專利名稱：從煙草克隆細(xì)胞色素p450基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在煙草(Nicotiana)植物中編碼細(xì)胞色素P450酶(下文稱為P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列來改變植物表型的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450催化各種化學(xué)上不同的底物的酶反應(yīng)，包括內(nèi)源性和異源底物的氧化、過氧化和還原性代謝。在植物中，p450參與包括植物產(chǎn)物合成在內(nèi)的生化途徑，所述產(chǎn)物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物堿、萜類、脂質(zhì)、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)和葡糖異硫氰酸鹽(glucosinolates)(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198，49311-343)。細(xì)胞色素p450也稱為血紅素-硫醇鹽蛋白(heme-thiolateprotein)，通常用作多組分電子轉(zhuǎn)移鏈(稱為含p450的單加氧酶系統(tǒng))中的末端氧化酶。所催化的特定反應(yīng)包括脫甲基化、羥基化、環(huán)氧化、N-氧化、磺基氧化(sulfooxidation)、N-、S-和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。
煙草植物p450酶的各種作用涉及產(chǎn)生各種植物代謝物，例如苯丙素、生物堿、萜類、脂質(zhì)、生氰糖苷、葡糖異硫氰酸鹽和其它化學(xué)物質(zhì)的宿主。近年來，人們開始了解一些p450酶影響植物中植物代謝物的組成。例如，長期以來人們希望通過育種改變植物的所選脂肪酸的特性來改善特定植物的風(fēng)味和香味；然而涉及控制這些葉子組成的水平的機理知之甚少。下調(diào)與改變脂肪酸有關(guān)的p450酶可有助于積累提供更適宜的葉子表型質(zhì)量的所需脂肪酸。p450酶的功能及其在植物組成中廣泛的作用仍有待發(fā)現(xiàn)。例如，特定類型的p450酶發(fā)現(xiàn)可催化脂肪酸分解為揮發(fā)性C6-和C9-醛和醇，而主要是這些物質(zhì)導(dǎo)致水果和蔬菜具有“新鮮翠綠”的氣味?？筛淖兤渌鳛樾履繕?biāo)的p450酶的水平，通過改變煙草葉子中的脂質(zhì)組成和相關(guān)的降解代謝物來提高葉子組成的質(zhì)量。葉子中的幾種這些成分受老化的影響，而老化刺激葉子質(zhì)量特性的成熟。其它人也報道p450酶在改變涉及植物病原體相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。
在其它例子中，已提示p450酶涉及生物堿的生物合成。降煙堿是在煙草(Nicotiana tabaceum)中發(fā)現(xiàn)的少量生物堿。推測它是這樣產(chǎn)生的p450介導(dǎo)的尼古丁脫甲基化，然后在N位?；蛠喯趸瑥亩a(chǎn)生一系列N-?；禑焿A(N-acylnonicotine)和N-亞硝基降煙堿。推測的p450脫甲基酶催化的N-脫甲基化被認(rèn)為是煙草中降煙堿生物合成的主要來源。盡管認(rèn)為該酶是微粒體酶，但是迄今為止未能成功地純化尼古丁脫甲基化酶，也未能分離到有關(guān)基因。
此外，有假說認(rèn)為(但未證實)p450酶的活性受遺傳控制并且也強烈地受環(huán)境因素的影響。例如，當(dāng)植物達(dá)到成熟階段后，認(rèn)為煙草中尼古丁的脫甲基化作用大大增加。另外，有假說認(rèn)為(還未證實)脫甲基化基因含有當(dāng)存在時能抑制RNA翻譯的轉(zhuǎn)座元件。
在本發(fā)明之前，p450酶形式的多樣性、其結(jié)構(gòu)和功能的不同使得對煙草p450酶的研究十分困難。此外，對p450酶的克隆至少部分由于這些膜定位的蛋白通常存在量低且經(jīng)常在純化中不穩(wěn)定而受阻。因此，需要在植物中鑒定p450酶和與那些p450酶相關(guān)的核酸序列。特別是，在煙草中僅有少許細(xì)胞色素p450蛋白已見報道。本文所述的發(fā)明發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞色素p450片段，這些片段基于它們的序列同一性而對應(yīng)于幾組p450種類。
概述本發(fā)明針對植物p450酶。本發(fā)明還涉及來自煙草的植物p450酶。本發(fā)明也涉及其表達(dá)由乙烯和/和植物老化誘導(dǎo)的植物中的p450酶。本發(fā)明還涉及植物中具有酶活性的核酸序列，例如可分類為氧化酶、脫甲基酶等和其它酶，以及使用那些序列來使這些酶的表達(dá)降低和沉默和過度表達(dá)。本發(fā)明也涉及在含有較高降煙堿水平的植物而非顯示較低降煙堿水平的植物中發(fā)現(xiàn)的p450酶。
本發(fā)明一方面涉及以下所示的核酸序列SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313和315。
