專利名稱：全層視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將全層視網(wǎng)膜組織從供體取材后、體外分離、制備成移植片的方法。
背景技術(shù)：
自從Royo于1959年首次報(bào)道將視網(wǎng)膜移植到大鼠的前房后，研究者們發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮之間的視網(wǎng)膜下間隙和前房均是相對(duì)免疫赦免區(qū)域，移植物較少受到免疫排斥。于是人們相繼進(jìn)行了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層、全層視網(wǎng)膜(視網(wǎng)膜色素上皮+視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮)以及視網(wǎng)膜芯片、視網(wǎng)膜假體移植到宿主動(dòng)物(受體)的視網(wǎng)膜下間隙的研究。特別是近20年來(lái)，研究者以健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞或組織為供體，通過(guò)視網(wǎng)膜移植來(lái)嘗試延緩宿主視網(wǎng)膜細(xì)胞的變性和替換壞死及凋亡的細(xì)胞，移植后的研究結(jié)果顯示(1)宿主動(dòng)物的視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)，供體細(xì)胞和組織能存活、分化、發(fā)育；(2)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)供體給宿主組織器官帶來(lái)明顯的危害或排斥反應(yīng)；宿主視功能有一定的恢復(fù)；(3)無(wú)論是將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞還是視網(wǎng)膜色素上皮組織片的單獨(dú)移植，均不能在術(shù)后形成良好的視網(wǎng)膜色素上皮層狀結(jié)構(gòu)。同樣，單獨(dú)的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮移植，也依賴于宿主視網(wǎng)膜健康的視網(wǎng)膜色素上皮支持。于是采用干細(xì)胞或全層視網(wǎng)膜作為供體成為目前研究的趨勢(shì)，但是干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化還有待于進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究，因此全層視網(wǎng)膜供體目前具有較大的應(yīng)用潛力。2000年美國(guó)專利說(shuō)明書(shū)US-6045791公開(kāi)了一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植的方法，采用的是將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)在膠原層上，通過(guò)移植管吸入視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，但這樣就只有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，缺少視網(wǎng)膜的另外9層細(xì)胞。
然而，將全層視網(wǎng)膜(色素上皮+神經(jīng)上皮)移植到宿主視網(wǎng)膜下腔面臨的困難是在體外要分離得到結(jié)構(gòu)層次完好的全層視網(wǎng)膜很困難。眼球后部的組織結(jié)構(gòu)中，從外到內(nèi)依次為鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和玻璃體，其中視網(wǎng)膜是光線的接受和轉(zhuǎn)化部位，視網(wǎng)膜包括視網(wǎng)膜色素上皮層和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層又分為9層視錐視桿層、外界膜、外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)界膜。所以全層視網(wǎng)膜組織片共有10層精細(xì)結(jié)構(gòu)，而這10層的總厚度僅為200-300微米，并且視網(wǎng)膜色素上皮層和其毗鄰的脈絡(luò)膜通過(guò)緊密連接粘連緊密。所以在分離過(guò)程中很容易發(fā)生組織片的卷曲、皺褶以及結(jié)構(gòu)紊亂；同時(shí)視網(wǎng)膜對(duì)缺血缺氧及理化環(huán)境變化非常敏感，分離過(guò)程中微環(huán)境的變化、機(jī)械損傷、時(shí)間的延長(zhǎng)，都可能對(duì)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能帶來(lái)不可逆的創(chuàng)傷。研究者們嘗試過(guò)兩種方法來(lái)分離視網(wǎng)膜粘連的脈絡(luò)膜機(jī)械分離和Dispase酶消化法。單純機(jī)械分離視網(wǎng)膜和其毗鄰的脈絡(luò)膜很容易使視網(wǎng)膜發(fā)生卷曲、反折以及視網(wǎng)膜內(nèi)部色素上皮和神經(jīng)上皮的分離等；而Dispase酶又可能對(duì)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞產(chǎn)生毒性。故目前尚無(wú)一種有效的分離方法。
