或者設(shè)備)中，捕獲核苷酸序列是具有16到600個(gè)堿基數(shù)目、優(yōu)選30到300個(gè)堿基、更優(yōu)選40到150個(gè)堿基的序列，且間隔物是至少6.8nm長(zhǎng)(至少4個(gè)碳鏈)的化學(xué)鏈，是20個(gè)堿基以上、優(yōu)選50到150個(gè)堿基長(zhǎng)的核苷酸序列，或者是核苷酸的衍生物例如PMA。
0068 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲核苷酸序列通過化學(xué)合成為單鏈。它們是多聚核苷酸，或者是短于100個(gè)堿基的寡聚核苷酸或者是長(zhǎng)于100個(gè)堿基，在設(shè)定好程序的自動(dòng)合成儀上，單鏈很容易合成。這些序列可以具有官能基團(tuán)例如硫化物的胺，用于以高濃度共價(jià)結(jié)合在支持物上。
0069 通常大于100或者甚至大于150個(gè)核苷酸的長(zhǎng)捕獲核苷酸序列優(yōu)選地通過PCR擴(kuò)增(摻入到含有該捕獲核苷酸序列的特異部分和非特異部分(間隔物)的質(zhì)粒中的序列)合成。
0070 根據(jù)本發(fā)明的方法、(試劑盒(裝置)或者設(shè)備)，適于對(duì)由DNA或RNA組成的核苷酸序列(包括與其全長(zhǎng)部分或者完全同源的序列)進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。
0071 在根據(jù)本發(fā)明的該方法、(試劑盒(裝置)或者裝備)中，捕獲核苷酸序列有利地共價(jià)結(jié)合(或固定)在不溶性固相支持物上，優(yōu)選地通過它們的一端，如后面的描述。
0072 根據(jù)本發(fā)明的方法給出顯著的結(jié)果，使對(duì)溶液中濃度低于大約10nM，低于大約1nM，優(yōu)選地低于大約0.1nM，更為優(yōu)選地低于大約0.01nM(＝1 fmole/100μl)的擴(kuò)增子進(jìn)行鑒定(檢測(cè)和定量)。
0073 本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是在表面上使用濃度非常高的捕獲核苷酸序列。使用自動(dòng)化機(jī)器點(diǎn)樣制備陣列，點(diǎn)樣的溶液體積非常小，在0.1到1n1的量級(jí)，斑點(diǎn)的面積大約是直徑0.2到0.4nm。如果太低的話，結(jié)合的產(chǎn)量迅速降低并且不能被檢測(cè)。在點(diǎn)樣溶液中優(yōu)選的捕獲核苷酸序列濃度為大約600到大約3000nM。但是濃度低至100nM在有利的情況下(當(dāng)共價(jià)固定的產(chǎn)量高或者待檢測(cè)的靶標(biāo)是單鏈并且以高濃度存在)，仍然可以給出陽(yáng)性結(jié)果。這種低的點(diǎn)樣濃度可以給出密度低至20fmole每cm2的捕獲核苷酸序列。另一方面，較高的密度在檢測(cè)中只受到捕獲溶液濃度的限制，但是高于3000nM的濃度給出良好的結(jié)果。
0074 使用這些非常高濃度和長(zhǎng)的探針是本發(fā)明的兩個(gè)不可預(yù)見的特征。DNA雜交理論提出溶液中兩個(gè)DNA互補(bǔ)序列之間的雜交速率與DNA長(zhǎng)度的平方根成正比，其中較小的DNA是限制因素(Wetmur，J.G.和Davidson，N.1968.J.Mol.Biol.3，584)。為了獲得所需的特異性，捕獲核苷酸序列的特異序列與靶標(biāo)相比應(yīng)當(dāng)小。而且，靶標(biāo)核苷酸序列在PCR擴(kuò)增后獲得，是雙鏈的，所以它們?cè)谌芤褐械闹匦陆Y(jié)合要比與固定在固相支持物上的小序列的雜交快得多，在固相支持物上擴(kuò)散很慢所以使反應(yīng)的速率進(jìn)一步降低。觀察到與相同的短特異序列的雜交產(chǎn)量有如此大的增加，這是不可預(yù)見的。
0075 與存在的捕獲核苷酸序列的量相比，與斑點(diǎn)“結(jié)合”的靶標(biāo)核苷酸序列的量是非常小的。因此捕獲核苷酸序列大大過量，并且如果存在更多的捕獲核苷酸序列沒有理由得到結(jié)合。
0076 可以在擴(kuò)增或復(fù)制之后對(duì)全長(zhǎng)序列進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)通過摻入標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，在雜交的靶標(biāo)上存在較多的標(biāo)記，這樣使檢測(cè)變得敏感。
0077 根據(jù)本發(fā)明的該方法、(試劑盒和設(shè)備)，可以包含使用其他結(jié)合的捕獲核苷酸序列，它們與前面的捕獲核苷酸可能具有相同的性質(zhì)，可以用于從另一組同源序列中鑒定靶標(biāo)序列(優(yōu)選地通過共同引物擴(kuò)增)。
0078 對(duì)其他序列的檢測(cè)可以有利地在相同的陣列上進(jìn)行(即與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列進(jìn)行雜交)，使用對(duì)相同靶標(biāo)的共有捕獲核苷酸序列。所述的其他捕獲核苷酸序列(可能)具有長(zhǎng)于10到60個(gè)堿基的特異序列，總長(zhǎng)度可達(dá)600個(gè)堿基，并且也結(jié)合在不溶性固相支持物上(優(yōu)選地在使用與本發(fā)明相關(guān)的另一個(gè)結(jié)合的捕獲核苷酸序列制備的陣列中)。長(zhǎng)的捕獲核苷酸序列也可以在陣列上存在，作為共有捕獲核苷酸序列，用于與給定遺傳元件的所有序列雜交，這樣提供了在生物樣品中某一家族的生物體是否存在的信息。
0079 根據(jù)本發(fā)明的固相支持物是使用選自以下各項(xiàng)的材料制備的凝膠層、玻璃、電子裝置、硅或者塑料支持物、多聚物、光盤、金屬支持物或者上述的混和物(參見EP 0 535 242，US 5,736,257，WO99/35499，US 5,552,270等等)。有利地，所述的固相支持物是單一玻片，它可能包含其他的工具(條碼、標(biāo)記等)或者基質(zhì)用于改善根據(jù)本發(fā)明的方法。
0080 在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的擴(kuò)增步驟有利地通過眾所周知的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行，優(yōu)選地選自由PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、ICR或Avalanche DNA技術(shù)。
0081 有利地，待鑒定的靶標(biāo)核苷酸序列在其與單鏈捕獲核苷酸序列雜交之前進(jìn)行標(biāo)記。所述的標(biāo)記(使用對(duì)本領(lǐng)域人員已知的技術(shù))優(yōu)選地還在變性之前(如果該方法包括擴(kuò)增步驟)，在擴(kuò)增的靶標(biāo)核苷酸序列上獲得。
0082 有利地，靶標(biāo)核苷酸序列長(zhǎng)度的選擇為有限長(zhǎng)度，優(yōu)選為50和800個(gè)堿基，優(yōu)選為100和400個(gè)堿基，更優(yōu)選為100和200個(gè)堿基。這個(gè)優(yōu)選的需要取決于找到用于擴(kuò)增樣品中可能存在的所需序列的共有引物的可能性。過長(zhǎng)的核苷酸序列靶標(biāo)可能會(huì)更快地重新分配并且形成在捕獲核苷酸序列上固定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