在第2個相關(guān)的方面，根據(jù)它們在細(xì)胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應(yīng)區(qū)域的同一性，對那些含有大于75％的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的核酸組和各自的種類示于表I。
在第3方面，本發(fā)明涉及如以下所示的氨基酸序列SEQ.ID.NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314和316。
在第4個相關(guān)的方面，根據(jù)它們在細(xì)胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應(yīng)區(qū)域的同一性，對那些含有大于71％的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表II。
在第5個方面，本發(fā)明涉及如以下所示全長基因的氨基酸序列SEQ.ID.NO.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314和316。
在第6個相關(guān)的方面，根據(jù)彼此的同一性對那些含有大于85％和更高的氨基酸序列同一性的全長基因進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表III。
在第7個方面，本發(fā)明涉及如SEQ.ID.NO.299-357所示片段的氨基酸序列。
在第8個相關(guān)的方面，根據(jù)它們在第一細(xì)胞色素p450結(jié)構(gòu)域UXXRXXZ到第3細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域GXRXO的對應(yīng)區(qū)域的互相同一性，對那些含有大于90％和更高的氨基酸序列同一性的片段進行分組，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表IV。
在第9個相關(guān)的方面，p450酶在煙草植物中的減少或消除或過度表達(dá)可使用RNA病毒系統(tǒng)瞬時實現(xiàn)。
評價得到的轉(zhuǎn)化或感染的植物的表型改變，包括(但不限于)使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)可用的技術(shù)來分析內(nèi)源性p450RNA轉(zhuǎn)錄物、p450表達(dá)肽和植物代謝物的濃度。
在第10個方面，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生具有改變的p450酶活性水平的轉(zhuǎn)基因煙草譜系。根據(jù)本發(fā)明，這些轉(zhuǎn)基因譜系含有有效地特定酶表達(dá)減少、沉默或增加，從而在煙草中導(dǎo)致表型效應(yīng)的核酸序列。這種核酸序列包括SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313和315。
在本發(fā)明非常重要的第11方面，與對照植物相比，含有本發(fā)明核酸的植物栽培品系在使用全長基因或其片段的下調(diào)能力或使用全長基因或其片段的過度表達(dá)能力上具有改變的代謝物特性。
在本發(fā)明的第12方面，含有本發(fā)明核酸的植物栽培品系具有對特定外源性化學(xué)物質(zhì)或植物害蟲耐受的用途，所述植物使用全長基因或其片段以更改來源于植物或植物以外的代謝物的生物合成或降解。這種核酸序列包括SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313和315。
在第13個方面，本發(fā)明涉及篩選含有與所述核酸序列具有實質(zhì)性核酸同一性的基因的植物，優(yōu)選煙草。使用本發(fā)明有利于鑒定和選擇含有精確的或?qū)嵸|(zhì)性同一性的核酸序列的植物，其中這種植物是傳統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因品種的育種程序、誘變程序或天然存在的不同植物種群的一部分?？墒褂煤怂崽结樈Y(jié)合核酸檢測方法，包括(但不限于)核酸雜交和PCR分析，通過評價植物的核酸物質(zhì)來篩選實質(zhì)性核酸同一性的植物。核酸探針可由對應(yīng)于以下SEQ ID的所述核酸序列或其片段構(gòu)成SEQ ID 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313和315。
在第14個方面，本發(fā)明涉及鑒定與所述核酸序列具有實質(zhì)性氨基酸同一性的植物基因，優(yōu)選煙草?？墒褂煤怂崽结樈Y(jié)合核酸檢測方法，包括(但不限于)核酸雜交和PCR分析，通過篩選植物cDNA文庫來鑒定植物基因，包括cDNA和基因組克隆，優(yōu)選煙草的cDNA和基因組克隆。核酸探針可由對應(yīng)于以下SEQ ID的核酸序列或其片段構(gòu)成1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145和147。
在其它第15個方面，可使用針對部分或全部所述氨基酸序列的抗體來篩選表達(dá)肽的cDNA表達(dá)文庫。這種氨基酸序列包括SEQ ID 2、4、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148。