準(zhǔn)分子激光是一種新型冷激光，通過(guò)分子斷鍵作用進(jìn)行微米數(shù)量級(jí)的精確切削，在切削過(guò)程中沒(méi)有熱創(chuàng)傷、精度高、速度快、易于控制。而采用精確的準(zhǔn)分子激光切削脈絡(luò)膜，得到結(jié)構(gòu)層次完好的全層視網(wǎng)膜組織片，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一套使用方便、精確的全視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方法，它能得到結(jié)構(gòu)層次完好的全層視網(wǎng)膜片。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的采用的方案是即一種全層視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方法，方法包括以下步驟1、明膠片的制備將明膠粉中加入無(wú)菌生理鹽水，加熱煮沸溶化后，在圓柱狀模型中冷卻，然后用振動(dòng)切片機(jī)切削成明膠薄片，4℃度環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?br> 2、全層視網(wǎng)膜片的保存將供體的附有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜，平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上，在4小時(shí)以內(nèi)浸入保存液中備用。
所述保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、凍存劑、以及1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑，其相應(yīng)的保存方法為Ames’液在4℃環(huán)境中保存4小時(shí)；中期保存液在4℃環(huán)境中保存1天；凍存劑在負(fù)80度冰箱中保存1周；1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑處理后在深低溫程序降溫儀中保存1月。
3、全層視網(wǎng)膜片的激光微切削除層處理采用準(zhǔn)分子激光機(jī)，利用光學(xué)角膜磨鑲模式發(fā)射激光，將全層視網(wǎng)膜片附著的脈絡(luò)膜通過(guò)微切削除去，然后用明膠雙面包埋，浸入保存液中備用。
本發(fā)明方法產(chǎn)生的積極效果能夠精確、微創(chuàng)、迅速、方便地將全層視網(wǎng)膜組織與其緊密附著的脈絡(luò)膜分離開(kāi)，并且在分離制備過(guò)程中保持全層視網(wǎng)膜完整的層次結(jié)構(gòu)和良好的組織活性。


圖1為附著有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜片平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上。
圖2為準(zhǔn)分子激光正在利用光學(xué)角膜磨鑲模式模式發(fā)射激光，微切削脈絡(luò)膜。
圖3為微切削后可通過(guò)RPE透見(jiàn)其下視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，略顯白色。
圖4為微切削后脈絡(luò)膜完全消失，RPE(黑箭)尚存。(注RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮間的空隙是由于固定過(guò)程中面交明膠收縮所致)。RPE(視網(wǎng)膜色素上皮層，黑箭)，GEL(明膠)，ONL(視網(wǎng)膜外核層)，INL(視網(wǎng)膜內(nèi)核層)蘇木精伊紅染色×400倍。
圖5為廣西巴馬小型豬光損傷環(huán)境白色熒光燈(波長(zhǎng)400-700nm，照射強(qiáng)度25001ux，照射時(shí)間12h/d)持續(xù)照射3月齡豬達(dá)6個(gè)月以上。
圖6-A為5#豬右眼移植術(shù)后1月眼底彩照，移植區(qū)視網(wǎng)膜平復(fù)。
圖6-B為5#豬右眼移植術(shù)后1月眼底熒光造影，移植區(qū)內(nèi)無(wú)明顯熒光滲漏(白箭)。
圖7-A為9#豬左眼移植術(shù)后8月眼底彩照，可見(jiàn)移植區(qū)(白箭)和硅油界面(黑箭)。
圖7-B為9#豬左眼移植術(shù)后8月眼底熒光造影，移植區(qū)內(nèi)無(wú)熒光滲漏(白箭)。
圖8為視網(wǎng)膜移植完成后，因麻藥過(guò)量搶救無(wú)效死亡的豬視網(wǎng)膜組織切片，視網(wǎng)膜移植片在宿主豬視網(wǎng)膜下腔平行伸展，極性相同。其中A石蠟×100；B蘇木精染色×100，宿主視網(wǎng)膜斷裂系染色中明膠牽拉、皺褶所致，C蘇木精染色×400注T(移植物)，H(宿主視網(wǎng)膜)，Gel(明膠)。
圖9為11#豬左眼移植術(shù)后1月視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展，層次消失，細(xì)胞核密集、異染色質(zhì)富集(蘇木精伊紅染色×400)，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部與宿主視網(wǎng)膜有絲狀連接(黑箭)。
圖10-A為10#豬右眼移植術(shù)后3月視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體平鋪伸展，局部與宿主視網(wǎng)膜有融合(黑箭)，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；蘇木精伊紅染色×100。
圖10-B為10#豬右眼移植術(shù)后3月視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體局部與宿主視網(wǎng)膜有融合(黑箭)。蘇木精伊紅染色×400。