0083 基因的檢測(cè)也是本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用。如本發(fā)明中描述的，通過首先對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄然后使用共有引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得對(duì)同源基因的檢測(cè)。
0084 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的方法、(試劑盒(裝置)或者設(shè)備)有利地用于在生物樣品中共同或者分別存在的不同GMO的鑒定，所述的鑒定是通過對(duì)摻入到植物或動(dòng)物或細(xì)菌或酵母中的核苷酸序列元件(通過它們的基因組的遺傳修飾)的檢測(cè)而獲得的。
0085 優(yōu)選地，引物和待擴(kuò)增和檢測(cè)的所述GMO序列的特異部分在實(shí)施例2和3中給出。這些引物擴(kuò)增以下核苷酸序列元件(如果存在與樣品中)中至少3個(gè)的部分或者全部序列P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS，然后在陣列上檢測(cè)。
0086 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的方法、(試劑盒(裝置)或者設(shè)備)有利地用于鑒定至少4個(gè)以下的GMO植物BT11，BT176，Ga21，Mon810，RRS，T25，T45，Topas 19/2，Starlink，NK603，GT73，Liberator L62，F(xiàn)alcon GS 40/90，MS1-RF1，MS1-RF2，MS8-RF3，1445，531，Mon 863，Mon810×Mon863，TC1507和Maisgard/RR。
0087 根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)9個(gè)植物GMO在表1和實(shí)施例2和3中給出。在

圖1中給出進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的陣列。在表2中給出對(duì)21個(gè)植物GMO的檢測(cè)，對(duì)GMO進(jìn)行單獨(dú)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)在表3中給出。在數(shù)據(jù)庫(kù)如BATS(http//www.gmo-watch.org/gmo-watch/GVO-report140703.pdf)和AgBios(http//www.agbios.com/dbase.php)中給出了GMO的清單。
0088 數(shù)據(jù)庫(kù)還提供了在GMO中存在的核苷酸序列元件的清單。已知和未知的概念通常與在食物中(谷物或動(dòng)物飼料中)被接受的或者未被接受的GMO有關(guān)。被接受的GMO是眾所周知的，且已知它們的遺傳圖中遺傳元件的存在。未被接受的GMO是未知的。本發(fā)明在對(duì)未知GMO的身份進(jìn)行預(yù)測(cè)或者不進(jìn)行預(yù)測(cè)的情況下檢測(cè)未知GMO的存在。
0089 在陣列上雜交之后，靶標(biāo)核苷酸序列可以通過現(xiàn)有的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。不進(jìn)行標(biāo)記，優(yōu)選的方法是通過現(xiàn)已適合于陣列的質(zhì)譜方法(US-A-5,821,060)或者使用嵌入物質(zhì)之后用熒光檢測(cè)(WO97/27329或者Fodor等，Nature 364，p.555(1993))對(duì)靶標(biāo)的鑒定。
0090 標(biāo)記關(guān)聯(lián)的檢測(cè)有多個(gè)。在WO 97/27317中給出了不同標(biāo)記分子的綜述。通過使用已經(jīng)標(biāo)記的引物或者在復(fù)制或者擴(kuò)增步驟中摻入標(biāo)記的核苷酸，獲得這些標(biāo)記的分子。還可以通過將可以被檢測(cè)的部分與待測(cè)的RNA或DNA連接獲得標(biāo)記(使用連結(jié)酶將標(biāo)記的寡聚核苷酸連接在序列的末端)。RNA或DNA的片段也可以在其5′OH或者3′OH末端使用激酶、轉(zhuǎn)移酶或者類似的酶，摻入標(biāo)記的核苷酸。
0091 最經(jīng)常使用和優(yōu)選的標(biāo)記是熒光色素例如Cy3、Cy5和Cy7，適于使用商品化可獲得的掃描儀(General Scanning，GeneticMicrosystem，......)對(duì)陣列進(jìn)行分析。
0092 使用小分子進(jìn)行放射性標(biāo)記、冷標(biāo)記或者間接標(biāo)記也是常見的方法，所述的小分子被特異的配基(鏈親和素或者抗體)識(shí)別。得到的靶標(biāo)固定在陣列上的信號(hào)是熒光的、比色的、擴(kuò)散、電發(fā)光的、生物或化學(xué)發(fā)光的、磁的、電的如阻抗的或者電壓的(US-A-5,312,527)。優(yōu)選的方法基于使用金標(biāo)記結(jié)合的靶標(biāo)以獲得沉淀，或者使用然后很容易被掃描儀檢測(cè)和定量的銀染色。
0093 定量不僅需要考慮到雜交產(chǎn)量和陣列上的檢測(cè)比例(對(duì)于靶標(biāo)核苷酸序列和參考序列是相同的)，而且要考慮提取、擴(kuò)增(或者復(fù)制)和標(biāo)記的步驟。
0094 根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括使用以已知濃度加入的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列(外部或者內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))獲得靶標(biāo)核苷酸序列定量的手段。捕獲核苷酸序列也存在于陣列上，這樣以與靶標(biāo)核苷酸序列相同的條件固定標(biāo)準(zhǔn)(可能在擴(kuò)增或者復(fù)制之后)；該方法包括對(duì)來(lái)自捕獲核苷酸序列和標(biāo)準(zhǔn)之間互補(bǔ)堿基配對(duì)形成的雙鏈核苷酸序列產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行定量的步驟，以及對(duì)來(lái)自雙鏈核苷酸序列形成產(chǎn)生的信號(hào)與來(lái)自捕獲核苷酸序列和靶標(biāo)之間互補(bǔ)堿基配對(duì)形成的雙鏈核苷酸序列產(chǎn)生的信號(hào)之間相關(guān)性分析的步驟，目的是定量在生物樣品中要被檢測(cè)的和/或定量的核苷酸序列元件的存在。
0095 有利地，標(biāo)準(zhǔn)加入到生物樣品中或者在提取步驟之后加入，并且用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增或復(fù)制，和/或標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)度和GC含量與靶標(biāo)核苷酸序列相同或者相差不超過20％。更優(yōu)選地，將標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，具有在文件WO98/11253中給出的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的特點(diǎn)。該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的序列的一部分與靶標(biāo)相同，另外還有一個(gè)不同的特異部分。它還在其兩個(gè)末端或者靠近末端具有與用于擴(kuò)增或復(fù)制靶標(biāo)核苷酸序列的兩個(gè)引物互補(bǔ)的序列，以及相似的GC含量(WO98/11253)。