在第16個重要的方面，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生過度表達(dá)p450酶活性水平的轉(zhuǎn)基因煙草譜系。根據(jù)本發(fā)明，這些轉(zhuǎn)基因譜系包括編碼全長基因的氨基酸序列的所有核酸序列，所述基因有效地增加特定酶的表達(dá)從而導(dǎo)致煙草中的表型效應(yīng)。這種氨基酸序列包括SEQ.ID.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314和316。
也提供了含有降煙堿含量降低的煙葉(葉片和/或莖)的煙草產(chǎn)品。該煙草產(chǎn)品包括煙草(含有葉片和/或莖的煙葉)，該煙草來自含有本文所述序列或消除或抑制了編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的植物。與用未消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的煙草植物制備的煙草產(chǎn)品相比，消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因有效地降低了煙草產(chǎn)品中約5-10％、或者約10-20％、或者約20-30％、或者30％以上的煙草特異性亞硝基胺。本文使用的煙草產(chǎn)品可包括香煙、雪茄、煙絲、鼻煙、口嚼煙(chewing tobacco)、混合了煙草產(chǎn)品的產(chǎn)品和它們的混合物。
附圖簡述

圖1顯示核酸SEQ.ID.No.1和氨基酸SEQ.ID.No.2。
圖2顯示核酸SEQ.ID.No.3和氨基酸SEQ.ID.No.4。
圖3顯示核酸SEQ.ID.No.5和氨基酸SEQ.ID.No.6。
圖4顯示核酸SEQ.ID.No.7和氨基酸SEQ.ID.No.8。
圖5顯示核酸SEQ.ID.No.9和氨基酸SEQ.ID.No.10。
圖6顯示核酸SEQ.ID.No.11和氨基酸SEQ.ID.No.12。
圖7顯示核酸SEQ.ID.No.13和氨基酸SEQ.ID.No.14。
圖8顯示核酸SEQ.ID.No.15和氨基酸SEQ.ID.No.16。
圖9顯示核酸SEQ.ID.No.17和氨基酸SEQ.ID.No.18。
圖10顯示核酸SEQ.ID.No.19和氨基酸SEQ.ID.No.20。
圖11顯示核酸SEQ.ID.No.21和氨基酸SEQ.ID.No.22。
圖12顯示核酸SEQ.ID.No.23和氨基酸SEQ.ID.No.24。
圖13顯示核酸SEQ.ID.No.25和氨基酸SEQ.ID.No.26。
圖14顯示核酸SEQ.ID.No.27和氨基酸SEQ.ID.No.28。
圖15顯示核酸SEQ.ID.No.29和氨基酸SEQ.ID.No.30。
圖16顯示核酸SEQ.ID.No.31和氨基酸SEQ.ID.No.32。
圖17顯示核酸SEQ.ID.No.33和氨基酸SEQ.ID.No.34。
圖18顯示核酸SEQ.ID.No.35和氨基酸SEQ.ID.No.36。
圖19顯示核酸SEQ.ID.No.37和氨基酸SEQ.ID.No.38。
圖20顯示核酸SEQ.ID.No.39和氨基酸SEQ.ID.No.40。
圖21顯示核酸SEQ.ID.No.41和氨基酸SEQ.ID.No.42。
圖22顯示核酸SEQ.ID.No.43和氨基酸SEQ.ID.No.44。
圖23顯示核酸SEQ.ID.No.45和氨基酸SEQ.ID.No.46。
圖24顯示核酸SEQ.ID.No.47和氨基酸SEQ.ID.No.48。
圖25顯示核酸SEQ.ID.No.49和氨基酸SEQ.ID.No.50。
圖26顯示核酸SEQ.ID.No.51和氨基酸SEQ.ID.No.52。
圖27顯示核酸SEQ.ID.No.53和氨基酸SEQ.ID.No.54。
圖28顯示核酸SEQ.ID.No.55和氨基酸SEQ.ID.No.56。
圖29顯示核酸SEQ.ID.No.57和氨基酸SEQ.ID.No.58。
圖30顯示核酸SEQ.ID.No.59和氨基酸SEQ.ID.No.60。
圖31顯示核酸SEQ.ID.No.61和氨基酸SEQ.ID.No.62。
圖32顯示核酸SEQ.ID.No.63和氨基酸SEQ.ID.No.64。
圖33顯示核酸SEQ.ID.No.65和氨基酸SEQ.ID.No.66。
圖34顯示核酸SEQ.ID.No.67和氨基酸SEQ.ID.No.68。
圖35顯示核酸SEQ.ID.No.69和氨基酸SEQ.ID.No.70。
圖36顯示核酸SEQ.ID.No.71和氨基酸SEQ.ID.No.72。
圖37顯示核酸SEQ.ID.No.73和氨基酸SEQ.ID.No.74。
圖38顯示核酸SEQ.ID.No.75和氨基酸SEQ.ID.No.76。
圖39顯示核酸SEQ.ID.No.77和氨基酸SEQ.ID.No.78。
圖40顯示核酸SEQ.ID.No.79和氨基酸SEQ.ID.No.80。
圖41顯示核酸SEQ.ID.No.81和氨基酸SEQ.ID.No.82。
圖42顯示核酸SEQ.ID.No.83和氨基酸SEQ.ID.No.84。
圖43顯示核酸SEQ.ID.No.85和氨基酸SEQ.ID.No.86。
圖44顯示核酸SEQ.ID.No.87和氨基酸SEQ.ID.No.88。
圖45顯示核酸SEQ.ID.No.89和氨基酸SEQ.ID.No.90。
圖46顯示核酸SEQ.ID.No.91和氨基酸SEQ.ID.No.92。
圖48顯示核酸SEQ.ID.No.95和氨基酸SEQ.ID.No.96。
圖49顯示核酸SEQ.ID.No.97和氨基酸SEQ.ID.No.98。
圖50顯示核酸SEQ.ID.No.99和氨基酸SEQ.ID.No.100。