圖11-A為5#豬右眼移植術(shù)后5月，視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體平鋪伸展，表面有纖維膠質(zhì)樣層狀結(jié)構(gòu)增生(黑箭頭)，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；蘇木精伊紅染色×100。
圖11-B為5#豬右眼移植術(shù)后5月，視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體表面有纖維膠質(zhì)樣層狀結(jié)構(gòu)增生(黑箭頭)；蘇木精伊紅染色×400。
圖11-C為5#豬右眼移植術(shù)后5月，視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體，局部可見(jiàn)與宿主視網(wǎng)膜融合(黑箭)。神經(jīng)纖維層(hNFL)、內(nèi)核層(hINL)、移植物(T)。GFAP-FITC標(biāo)記×400。蘇木精伊紅染色×400。
圖12為5#豬右眼移植術(shù)后5月，宿主視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層(hNFL)及內(nèi)核層(hINL)可見(jiàn)GFAP陽(yáng)性染色，提示müller細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)；移植物(T)中也同時(shí)發(fā)現(xiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，并且在融合部位相對(duì)較多(白箭)。
圖13為9#豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后9月，視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展(黑箭)，局部可見(jiàn)與宿主視網(wǎng)膜有纖維連接(黑箭頭)，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。蘇木精伊紅染色×400。
圖14為2000年美國(guó)專利說(shuō)明書(shū)US-6045791公開(kāi)的，將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植到鼠視網(wǎng)膜下腔后14天的結(jié)果，可見(jiàn)(1)移植物中只有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，缺少視網(wǎng)膜的另外9層細(xì)胞，(2)移植物和宿主之間沒(méi)有看到有組織結(jié)構(gòu)的連接，(3)移植物和宿主均結(jié)構(gòu)層次紊亂。圖中的RPE(視網(wǎng)膜色素上皮層)，IS(內(nèi)節(jié))，OS(外節(jié))，ONL(視網(wǎng)膜外核層)，OPL(外叢狀層)，INL(視網(wǎng)膜內(nèi)核層)。
圖15為圖14的局部放大。圖中的RPE(視網(wǎng)膜色素上皮層)，IS(內(nèi)節(jié))，OS(外節(jié))，ONL(視網(wǎng)膜外核層)，OPL(外叢狀層)，INL(視網(wǎng)膜內(nèi)核層)。
圖16為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)前mfERG三維、波描記陣列，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1-2環(huán))波形振幅都較低平(圈)。左三維圖，右波描記陣列。
圖17為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后1月mfERG三維、波描記陣列，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1環(huán))的波形規(guī)則、振幅明顯升高(圈)。左三維圖，右波描記陣列。
圖18為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后2月mfERG三維、波描記陣列，各環(huán)與術(shù)前相比，改變不明顯。左三維圖，右波描記陣列。
圖19為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后3月mfERG三維、波描記陣列，各環(huán)與術(shù)前相比，改變不明顯。左三維圖，右波描記陣列。左三維圖，右波描記陣列。
圖20為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后5月mfERG三維、波描記陣列，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1-2環(huán))的波形振幅明顯升高(圈)。左三維圖，右波描記陣列。
圖21為9#光變性豬左眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后8月mfERG三維、波描記陣列，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1-2環(huán))的波形振幅明顯升高(圈)。左三維圖，右波描記陣列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的上述方法可以通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下的實(shí)施例。