0096 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)和靶標(biāo)核苷酸序列的共同部分指的是與由相同引物擴(kuò)增出的所有靶標(biāo)核苷酸序列同源的核苷酸序列(即核苷酸屬于要定量的相同家族或生物體)。
0097 優(yōu)選地，通過這個(gè)特異序列的標(biāo)準(zhǔn)的雜交產(chǎn)量同靶標(biāo)序列的雜交產(chǎn)量相同或者相差不超過20％，根據(jù)WO98/11253的描述進(jìn)行定量。
0098 在試劑盒(裝置)或者設(shè)備中也有利地包括標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列外部和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，有可能包括進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明不同步驟的所有介質(zhì)和手段(雜交和培養(yǎng)介質(zhì)、聚合酶和其他酶、標(biāo)準(zhǔn)序列、標(biāo)記分子等等)。
0099 有利地，生物芯片還含有用于特異檢測(cè)一些由特異引物對(duì)擴(kuò)增的特異擴(kuò)增靶標(biāo)核苷酸序列的斑點(diǎn)。優(yōu)選地加入這些斑點(diǎn)用于對(duì)一個(gè)生物體鑒定的確證或者區(qū)分兩個(gè)非常同源或者相同的核苷酸序列元件。
0100 有利地，生物芯片還含有具有多種不同(即4)濃度的被標(biāo)記的捕獲核苷酸序列的斑點(diǎn)。這些標(biāo)記的捕獲核苷酸序列從已知濃度的溶液點(diǎn)樣，并且它們的信號(hào)可以將雜交的結(jié)果轉(zhuǎn)化為絕對(duì)的量。它們還使得可以對(duì)檢測(cè)的重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試。
0101 固相支持物(生物芯片)可以插入到一個(gè)支持物中，其通過基于微流體技術(shù)的液體溶液的控制與另一個(gè)小室和自動(dòng)化機(jī)器相連。通過插入這樣一個(gè)微型實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中，其可以被自動(dòng)孵育、加熱、洗滌和標(biāo)記，甚至是對(duì)于前面的步驟(象DNA提取、PCR擴(kuò)增)或者接下來(lái)的步驟(標(biāo)記和檢測(cè))。所有這些步驟可以在相同的固定支持物上進(jìn)行。
0102 有利地，生物芯片還含有用于檢測(cè)和/或鑒定和/或定量植物物種的捕獲核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，植物物種的鑒定還用于對(duì)某植物物種特異的特定GMO的鑒定。
0103 在特定的實(shí)施方案中，植物或生物體的特異核苷酸序列元件，用于植物或生物體的鑒定，在特殊的實(shí)施方案中用于GMO的鑒定。
0104 優(yōu)選地對(duì)生物體中存在的遺傳元件的信號(hào)進(jìn)行定量，而對(duì)該生物體定量。
0105 在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)生物體相對(duì)于其家族定量，通過比較該生物體特異的靶標(biāo)核苷酸序列的量與該家族特異的靶標(biāo)核苷酸序列的量進(jìn)行。更為具體的是，通過將樣品中存在的特異GMO元件的量與植物標(biāo)記進(jìn)行比較，對(duì)GMO進(jìn)行定量。二者之比可以計(jì)算在樣品中一種植物物種的GMO的百分比。
0106 有利地，通過比較生物體的特異的靶標(biāo)數(shù)量與在被分析的溶液中加入的給定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝對(duì)樣品中特定生物體的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的定量與以已知拷貝數(shù)摻入到檢測(cè)方法中的標(biāo)準(zhǔn)序列的定量進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的定量與該植物未轉(zhuǎn)化部分的基因或者序列的定量進(jìn)行比較。
0107 在特定的實(shí)施方案中，在使用加尾引物然后再用與該尾巴相同或者互補(bǔ)的第二組引物對(duì)靶標(biāo)核苷酸序列和標(biāo)準(zhǔn)PCR之后，進(jìn)行定量。第一組加尾引物具有相同的尾巴，針對(duì)的是特異元件和標(biāo)準(zhǔn)或者植物標(biāo)記，如Knut等，Nucleic Acids Res.2003 Jun 1；31e62的描述。首先使用加尾引物進(jìn)行5到20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，然后破壞加尾引物，加入(第二組)引物進(jìn)行5到40個(gè)循環(huán)。
0108 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在加尾引物和第二組尾巴引物在擴(kuò)增開始時(shí)就同時(shí)存在而對(duì)第一組引物沒有任何破壞的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，加尾引物和通用尾巴引物之間的適當(dāng)比例是，至少低5倍，優(yōu)選低10倍。
0109 有利地，對(duì)于GMO的定量和檢測(cè)方法進(jìn)行的范圍是與非GMO植物相比，樣品中存在0.1到5％GMO。通常標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線包含的GMO樣品為在非GMO物種中0.1，0.5，1，2和5％的GMO。已知含有GMO的樣品中標(biāo)記的和/或檢測(cè)的調(diào)控范圍在0.9％和0.5％之間。未知的GMO是沒有被識(shí)別作為被接受用于商業(yè)流通的GMO，因此在樣品中不能找到。需要檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中低至0.1％的這種未知GMO。
0110 在以下的非限制性實(shí)施例中參考所附的圖片對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
附圖簡(jiǎn)述0111 圖1表示了用于檢測(cè)GMO不同元件以及用于實(shí)施例3中所述的篩選和鑒定的陣列的設(shè)計(jì)。
0112 圖2給出了對(duì)根據(jù)本發(fā)明中提供的陣列，對(duì)2個(gè)GMO分析結(jié)果的實(shí)例。
0113 圖3給出了對(duì)根據(jù)本發(fā)明中提供的陣列，對(duì)2個(gè)GMO分析結(jié)果的實(shí)例。
0114 圖4表示了根據(jù)本發(fā)明中提供的陣列對(duì)不同濃度的幾個(gè)GMO進(jìn)行分析的總體結(jié)果。
實(shí)施例1在陣列上檢測(cè)靶標(biāo)序列捕獲核苷酸序列和靶標(biāo)的制備0115 使用以下的實(shí)驗(yàn)方案通過PCR獲得靶標(biāo)核苷酸序列。