圖51顯示核酸SEQ.ID.No.101和氨基酸SEQ.ID.No.102。
圖52顯示核酸SEQ.ID.No.103和氨基酸SEQ.ID.No.104。
圖53顯示核酸SEQ.ID.No.105和氨基酸SEQ.ID.No.106。
圖54顯示核酸SEQ.ID.No.107和氨基酸SEQ.ID.No.108。
圖55顯示核酸SEQ.ID.No.109和氨基酸SEQ.ID.No.110。
圖56顯示核酸SEQ.ID.No.111和氨基酸SEQ.ID.No.112。
圖57顯示核酸SEQ.ID.No.113和氨基酸SEQ.ID.No.114。
圖58顯示核酸SEQ.ID.No.115和氨基酸SEQ.ID.No.116。
圖59顯示核酸SEQ.ID.No.117和氨基酸SEQ.ID.No.118。
圖60顯示核酸SEQ.ID.No.119和氨基酸SEQ.ID.No.120。
圖61顯示核酸SEQ.ID.No.121和氨基酸SEQ.ID.No.122。
圖62顯示核酸SEQ.ID.No.123和氨基酸SEQ.ID.No.124。
圖63顯示核酸SEQ.ID.No.125和氨基酸SEQ.ID.No.126。
圖64顯示核酸SEQ.ID.No.127和氨基酸SEQ.ID.No.128。
圖65顯示核酸SEQ.ID.No.129和氨基酸SEQ.ID.No.130。
圖66顯示核酸SEQ.ID.No.131和氨基酸SEQ.ID.No.132。
圖67顯示核酸SEQ.ID.No.133和氨基酸SEQ.ID.No.134。
圖68顯示核酸SEQ.ID.No.135和氨基酸SEQ.ID.No.136。
圖69顯示核酸SEQ.ID.No.137和氨基酸SEQ.ID.No.138。
圖70顯示核酸SEQ.ID.No.139和氨基酸SEQ.ID.No.140。
圖72顯示核酸SEQ.ID.No.143和氨基酸SEQ.ID.No.144。
圖73顯示核酸SEQ.ID.No.145和氨基酸SEQ.ID.No.146。
圖74顯示核酸SEQ.ID.No.147和氨基酸SEQ.ID.No.148。
圖75顯示核酸SEQ.ID.No.149和氨基酸SEQ.ID.No.150。
圖76顯示核酸SEQ.ID.No.151和氨基酸SEQ.ID.No.152。
圖77顯示核酸SEQ.ID.No.153和氨基酸SEQ.ID.No.154。
圖78顯示核酸SEQ.ID.No.155和氨基酸SEQ.ID.No.156。
圖79顯示核酸SEQ.ID.No.157和氨基酸SEQ.ID.No.158。
圖80顯示核酸SEQ.ID.No.159和氨基酸SEQ.ID.No.160。
圖81顯示核酸SEQ.ID.No.161和氨基酸SEQ.ID.No.162。
圖82顯示核酸SEQ.ID.No.163和氨基酸SEQ.ID.No.164。
圖83顯示核酸SEQ.ID.No.165和氨基酸SEQ.ID.No.166。
圖84顯示核酸SEQ.ID.No.167和氨基酸SEQ.ID.No.168。
圖85顯示核酸SEQ.ID.No.169和氨基酸SEQ.ID.No.170。
圖86顯示核酸SEQ.ID.No.171和氨基酸SEQ.ID.No.172。
圖87顯示核酸SEQ.ID.No.173和氨基酸SEQ.ID.No.174。
圖88顯示核酸SEQ.ID.No.175和氨基酸SEQ.ID.No.176。
圖89顯示核酸SEQ.ID.No.177和氨基酸SEQ.ID.No.178。
圖90顯示核酸SEQ.ID.No.179和氨基酸SEQ.ID.No.180。
圖91顯示核酸SEQ.ID.No.181和氨基酸SEQ.ID.No.182。
圖92顯示核酸SEQ.ID.No.183和氨基酸SEQ.ID.No.184。
圖93顯示核酸SEQ.ID.No.185和氨基酸SEQ.ID.No.186。
圖94顯示核酸SEQ.ID.No.187和氨基酸SEQ.ID.No.188。
圖95顯示核酸SEQ.ID.No.189和氨基酸SEQ.ID.No.190。
圖96顯示核酸SEQ.ID.No.191和氨基酸SEQ.ID.No.192。
圖97顯示核酸SEQ.ID.No.193和氨基酸SEQ.ID.No.194。
圖98顯示核酸SEQ.ID.No.195和氨基酸SEQ.ID.No.196。
圖99顯示核酸SEQ.ID.No.197和氨基酸SEQ.ID.No.198。
圖100顯示核酸SEQ.ID.No.199和氨基酸SEQ.ID.No.200。
圖101顯示核酸SEQ.ID.No.201和氨基酸SEQ.ID.No.202。
圖102顯示核酸SEQ.ID.No.203和氨基酸SEQ.ID.No.204。
圖103顯示核酸SEQ.ID.No.205和氨基酸SEQ.ID.No.206。
圖104顯示核酸SEQ.ID.No.207和氨基酸SEQ.ID.No.208。
圖105顯示核酸SEQ.ID.No.209和氨基酸SEQ.ID.No.210。
圖106顯示核酸SEQ.ID.No.211和氨基酸SEQ.ID.No.212。
圖107顯示核酸SEQ.ID.No.213和氨基酸SEQ.ID.No.214。
圖108顯示核酸SEQ.ID.No.215和氨基酸SEQ.ID.No.216。
圖109顯示核酸SEQ.ID.No.217和氨基酸SEQ.ID.No.218。
圖110顯示核酸SEQ.ID.No.219和氨基酸SEQ.ID.No.220。
圖111顯示核酸SEQ.ID.No.221和氨基酸SEQ.ID.No.222。
圖112顯示核酸SEQ.ID.No.223和氨基酸SEQ.ID.No.224。
圖113顯示核酸SEQ.ID.No.225和氨基酸SEQ.ID.No.226。