實(shí)施例1明膠片的制備稱取2.5克明膠粉，放入已消毒的小空瓶中，加入5毫升無(wú)菌生理鹽水，配成50％的濃度。將瓶蓋上插一針頭后，放入水浴鍋中加熱煮沸。待明膠顆粒完全溶化后，稍冷卻倒入直徑7毫米的圓柱狀模型中，完全冷卻后將明膠脫模，用振動(dòng)切片機(jī)切削成圓形150微米厚的明膠片，浸入4攝氏度生理鹽水中備用。
實(shí)施例2全層視網(wǎng)膜片的保存取出供體的附有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜，迅速平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上，在4小時(shí)以內(nèi)浸入保存液中，保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、凍存劑、以及1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑。(1)Ames’液的成分為NaCl 120(mM/L)，KCl3.6(mM/L)，MgSO41.2(mM/L)，CaCl21.2(mM/L)，NaHCO323(mM/L)，NaH2PO4 0.1(mM/L)，Na2HPO4 0.4(mM/L)，Glucose10(mM/L)。(2)中期保存液的成分為以細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM作為基礎(chǔ)液，加入0.05mmol/L地塞米松(上海新華制藥廠)、2.5％硫酸軟骨素(美國(guó)Sigma公司)、1％葡聚糖(分子量4×104，上?；瘜W(xué)試劑廠)、105U/L妥布霉素、0.03％L-谷氨酰胺，用HEPES(美國(guó)Sigma公司)緩沖液調(diào)節(jié)，pH為7.2-7.4，滲透壓濃度為350-410mmol/L。(3)凍存劑的成分為40％DMEM、20％DMSO、40％FCS。(4)1號(hào)抗凍劑成分為20％人血清白蛋白，5％二甲基亞砜，75％DMEM；2號(hào)抗凍劑成分為20％人血清白蛋白，7.5％二甲基亞砜，72.5％DMEM。
保存方法為Ames’液中的組織片置入4度冰箱中保存不超過(guò)4小時(shí)。中期保存液中的組織片置入4度冰箱中保存不超過(guò)1天。凍存劑中的組織片置于負(fù)80度冰箱中保存不超過(guò)1周。1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑的處理方法為將視網(wǎng)膜組織片移入裝有1號(hào)抗凍劑的保存瓶中，置4℃冰箱20分鐘；再移入裝有2號(hào)抗凍劑的保存瓶中，置4℃冰箱20分鐘。然后將裝有組織片的2號(hào)保存瓶置于程序降溫儀中進(jìn)行程序降溫起始溫度為4℃，以-1.5℃/分鐘從4℃降至-30℃、以-9℃/分鐘降至-80℃。最后將2號(hào)保存瓶放入-196℃液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期保存不超過(guò)1月。
使用時(shí)，Ames’液或中期保存液中的組織片取出后置于葡萄糖生理鹽水溶液中漂洗即可備用。凍存劑中的組織片需進(jìn)行復(fù)溫將凍存管放入37℃水浴復(fù)溫約1分鐘，待組織片表面僅殘留一層薄冰時(shí)取出，吸盡凍存劑，加細(xì)胞培養(yǎng)基漂洗3次后即可備用。1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑中的組織片也需進(jìn)行復(fù)溫將凍存管從液氮罐中取出，放入37℃水浴復(fù)溫約1分鐘，待組織片表面僅殘留一層薄冰時(shí)取出，吸盡凍存液，加細(xì)胞培養(yǎng)基漂洗3次后備用。
實(shí)施例3全層視網(wǎng)膜片的激光微切削除層處理將附著有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜片平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上(圖1)。吸凈脈絡(luò)膜表面的殘余液體，采用美國(guó)鷹視酷眼系統(tǒng)的193nm的準(zhǔn)分子激光機(jī)，其脈沖頻率400Hz、跟蹤頻率400Hz、激光光斑0.95毫米、脈沖能量1.6mJ、延遲時(shí)間4-8ms，采用小光斑飛點(diǎn)掃描，將瞄準(zhǔn)光聚焦于脈絡(luò)膜前表面正中央，利用光學(xué)角膜磨鑲模式模式發(fā)射激光(圖2)，至肉眼下切削區(qū)域可透見(jiàn)映襯其下的白色為止(圖3)。光學(xué)角膜磨鑲模式模式切削深度50～85微米。將激光微切削脈絡(luò)膜后的組織行明膠雙面包埋，37度水浴融化2分鐘制成全層視網(wǎng)膜組織片，浸入保存液中備用。保存液可采用市售的Ames’液。
實(shí)施例4全層視網(wǎng)膜片激光微切削除層處理后的顯微結(jié)構(gòu)觀察為觀察激光微切削除層處理后的組織片的顯微結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證激光切削的深度，將激光微切削后的組織片連同明膠片一起浸泡于4％多聚甲醛中固定2-3天，石蠟包埋，切片5微米厚，常規(guī)行蘇木精伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)脈絡(luò)膜已經(jīng)完全去除，得到明膠雙面包埋的完整結(jié)構(gòu)的全層視網(wǎng)膜片(圖4)。