0116 PCR在含有下列各項(xiàng)的終體積25μl中進(jìn)行1×BufferBiotools包括2mM MgCl2，0.2μM每個(gè)引物，其中一個(gè)引物生物素化，200μM每種dATP、dCTP、dGTP和400μM dUTP，1.25U Taq DNA聚合酶Biotools，0.5U UNG。樣品首先在22℃孵育10分鐘，然后在94℃變性5min。然后進(jìn)行由以下組成的35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增94℃ 30秒，5640秒和72℃ 1分鐘，最終的延伸步驟是72℃ 10分鐘。與UNG在20℃下孵育10min然后95℃ 10min失活。使用水對(duì)照作為擴(kuò)增的陰性對(duì)照。捕獲核苷酸的序列是單鏈核苷酸。
0117 生物芯片還含有陽(yáng)性對(duì)照，它們是已經(jīng)與其對(duì)應(yīng)的捕獲核苷酸序列雜交的生物素化的C2b2基因多聚核苷酸，以及陰性對(duì)照，它們是捕獲非特異的核苷酸序列。
捕獲核苷酸序列的固定化0118 根據(jù)Schena等的實(shí)驗(yàn)方案(Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，10614(1996))將胺化的DNA移植到醛衍生化的玻璃上。從濃度范圍在150到3000nM的溶液中點(diǎn)樣胺化的捕獲核苷酸序列。使用自制的自動(dòng)化裝置，將捕獲核苷酸序列印制在硅烷化的顯微鏡載玻片上(來(lái)自Genetix(UK)的250μm針，硅烷化(醛化)的顯微鏡載玻片來(lái)自Cell associates(Houston，USA))。斑點(diǎn)的直徑是400μm，分配的體積是大約0.5nl。載玻片在室溫下干燥，儲(chǔ)存于4℃直至使用。
雜交0119 用雜交框(frame)覆蓋陣列，根據(jù)生產(chǎn)商(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)的建議對(duì)陣列進(jìn)行處理。向50μl雜交溶液(Genomic HybriBuffer，Eppendorf，AG)中加入45μl含有擴(kuò)增子、封閉雜交溶液、陽(yáng)性雜交對(duì)照和一些水的溶液。根據(jù)所需的檢測(cè)水平和要摻入的擴(kuò)增子溶液的數(shù)目調(diào)整擴(kuò)增的靶標(biāo)核苷酸序列的體積。通常的實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)擴(kuò)增子溶液每種9μl進(jìn)行。將最終的溶液加到被雜交小室包圍的陣列上。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照我們向溶液中加入2nM生物素化的27bp C2b2探針；它們對(duì)應(yīng)的捕獲核苷酸序列點(diǎn)樣于陣列上。陣列事先與0.5N NaOH孵育進(jìn)行預(yù)變性。雜交在60℃進(jìn)行1h。使用洗滌緩沖液洗滌載玻片4次。
比色檢測(cè)0120 玻璃樣品在室溫下與800μl用封閉緩沖液1000×稀釋的膠體金標(biāo)記的鏈親和素共同孵育45min。使用洗滌緩沖液洗滌5次以后，金的存在用于銀還原的催化作用，其使用染色顯示溶液(Silverquant reagent，Eppendorf，Hamburg，Germany)。載玻片與Silverquant A和B溶液的顯示混合物孵育1次5min，然后用水潤(rùn)洗，干燥并使用微陣列閱讀儀進(jìn)行分析。然后用特殊的定量軟件對(duì)每個(gè)陣列(載玻片)進(jìn)行定量。
熒光檢測(cè)0121 玻璃樣品在室溫下與Cyanin 3或者Cyanin 5標(biāo)記的鏈親和素孵育45分鐘。載玻片洗滌后干燥，室溫儲(chǔ)存。在陣列掃描儀GSM418中進(jìn)行檢測(cè)(Genetic Microsystem，Woburn，MA，USA)。然后用特殊的定量軟件對(duì)每個(gè)陣列(載玻片)進(jìn)行定量。
實(shí)施例2 在陣列上檢測(cè)GMO靶標(biāo)序列GMO遺傳元件的分析0122 根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行三個(gè)PCR，擴(kuò)增以下的元件PCR1對(duì)于Nos終止子TTGAATCCTGTTGCCGGTCTT和CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG35S啟動(dòng)子CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG和TCTTGCGAAGGATAGTGGGATTnptIICTCGACGTTGTCACTGAAG和GATGGATACTTTCTCGGCAGPCR對(duì)照CCACCTGCTGACCCCGTC和GGGACCCTCGCCCAGAAACPCR2CaMV GTTGTTCTATTAGTTGCTCTT和ATGGCTAATCTTAATCAGATCCPnos-nptII CCTCGGTATCCAATTAGAGTC和TTGTCTGTTGTGCCCAGTCATPCR3PatGAGGCGCAAGGTTTTAAGTCT和CATCATGCCATCCACCATGCCry1AbCMCWCAGAACAACAAYGTGC和GWGCWCKGATGATGCTCACGEPSPSCAAGTCGMTYTCCMACCGG和CCTTGCCCGTATTGATGACG和GTCAAGGACCGCATTGCGA在捕獲核苷酸序列中存在以下的特異序列，用于待測(cè)的不同元件P35SGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATTnosGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCnptIIAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAgut(PCR對(duì)照)GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAApat1CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAAcry1CAGACGGTGGCTGAAGCCCTGTCGcry2GAGCCTGTGGGAAAAACCCTGCCT
cry3CAACCTGTGGGAGAATCCTTGCCTepsps7CTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGAepsps8TTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAGnptIIhCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCCaMVCGHTTTCATGGATTTTTGGTCACTG0123 捕獲核苷酸序列cry1對(duì)BT176是特異的；cry2對(duì)Mon 8110是特異的；cry3對(duì)BT11是特異的。捕獲核苷酸序列EPSPS7對(duì)GA1是特異的；EPSPS2對(duì)RRS是特異的。
0124 生物芯片還包括了植物物種的檢測(cè)。擴(kuò)增在分開的試管中進(jìn)行。