圖114顯示核酸SEQ.ID.No.227和氨基酸SEQ.ID.No.228。
圖115顯示核酸SEQ.ID.No.229和氨基酸SEQ.ID.No.230。
圖116顯示核酸SEQ.ID.No.231和氨基酸SEQ.ID.No.232。
圖117顯示核酸SEQ.ID.No.233和氨基酸SEQ.ID.No.234。
圖118顯示核酸SEQ.ID.No.235和氨基酸SEQ.ID.No.236。
圖119顯示核酸SEQ.ID.No.237和氨基酸SEQ.ID.No.238。
圖120顯示核酸SEQ.ID.No.239和氨基酸SEQ.ID.No.240。
圖121顯示核酸SEQ.ID.No.241和氨基酸SEQ.ID.No.242。
圖122顯示核酸SEQ.ID.No.243和氨基酸SEQ.ID.No.244。
圖123顯示核酸SEQ.ID.No.245和氨基酸SEQ.ID.No.246。
圖124顯示核酸SEQ.ID.No.247和氨基酸SEQ.ID.No.248。
圖125顯示核酸SEQ.ID.No.249和氨基酸SEQ.ID.No.250。
圖126顯示核酸SEQ.ID.No.251和氨基酸SEQ.ID.No.252。
圖127顯示核酸SEQ.ID.No.253和氨基酸SEQ.ID.No.254。
圖128顯示核酸SEQ.ID.No.255和氨基酸SEQ.ID.No.256。
圖129顯示核酸SEQ.ID.No.257和氨基酸SEQ.ID.No.258。
圖130顯示核酸SEQ.ID.No.259和氨基酸SEQ.ID.No.260。
圖131顯示核酸SEQ.ID.No.261和氨基酸SEQ.ID.No.262。
圖132顯示核酸SEQ.ID.No.263和氨基酸SEQ.ID.No.264。
圖133顯示核酸SEQ.ID.No.265和氨基酸SEQ.ID.No.266。
圖134顯示核酸SEQ.ID.No.267和氨基酸SEQ.ID.No.268。
圖135顯示核酸SEQ.ID.No.269和氨基酸SEQ.ID.No.270。
圖136顯示核酸SEQ.ID.No.271和氨基酸SEQ.ID.No.272。
圖137顯示核酸SEQ.ID.No.273和氨基酸SEQ.ID.No.274。
圖138顯示核酸SEQ.ID.No.275和氨基酸SEQ.ID.No.276。
圖139顯示核酸SEQ.ID.No.277和氨基酸SEQ.ID.No.278。
圖140顯示核酸SEQ.ID.No.279和氨基酸SEQ.ID.No.280。
圖141顯示核酸SEQ.ID.No.281和氨基酸SEQ.ID.No.282。
圖142顯示核酸SEQ.ID.No.283和氨基酸SEQ.ID.No.284。
圖143顯示核酸SEQ.ID.No.285和氨基酸SEQ.ID.No.286。
圖144顯示核酸SEQ.ID.No.287和氨基酸SEQ.ID.No.288。
圖145顯示核酸SEQ.ID.No.289和氨基酸SEQ.ID.No.290。
圖146顯示核酸SEQ.ID.No.291和氨基酸SEQ.ID.No.292。
圖147顯示核酸SEQ.ID.No.293和氨基酸SEQ.ID.No.294。
圖148顯示核酸SEQ.ID.No.295和氨基酸SEQ.ID.No.296。
圖149顯示核酸SEQ.ID.No.297和氨基酸SEQ.ID.No.298。
圖151顯示序列組的比較。
圖152顯示了全長克隆的對比。
圖153顯示通過PCR克隆細(xì)胞色素p450cDNA片段的方法。
圖154顯示核酸SEQ.ID No.299和氨基酸SEQ.ID.No.300。
圖155顯示核酸SEQ.ID No.301和氨基酸SEQ.ID.No.302。
圖156顯示核酸SEQ.ID No.303和氨基酸SEQ.ID.No.304。
圖157顯示核酸SEQ.ID No.305和氨基酸SEQ.ID.No.306。
圖158顯示核酸SEQ.ID No.307和氨基酸SEQ.ID.No.308。
圖159顯示核酸SEQ.ID No.309和氨基酸SEQ.ID.No.310。
圖160顯示核酸SEQ.ID No.311和氨基酸SEQ.ID.No.312。
圖161顯示核酸SEQ.ID No.313和氨基酸SEQ.ID.No.314。
圖162顯示核酸SEQ.ID No.315和氨基酸SEQ.ID.No.316。
圖163顯示了基因芯片上所有克隆的探針組序列。
發(fā)明詳述定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的意義。Singleton等，(1994)《微生物和分子生物學(xué)字典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二版，John Wiley and Sons(紐約)為技術(shù)人員提供了許多關(guān)于本發(fā)明所用術(shù)語的通用字典。本文所提及的所有專利和出版物均納入本文作為參考。出于本發(fā)明的目的，下列術(shù)語如下定義。
“酶活性”包括脫甲基化、羥基化、環(huán)氧化、N-氧化、磺基氧化、N-、S-和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的，或有義或反義的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，并且除非另有限制，該術(shù)語包括能以類似于天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有指出，特定的核酸序列包括其互補序列。