實(shí)施例5全層視網(wǎng)膜片的在動(dòng)物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能觀察為驗(yàn)證準(zhǔn)分子激光切削后的組織片的活性，我們用白色熒光燈(波長(zhǎng)400-700nm，照射強(qiáng)度25001ux，照射時(shí)間12h/d)持續(xù)照射3月齡廣西巴馬小型豬達(dá)6個(gè)月以上，慢性誘導(dǎo)小型豬視網(wǎng)膜變性(圖5)。然后將明膠包埋的全層視網(wǎng)膜組織片置入4度冰箱冷卻5分鐘后，再將組織片切成2×4毫米大小的矩形條，浸入Ames’液，在超凈臺(tái)的紫外燈下消毒30分鐘，經(jīng)自制的視網(wǎng)膜植入器對(duì)小型豬的11只眼球行視網(wǎng)膜移植，通過(guò)玻璃體切割+視網(wǎng)膜切開(kāi)植入全層視網(wǎng)膜移植片，術(shù)后1-8月行活體眼底照相、眼底熒光造影、組織學(xué)切片觀察結(jié)構(gòu)，行多焦視網(wǎng)膜電圖檢查視功能。
在長(zhǎng)達(dá)8月的隨訪中，活體眼底照相和眼底熒光造影并未觀察到有移植物被包裹、溶解，宿主黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥等排斥反應(yīng)的跡象(圖6，7)。組織學(xué)切片證實(shí)移植成功8眼，移植成功率72.73％，宿主均未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。有1只豬視網(wǎng)膜移植完成后，因麻藥過(guò)量搶救無(wú)效死亡，立即取眼球固定，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)供體視網(wǎng)膜色素上皮-視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層全層移植片被明膠包夾，在宿主豬視網(wǎng)膜下腔平行伸展，結(jié)構(gòu)完整，與宿主視網(wǎng)膜極性相同(圖8)。
術(shù)后1月取豬眼球行冰凍切片，組織學(xué)HE染色，豬視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展，層次消失，細(xì)胞核密集、異染色質(zhì)富集，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部與宿主視網(wǎng)膜有絲狀連接(圖9)。
術(shù)后3月豬視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展，層次不清，細(xì)胞核較密集，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部與宿主視網(wǎng)膜有融合(圖10)。
術(shù)后5月，豬視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展，層次不清，表面有纖維膠質(zhì)樣層狀結(jié)構(gòu)增生，局部可見(jiàn)與宿主視網(wǎng)膜融合，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖11)。
在上述術(shù)后5月的宿主視網(wǎng)膜下腔中，在宿主視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層及內(nèi)核層可見(jiàn)GFAP陽(yáng)性染色，提示müller細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)；移植物中也同時(shí)發(fā)現(xiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，并且在融合部位相對(duì)較多(圖12)。
術(shù)后9月，豬視網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)供體視網(wǎng)膜平鋪伸展，層次不清，表面有纖維膠質(zhì)樣層狀結(jié)構(gòu)增生，局部可見(jiàn)與宿主視網(wǎng)膜有纖維連接，未見(jiàn)壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖13)。
與2000年美國(guó)專利說(shuō)明書(shū)US-6045791公開(kāi)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植后14天的結(jié)果(圖14-15)相比，可見(jiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植后(1)移植物中只有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，缺少視網(wǎng)膜的另外9層細(xì)胞，(2)移植物和宿主之間沒(méi)有看到有組織結(jié)構(gòu)的連接，(3)移植物和宿主均結(jié)構(gòu)層次紊亂。
多焦視網(wǎng)膜電圖是無(wú)創(chuàng)、定量和直觀評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能的方法。在術(shù)前(圖18)及視網(wǎng)膜移植術(shù)后1月(圖19)、2月(圖20)、3月(圖21)、5月(圖22)、8月(圖23)隨訪檢查9#光變性豬的多焦視網(wǎng)膜電圖的三維密度、波描記陣列。從圖中可以看出光照6個(gè)月后，9#變性豬的多焦視網(wǎng)膜電圖波描記陣列中，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1-2環(huán))每個(gè)刺激單元的波形振幅都較低平，證明白色熒光燈持續(xù)照射3月齡豬達(dá)6個(gè)月以上，可慢性誘導(dǎo)小型豬視網(wǎng)膜變性。術(shù)后1月時(shí)，雖然波形有些不規(guī)則，但后極部中央?yún)^(qū)特別是1環(huán)的波形規(guī)則、振幅明顯升高；術(shù)后2-3月時(shí)，各環(huán)與術(shù)前改變不明顯；而術(shù)后5、8月時(shí)，后極部中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜(1-2環(huán))的波形振幅明顯升高。