0125 用于擴(kuò)增Rubisco活化酶和蔗糖合酶的共有引物是引物 序列Rubisco活化酶基因Pra1正向 5′-ACAACCAGATGGTBAACGC-3′Pra2反向 5′-GCCCAGTAYAARTTCTCCA-3′蔗糖合酶基因 Pss1正向 5′-GGTTTGGAGARRGGNTGGGG-3′Pss2反向 5′-TCCAADATGTAVACAACCTG-3′用于檢測(cè)植物物種的捕獲核苷酸序列如下用于特異鑒定六個(gè)植物物種的捕獲探針捕獲探針名稱 序列(5′-3′) 植物識(shí)別的區(qū)域TPss8 AGAGGAGGTGGATAGTCTCCTGTG 玉米蔗糖合酶基因TPss9 AGAGAAGTTGAATTGACTCAAGGA 大豆蔗糖合酶基因TPss7 GAAGCAAGTGGATGGTGTCAAGCA 水稻蔗糖合酶基因OTRco12 TGATGGGAACACGTGCGTTTTCTT 油菜Rubisco活化酶基因PTRtom4 GTACCCTGGCGTTCTCTTGCTTGT 番茄Rubisco活化酶基因PTRbett2 TGATGGGTACACGAGCATTGTCCT 甜菜Rubisco活化酶基因?qū)嵤├?在陣列上檢測(cè)GMO靶標(biāo)序列，包括特異的植物鑒定
0126 使用如實(shí)施例2中描述的3個(gè)PCR和捕獲探針進(jìn)行GMO的檢測(cè)。在以下的實(shí)施例中，加入第四個(gè)PCR，用于分析植物物種-PCR4·植物凝集素(大豆)CATTACCTATGATGCCTCCACC和AAGCACGTCATGCGATTCC·cruciferin(油菜籽)AGAGACGAAGGAAGCGAAGGand TGACCCATCTAATGCTGACG·蔗糖轉(zhuǎn)化酶(玉米)GCGCTCTGTACAAGCGTGC和GCAAAGTGTTGTGCTTGGACC·rDNA(番茄)GTTTCAAAAGTAACACGGCAA和GGCTTGATAAATGAACTCAACT·Rbc1(植物共同的)AGYCTTGATCGTTACAAAGG和AGGTCTAADGGRTAAGCTAC在捕獲探針中存在以下的特異序列對(duì)于大豆凝集素CTGCCACGGGACTCGACATACCT對(duì)于油菜籽cruciferinTTCAGAGTGCTGATGTAACCGAGCT對(duì)于玉米轉(zhuǎn)化酶TTAGACGGGAAAACGAGAGGAAGC對(duì)于番茄rDNACTCGCAATGGGGCTCAGAACGCA對(duì)于普遍的植物ATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGCAACGGGCTCGATGTGGTAGCATCGC
表I不同GMO遺傳圖的理論分析，針對(duì)特異元件存在或者不存在

表II不同GMO遺傳圖的理論分析，針對(duì)特異元件存在或者不存在

表III根據(jù)實(shí)施例3中提供的陣列對(duì)整體型式差異的分析，針對(duì)特異元件存在或者不存在以下GMO

表IV根據(jù)本發(fā)明中提供的陣列對(duì)幾個(gè)GMO的分析。特定捕獲探針的強(qiáng)度平均值(S-B)對(duì)所檢測(cè)的GMO百分比的函數(shù)。

序列表<110>Eppendorf Array Technologies SA<120>在陣列上對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的鑒定和/或定量<130>BP.EATE.007A/EP<160>56<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Tnos引物<400>1ttgaatcctg ttgccggtct t21<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Tnos引物<400>2cgctatattt tgttttctat cgcg 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向P35S引物
<400>3cgtcttcaaa gcaagtggat tg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向P35S引物<400>4tcttgcgaag gatagtggga tt 22<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向nptII引物<400>5ctcgacgttg tcactgaag 19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向nptII引物<400>6gatggatact ttctcggcag 20<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR對(duì)照正向引物<400>7ccacctgctg accccgtc18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR對(duì)照反向引物<400>8gggaccctcg cccagaaac 19<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向CaMV引物<400>9gttgttctat tagttgctct t21<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向CaMV引物<400>10atggctaatc ttaatcagat cc 22
<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Pnos-nptII引物<400>11cctcggtatc caattagagt c21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Pnos-nptII引物<400>12ttgtctgttg tgcccagtca t21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Pat引物<400>13gaggcgcaag gttttaagtc t21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Pat引物
<400>14catcatgcca tccaccatgc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Cry1Ab引物<400>15cmcwcagaac aacaaygtgc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Cry1Ab引物<400>16gwgcwckgat gatgctcacg 20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EPSPS引物1<400>17caagtcgmty tccmaccgg 19<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>EPSPS引物2<400>18ccttgcccgt attgatgacg 20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EPSPS引物3<400>19gtcaaggacc gcattgcga 19<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P35S捕獲核苷酸序列<400>20gtcatccctt acgtcagtgg agatat 26<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Tnos捕獲核苷酸序列<400>21gagatgggtt tttatgatta gagtcc 26