術(shù)語“可操作性連接”、“可操作性結(jié)合”和“以可操作性順序”指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列影響對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
當(dāng)術(shù)語“重組體”用于指細(xì)胞時，它指該細(xì)胞復(fù)制異源核酸，表達(dá)所述核酸或表達(dá)異源核酸編碼的肽、異源肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可以有義或反義形式表達(dá)在細(xì)胞的天然形式(非重組)中未發(fā)現(xiàn)的基因或基因片段。重組細(xì)胞也可表達(dá)在細(xì)胞的天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因，但其中該基因通過人工方式被改變并重新引入細(xì)胞。
“結(jié)構(gòu)基因”是含有編碼蛋白質(zhì)、多肽或其部分的DNA片段的基因的一部分，并且不包括啟動轉(zhuǎn)錄的5’序列?；蛘呓Y(jié)構(gòu)基因可編碼不可翻譯的產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)基因可是在細(xì)胞中正常發(fā)現(xiàn)的基因，或者它是引入的而非在細(xì)胞或細(xì)胞位置中正常發(fā)現(xiàn)的基因，在這種情況下稱為“異源基因”。異源基因可全部或部分來源于本領(lǐng)域已知的任何來源，包括細(xì)菌基因組或附加體、真核生物的、核的或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可含有一種或多種修飾，這些修飾可影響生物活性或其特性、表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速率或表達(dá)控制的方式。這種修飾包括(但不限于)一個或多個核苷酸的突變、插入、刪除和取代。結(jié)構(gòu)基因可構(gòu)成不間斷的編碼序列或可包括一個或多個與合適的剪接接頭結(jié)合的內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)基因可以是可翻譯或不可翻譯的，包括反義方向(antisense orientation)。結(jié)構(gòu)基因可以是來源于多種來源和多種基因序列的復(fù)合物(天然存在的或合成的，其中合成的指化學(xué)合成的DNA)。
“來源于”用來指從某種來源(化學(xué)和/或生物的)取得、獲得、接受得、追溯、復(fù)制或傳下的?？赏ㄟ^對原始來源的化學(xué)或生物學(xué)操作(包括，但不限于取代、添加、插入、刪除、提取、分離、突變和復(fù)制)產(chǎn)生衍生物。
涉及DNA序列的術(shù)語“化學(xué)合成的”指部分核苷酸組分在體外裝配?？墒褂靡蚜己媒⒌姆椒?Caruthers，《DNA和RNA測序的方法》(Methodologyof DNA and RNA Secquencing)，(1983)，Weissman編，Praeger Publishers，New York，第1章)實現(xiàn)DNA的手工化學(xué)合成；可使用許多市售可得的機器的一種進行自動化學(xué)合成。
可通過以下方法進行序列的最佳對比Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482(1981))的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443(1970))的同源性算法、Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988))的相似性檢索方法、這些算法的計算機化的工具(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通過檢驗。
可從幾種來源(包括生物信息國家中心(NCBI，Bethesda，Md.)和因特網(wǎng))獲得NCBI基礎(chǔ)局部序列比對檢索工具(BLAST)(Altschul等，1990)與序列分析程序blast、blastn、blastx、tblastn和tblastx聯(lián)合使用。該工具可在htp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/獲得。如何使用該程序檢測序列同一性描述于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html。
本文使用并應(yīng)用于氨基酸序列的術(shù)語“實質(zhì)性氨基酸同一性”或“實質(zhì)性氨基酸序列同一性”表示多肽的一種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細(xì)胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一氨基酸到終止密碼子的對應(yīng)區(qū)域相比，所述肽含有至少70％的序列同一性、優(yōu)選80％氨基酸序列同一性、更優(yōu)選90％氨基酸序列同一性、最優(yōu)選至少99-100％序列同一性的序列。