取7只光變性豬眼，按視網(wǎng)膜移植術(shù)后存活月份分組行多焦視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)，和其自身術(shù)前(n＝7)及正常豬眼(5眼)進(jìn)行比較。取多焦視網(wǎng)膜電圖主波P1波作為觀察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)光變性豬眼移植術(shù)后視網(wǎng)膜功能的變化趨勢(shì)是1環(huán)在術(shù)后1月時(shí)P1波振幅密度非常顯著升高、而后下降、3、5、8月時(shí)又高于術(shù)前，但均低于正常豬眼；2環(huán)在術(shù)后5、8月P1波振幅顯著升高；1、2環(huán)P1波潛伏期均無(wú)顯著變化；4、6環(huán)P1波潛伏期在術(shù)后2、3、5月顯著延長(zhǎng)。由此提示光變性豬眼視網(wǎng)膜移植術(shù)后早期(術(shù)后1月)中央1環(huán)視網(wǎng)膜功能非常顯著升高，后期(術(shù)后5、8月)1、2環(huán)視網(wǎng)膜功能有改善，3-6環(huán)視網(wǎng)膜功能無(wú)明顯改善。
以上結(jié)果還受到移植過(guò)程中移植器械、理化環(huán)境等諸多因素的影響，但是72.73％的移植成功率和術(shù)后視功能的提高已經(jīng)能夠充分說(shuō)明這種將全層視網(wǎng)膜組織從供體取材、分離、制備成移植片的方法，是安全有效的、能夠保持全層視網(wǎng)膜片的層次結(jié)構(gòu)和功能活性，并且使用方便、操作精確。
當(dāng)然，本分離制備方法不局限于制備全層視網(wǎng)膜片，也可使用準(zhǔn)分子激光微量、精確切削視網(wǎng)膜的各層，得到相應(yīng)的組織片，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
此外，本發(fā)明不僅適用于視網(wǎng)膜組織片，對(duì)于其他類似的組織片，只要采取了上述準(zhǔn)分子激光切削方法和明膠包埋方法，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種全層視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方法，其特征是方法包括以下步驟1)、明膠片的制備將明膠粉中加入無(wú)菌生理鹽水，加熱煮沸溶化后，在圓柱狀模型中冷卻，然后用振動(dòng)切片機(jī)切削成明膠薄片，4℃度環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?)、全層視網(wǎng)膜片的保存將供體的附有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜，平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上，在4小時(shí)以內(nèi)浸入保存液中備用；3)、全層視網(wǎng)膜片的激光微切削除層處理采用準(zhǔn)分子激光機(jī)，利用光學(xué)角膜磨鑲模式發(fā)射激光，將全層視網(wǎng)膜片附著的脈絡(luò)膜通過(guò)微切削除去，然后用明膠雙面包埋，浸入保存液中備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全層視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方其特征是所述保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、凍存劑、以及1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑，其相應(yīng)的保存方法為Ames’液在4℃環(huán)境中保存4小時(shí)；中期保存液在4℃環(huán)境中保存1天；凍存劑在負(fù)80度冰箱中保存1周；1號(hào)抗凍劑和2號(hào)抗凍劑處理后在深低溫程序降溫儀中保存1月。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種全層視網(wǎng)膜組織片的體外分離制備方法，方法包括1.明膠片的制備，將明膠粉中加入無(wú)菌生理鹽水，加熱煮沸溶化后，在圓柱狀模型中冷卻，然后用振動(dòng)切片機(jī)切削成明膠薄片，保存?zhèn)溆茫?.全層視網(wǎng)膜片的保存將供體的附有脈絡(luò)膜的全層視網(wǎng)膜，平鋪于明膠片表面，脈絡(luò)膜面向上，在保存液中備用；3.全層視網(wǎng)膜片的激光微切削除層處理采用準(zhǔn)分子激光機(jī)，利用光學(xué)角膜磨鑲模式發(fā)射激光，將全層視網(wǎng)膜片附著的脈絡(luò)膜通過(guò)微切削除去，然后用明膠雙面包埋，浸入保存液中備用。本發(fā)明能精確、微創(chuàng)、迅速、方便地將全層視網(wǎng)膜組織與其緊密附著的脈絡(luò)膜分離開(kāi)，并且在分離制備過(guò)程中保持全層視網(wǎng)膜完整的層次結(jié)構(gòu)和良好的組織活性。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1961846SQ20061009527
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者陰正勤, 陳少軍, 李世迎, 余濤, 劉勇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院