<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nptIIA捕獲核苷酸序列<400>22gggactggct gctattgggc gaa 23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gut(PCR對(duì)照)捕獲核苷酸序列<400>23gggactggct gctattgggc gaa 23<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Pat1捕獲核苷酸序列<400>24ctgtgtatcc caaagcctca tgcaa25<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry1捕獲核苷酸序列
<400>25cagacggtgg ctgaagccct gtcg 24<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry2捕獲核苷酸序列<400>26gagcctgtgg gaaaaaccct gcct 24<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry3捕獲核苷酸序列<400>27caacctgtgg gagaatcctt gcct 24<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>epsps7捕獲核苷酸序列<400>28ctcctactcg ccgccctgtc cga 23<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>epsps8捕獲核苷酸序列<400>29ttcatgttcg gcggtctcgc gag 23<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nptIIh捕獲核苷酸序列<400>30ccgcttgggt ggagaggcta ttc 23<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV捕獲核苷酸序列<400>31cghtttcatg gatttttggt cactg25<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向rubisco活化酶基因引物Pra1<400>32acaaccagat ggtbaacgc 19
<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向rubisco活化酶基因引物Pra2<400>33gcccagtaya arttctcca 19<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向蔗糖合酶基因引物Pss1<220>
<221>misc_特征<222>(15)..(15)<223>n is a，c，g，ort<400>34ggtttggaga rrggntgggg 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向蔗糖合酶基因引物Pss2<400>35tccaadatgt avacaacctg 20<210>36<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米TPss8捕獲核苷酸序列<400>36agaggaggtg gatagtctcc tgtg 24<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大豆TPss9捕獲核苷酸序列<400>37agagaagttg aattgactca agga 24<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>稻TPss7捕獲核苷酸序列<400>38gaagcaagtg gatggtgtca agca 24<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>油菜籽OTRcol2捕獲核苷酸序列<400>39tgatgggaac acgtgcgttt tctt 24
<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄PTRtom4捕獲核苷酸序列<400>40gtaccctggc gttctcttgc ttgt 24<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>甜菜PTRbett2捕獲核苷酸序列<400>41tgatgggtac acgagcattg tcct 24<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向大豆凝集素引物<400>42cattacctat gatgcctcca cc 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向大豆凝集素引物<400>43aagcacgtca tgcgattcc 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向油菜籽cruciferin引物<400>44agagacgaag gaagcgaagg 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向油菜籽cruciferin引物<400>45tgacccatct aatgctgacg 20<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向玉米轉(zhuǎn)化酶引物<400>46gcgctctgta caagcgtgc 19<210>47<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向玉米轉(zhuǎn)化酶引物<400>47gcaaagtgtt gtgcttggac c21<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向番茄rDNA引物<400>48gtttcaaaag taacacggca a21<210>49<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向番茄rDNA引物<400>49ggcttgataa atgaactcaa ct 22<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向植物通用Rbc1引物<400>50agycttgatc gttacaaagg 20
<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向植物通用Rbc1引物<400>51aggtctaadg grtaagctac 20<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大豆凝集素捕獲核苷酸序列<400>52ctgccacggg actcgacata cct 23<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>油菜籽cruciferin捕獲核苷酸序列<400>53ttcagagtgc tgatgtaacc gagct25<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米轉(zhuǎn)化酶捕獲核苷酸序列<400>54ttagacggga aaacgagagg aagc 24<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄rDNA捕獲核苷酸序列<400>55ctcgcaatgg ggctcagaac gca 23<210>56<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通用植物捕獲核苷酸序列<400>56ataagcaata tattgatttt cttctccagc aacgggctcg atgtggtagc atcgc5權(quán)利要求