本文使用并應(yīng)用于核酸序列的術(shù)語“實質(zhì)性核酸同一性”或“實質(zhì)性核酸序列同一性”表示多核苷酸序列的一種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細(xì)胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應(yīng)區(qū)域相比，所述多核苷酸含有至少75％的序列同一性、優(yōu)選81％序列同一性、更優(yōu)選91％序列同一性、最優(yōu)選至少99-100％序列同一性的序列。
核苷酸序列實質(zhì)相同的另一個指標(biāo)是兩個分子在嚴(yán)格條件下是否可雜交。嚴(yán)格條件視序列而定，在不同情況下是不同的。嚴(yán)格條件一般選擇比給定離子強度和pH時特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-20℃，通常是約10-15℃。Tm是在給定離子強度和pH時50％靶序列與匹配的探針雜交的溫度。嚴(yán)格條件通常是鹽濃度為約0.02摩爾，pH是7，溫度是至少約60℃。例如，在標(biāo)準(zhǔn)的Southern雜交方法中，嚴(yán)格條件包括于42℃在6×SSC中初次洗滌，然后于至少約55℃(通常是約60℃，更常見是約65℃)在0.2×SSC進行一次或多次額外洗滌。
出于本發(fā)明的目的，當(dāng)核苷酸序列編碼的多肽和/或蛋白質(zhì)實質(zhì)性相同時，核苷酸序列也實質(zhì)性相同。因此，當(dāng)一條核酸序列與第二條核酸序列編碼的多肽實質(zhì)性相同時，這兩條核酸序列是實質(zhì)性相同的，即使由于遺傳密碼所允許的簡并性造成它們在嚴(yán)格條件下不會雜交(對密碼子簡并性和遺傳密碼的解釋參見Darnell等，(1990)《分子生物學(xué)》(Molecular Cell Biology)，第二版，Scientific American Books W.H.Freeman and Company，New York)?？赏ㄟ^許多本領(lǐng)域熟知的方式，例如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后基于染色通過目測來表征蛋白質(zhì)純度或均一性。出于特定的目的，可能需要高分辨率并可利用HPLC或類似的裝置。
本文使用的術(shù)語“載體”指將DNA片段轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的核酸分子。載體可由于復(fù)制DNA并可在宿主細(xì)胞中獨立地復(fù)制。術(shù)語“運載體”有時可與“載體”互換使用。本文使用的術(shù)語“表達(dá)載體”指重組DNA分子，該分子含有所需的編碼序列和用于在特定宿主生物體中表達(dá)操作性相連的編碼序列所需合適的核酸序列。通常，原核生物中表達(dá)所需的核酸序列通常含有啟動子、操縱子(任選)與核糖體結(jié)合位點，以及其它序列。已知真核細(xì)胞可利用啟動子、增強子以及終止和聚腺苷酸化信號。
為再生完全經(jīng)遺傳工程改造的具有根的植物，可在植物細(xì)胞中插入核酸，例如通過諸如體內(nèi)接種的任何技術(shù)或通過任何已知的體外組織培養(yǎng)技術(shù)來產(chǎn)生可再生為完整植物的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。因此，例如可通過病原性或非病原性根瘤土壤桿菌(A.tumefacien)的體外接種來插入植物細(xì)胞。也可使用其它這樣的組織培養(yǎng)技術(shù)。
“植物組織”包括分化或未分化的植物組織，包括，但不限于根、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織以及培養(yǎng)物中細(xì)胞的各種形式，例如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織。植物組織可在植物中(in planta)或器官中，組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。
本文使用的“植物細(xì)胞”包括植物中的植物細(xì)胞和培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體。
“cDNA”或“互補DNA”一般指核苷酸序列與RNA分子互補的單鏈DNA分子。cDNA是通過逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA模板作用形成的。
獲得核酸序列的方案根據(jù)本發(fā)明，從轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體煙草譜系的煙草組織中提取RNA。提取的RNA然后用于產(chǎn)生cDNA。然后使用兩種方案產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列。
在第一方案中，從植物組織中提取富含polyA的RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄PCR制備cDNA。然后使用簡并引物加上寡聚d(T)反向引物，用單鏈cDNA產(chǎn)生p450特異性PCR群。以高度保守的p450基序為基礎(chǔ)設(shè)計引物。特定的簡并引物的例子示于圖1。進一步分析含有合適大小插入物的質(zhì)粒的序列片段。這些插入物的大小一般是約300-800個核苷酸，視采用何種引物而定。