1.通過鑒定和/或定量不同的多個(gè)核苷酸序列元件鑒定遺傳修飾植物的方法，所述核苷酸序列元件對(duì)應(yīng)于整合到所述遺傳修飾植物基因組中的外源核苷酸序列的至少一部分，其中所述的元件存在于生物樣品中，并且其中該方法包括以下步驟a.可能從生物樣品中提取核苷酸序列元件；b.將核苷酸序列元件或其部分?jǐn)U增或者復(fù)制成靶標(biāo)核苷酸序列，使用能夠擴(kuò)增所述核苷酸序列元件的引物，所述的核苷酸序列元件與在至少兩種不同的遺傳修飾植物中的核苷酸序列元件是同源的，其中所述的核苷酸序列元件選自由以下啟動(dòng)子、終止子和/或標(biāo)記物序列組成的組P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS，其中靶標(biāo)核苷酸序列的長(zhǎng)度包含大約100到大約200個(gè)堿基；c.可能對(duì)獲得的靶標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行標(biāo)記；d.將獲得的靶標(biāo)核苷酸序列與通過共價(jià)連接結(jié)合在固相支持物表面上特定位置的不溶性固體支持物的單鏈捕獲核苷酸序列接觸；e.通過檢測(cè)所述靶標(biāo)核苷酸序列與其位于特定位置的相應(yīng)的捕獲核苷酸序列互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交產(chǎn)生的信號(hào)，檢測(cè)所述靶標(biāo)核苷酸序列的結(jié)合，其中捕獲核苷酸序列被結(jié)合在陣列的特定位置的不溶性固相支持物上，所述陣列的密度是每cm2固相支持表面至少4個(gè)不同的結(jié)合單鏈捕獲核苷酸序列，其中的捕獲核苷酸序列包含具有10到200個(gè)堿基的序列，這允許捕獲核苷酸與待檢測(cè)的和/或定量的靶標(biāo)核苷酸特異雜交；f.對(duì)于第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)或者更多所述遺傳修飾植物特異的不同核苷酸序列元件重復(fù)步驟b)到e)；g.基于這些不同的多個(gè)核苷酸序列元件的存在或者不存在構(gòu)建遺傳圖；以及h.基于所述遺傳圖確定遺傳修飾的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中核苷酸序列元件具有的長(zhǎng)度在大約100到大約800個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選地在大約100和大約200個(gè)核苷酸之間，核苷酸序列元件對(duì)應(yīng)于整合到遺傳修飾植物基因組中的外源核苷酸序列的至少一部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中能夠與其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核苷酸序列雜交的捕獲核苷酸序列通過至少為6.8nm的間隔物與固相支持物表面隔開。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中的捕獲核苷酸序列包含了具有10到49個(gè)堿基的序列，這樣允許與待檢測(cè)和/或定量的靶標(biāo)核苷酸序列的特異雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中整合到植物基因組中的外源核苷酸序列選自由下列各項(xiàng)組成的組抗生素抗性基因，調(diào)控序列，重復(fù)序列和/或編碼特異酶活性的基因。
6.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的遺傳修飾植物選自由下列各品種組成的組BT11，BT176，Ga21，Mon 810，RRS，T25，T45，Topas 19/2，Starlink，NK603，GT73，Liberator L62，F(xiàn)alcon GS 40/90，MS1-RF1，MS1-RF2，MS8-RF3，1445，531，Mon 863，Mon810×MON863，TC1507，Maisgard/RR。
7.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的核苷酸序列元件通過共有引物被擴(kuò)增成靶標(biāo)核苷酸序列。
8.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的核苷酸序列元件是用相同的引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的mRNA序列。
9.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中與不同遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核苷酸序列在相同的捕獲核苷酸序列上檢測(cè)。
10.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中與不同遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核苷酸序列在不同的捕獲核苷酸序列上檢測(cè)。
11.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟b)擴(kuò)增和/或復(fù)制對(duì)不同遺傳修飾植物特異的不同的核苷酸序列元件在同時(shí)進(jìn)行。
12.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)到e)檢測(cè)和/或定量與不同遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核苷酸序列在同時(shí)進(jìn)行。
13.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的鑒定方法，其中的間隔物是包含大約20到大約150個(gè)堿基的核苷酸序列。
14.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在特定位置結(jié)合在固相支持物表面的捕獲核苷酸序列的密度高于每cm2固相支持物表面10fmole，優(yōu)選高于每cm2固相支持物表面100fmole。
15.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的定量方法，其中使用第一加尾的引物和與該尾巴相同或互補(bǔ)的第二引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將核苷酸序列元件擴(kuò)增成靶標(biāo)核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的定量方法，其中在使用第二引物擴(kuò)增之前，首先破壞加尾的引物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的定量方法，其中從第一個(gè)擴(kuò)增步驟開始，第一加尾引物和第二尾巴引物同時(shí)存在，加尾的引物濃度比尾巴引物的濃度至少低5倍。
18.根據(jù)前面權(quán)利要求15到17中任何一項(xiàng)的定量方法，進(jìn)一步包括對(duì)其它核苷酸序列而非核苷酸序列元件的擴(kuò)增，使用與核苷酸序列元件的擴(kuò)增和/或復(fù)制步驟中使用的引物不同的引物對(duì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的定量方法，其中進(jìn)行另一擴(kuò)增步驟的其它核苷酸序列是植物物種、植物屬或者植物科檢測(cè)特異的核苷酸序列。
20.根據(jù)前面權(quán)利要求15到19中任何一項(xiàng)的定量方法，其中對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的定量與植物非轉(zhuǎn)化部分的基因或者序列的定量相比較。
21.根據(jù)前面權(quán)利要求15到20中任何一項(xiàng)的定量方法，其中對(duì)遺傳修飾植物特異的核苷酸序列元件的定量與以已知拷貝數(shù)摻入到檢測(cè)方法中的標(biāo)準(zhǔn)序列的定量相比較。
22.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的不溶性固相支持物選自由下列各項(xiàng)組成的組玻璃、電子裝置、硅支持物、塑料支持物、光盤、濾膜、凝膠層、金屬支持物或者它們的混合物。
23.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的核苷酸序列元件是使用了共有引物以及可能使用了終止序列進(jìn)行3′或5′末端逆轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
24.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的固相支持物攜帶捕獲核苷酸序列，用于與同源的靶標(biāo)核苷酸序列結(jié)合，還攜帶共有序列，用于對(duì)與存在于不同遺傳修飾植物中的相同核苷酸序列元件相對(duì)應(yīng)的所有同源或者相同靶標(biāo)序列進(jìn)行共同檢測(cè)。
25.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的方法還包括對(duì)至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擴(kuò)增，其信號(hào)用于對(duì)樣品中的不同的多個(gè)核苷酸序列元件的量進(jìn)行定量。
26.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的方法還包括對(duì)至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擴(kuò)增，其信號(hào)用于對(duì)樣品中的不同的多個(gè)核苷酸序列元件的量的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
27.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)來(lái)自相同科或者相同種的樣品中的不同的多個(gè)核苷酸序列元件的特異量的定量，通過比較植物特異元件的量與在同一科或者同一種的所有成員中都存在的元件的量進(jìn)行。
28.探測(cè)和/或定量試劑盒，包含實(shí)施根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法的手段和介質(zhì)、單鏈捕獲核苷酸結(jié)合于其上的不溶性固相支持物，所述的單鏈捕獲核苷酸序列含有大約10到大約200個(gè)堿基的序列，對(duì)于下列中的至少四個(gè)是特異的待測(cè)和/或待定量的、總長(zhǎng)度包含大約30-大約600個(gè)堿基的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS核苷酸序列元件，所述的單鏈捕獲核苷酸序列被置于根據(jù)陣列的固相支持物的表面，密度為每cm2固相支持物表面至少4個(gè)單鏈捕獲核苷酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的探測(cè)試劑盒，其中的捕獲核苷酸序列含有對(duì)待測(cè)和/或待定量的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS核苷酸序列元件特異的以下序列GTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT(P35s)；GAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCC(T-nos)；GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA(nptIIA)；CCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTC(nptIIh)；CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAA(pat)；CAGACGGTGGCTGAAGCCCTGTCG(Cry1Ab-1)；GAGCCTGTGGGAAAAACCCTGCCT(Cry1Ab-2)；CAACCTGTGGGAGAATCCTTGCCT(Cry1Ab-3)；CTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGA(EPSPS7)；TTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAG(EPSPS8)，其中的捕獲核苷酸序列Cry1Ab-1對(duì)BT176特異，Cry1Ab-2對(duì)Mon 8110特異以及Cry1Ab-3對(duì)BT11特異，且其中的捕獲核苷酸序列EPSPS7對(duì)GA1特異，EPSPS8對(duì)RRS特異。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的探測(cè)試劑盒，包括以計(jì)算機(jī)程序形式的手段，用于分析在檢測(cè)和/或鑒定不同遺傳元件中以及在鑒定生物體中獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的探測(cè)試劑盒，包括具有可能可以被檢測(cè)出的生物體的遺傳元件組成的數(shù)據(jù)庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及從待分析的樣品中可能存在的具有同源序列的許多其他生物體中，通過確定生物體的遺傳圖，鑒定和/或定量幾種生物體的方法。該方法組合了以下各項(xiàng)使用共同引物對(duì)進(jìn)行有限數(shù)目的靶標(biāo)序列的擴(kuò)增；在陣列上記錄對(duì)捕獲序列和它們的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)序列之間的結(jié)合產(chǎn)生的單一信號(hào)的存在；以及將所述的被檢測(cè)的靶標(biāo)序列的存在與所述(微)生物的一些遺傳特異序列(被稱為遺傳元件)的鑒定聯(lián)系起來(lái)；由此獲得對(duì)生物體的鑒定。根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置使得可以容易地從其他同源序列中鑒定/檢測(cè)出某生物體特異的序列，并且可能對(duì)其定量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1876844SQ200610082430
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月17日
發(fā)明者J·雷馬克, S·哈默爾斯 申請(qǐng)人:埃佩多夫陣列技術(shù)股份有限公司