在第二方案中，首先構(gòu)建cDNA文庫。使用簡并引物加上在質(zhì)粒上作為反向引物的T7引物，使用質(zhì)粒中的cDNA產(chǎn)生p450特異的PCR群。如第一方案中一樣，進一步分析含有合適大小插入物的質(zhì)粒的序列片段。
已知產(chǎn)生高水平降煙堿的煙草植物譜系(轉(zhuǎn)化體)和降煙堿水平檢測不到的植物譜系可用作起始材料。
然后可從植物上取下葉子并用乙烯處理以激活本文所定義的p450酶活性。示于本領(lǐng)域已知的技術(shù)提取總RNA。然后使用如圖153所述的寡聚d(T)引物經(jīng)PCR(RT-PCR)產(chǎn)生cDNA片段。然后可完全地構(gòu)建本文實施例所述的cDNA文庫。
p450型酶的保守區(qū)域可用作簡并引物(圖75)的模板。可通過PCR使用簡并引物擴增p450特異性條帶。表示p450樣酶的區(qū)帶可通過DNA測序鑒定?？墒褂描b定合適的候選對象的BLAST檢索、算法或其它工具來表征PCR片段的特性。
已鑒定片段的序列信息可用于開發(fā)PCR引物。這些引物與cDNA文庫中的質(zhì)粒引物聯(lián)合用于克隆全長p450基因。進行大規(guī)模Sourthern反向分析來檢測所有獲得的片段克隆以及在一些情況中全長克隆的差別表達(dá)。在本發(fā)明的這個方面，為篩選所有克隆的插入物，可用不同組織的標(biāo)記的總cDNA作為探針來與克隆的DNA片段雜交，進行大規(guī)模反向Sourthern測定。
也用非放射性和放射性(P32)Northern印跡測定來鑒定克隆p450片段和全長克隆。
通過衍生它們的氨基酸序列與選擇抗原性和對其它克隆獨特的肽區(qū)域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯(lián)于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使用這些抗體對植物組織進行Western印跡分析或其它免疫學(xué)方法。
可使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS，Baulcombe，Current Opinions inPlant Biology，1999，2109-113)檢測以上鑒定的核酸序列。
通過衍生它們的氨基酸序列與選擇可能的抗原性和對其它克隆獨特的肽區(qū)域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯(lián)于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使用這些抗體進行Western印跡分析。
在本發(fā)明的另一方面，使用干擾RNA(RNAi)技術(shù)在本發(fā)明的煙草植物中進一步鑒定細(xì)胞色素p450酶活性。描述該技術(shù)的以下參考文獻(xiàn)納入本文作為參考，Smith等，Nature，2000，407319-320；Fire等，Nature，1998，391306-311；Waterhouse等，PNAS，1998，9513959-13964；Stalberg等，Plant Molecular Biology，1993，23671-683；Baulcombe，Current Opinions inPlant Biology，1999，2109-113和Brigneti等，EMBO Journal，1998，17(22)6739-6746?？墒褂肦NAi技術(shù)、反義技術(shù)或所述的各種其它方法來轉(zhuǎn)化植物。
有幾種技術(shù)將外來遺傳物質(zhì)引入植物細(xì)胞并獲得穩(wěn)定地維持和表達(dá)所引入基因的植物。這種技術(shù)包括加速包裹在微粒上的遺傳物質(zhì)進入細(xì)胞(授予Cornell的美國專利4,945,050和授予DowElanco的美國專利5,141,131)?？墒褂猛寥罈U菌技術(shù)來轉(zhuǎn)化植物，參見授予University of Toledo的美國專利5,177,010；授予Texas A & M的5,104,310；Schilperoot的歐洲專利申請0131624B1、歐洲專利申請120516、159418B1、歐洲專利申請120516、159418B1和176,112；授予Schilperoot美國專利5,149,645；5,469,976；5,464,763；4,940,838和4,693,976；MaxPlanck的歐洲專利申請116718、290799、320500；Japan Nicotiana的歐洲專利申請604662和627752；CibaGeigy的歐洲專利申請0267159、0292435和美國專利5,231,019；授予Calgene的美國專利5,463,174和4,762,785；授予Agracetus的美國專利5,004,863和5,159,135。其它轉(zhuǎn)化技術(shù)包括whiskers技術(shù)，參見，例如授予Zeneca的美國專利5,302,523和5,464,765。電穿孔技術(shù)也用于轉(zhuǎn)化植物，參見，Boyce Thompson Institute的WO 87/06614、Dekalb的5,472,869和5,384,253；PGS的WO9209696和WO9321335。所有這些轉(zhuǎn)化專利和出版物引作參考。除了許多轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)以外，與外來基因接觸的組織的類型也可變。這種組織包括，但不限于胚胎發(fā)生組織、I和II型愈傷組織、下胚軸、分生組織等。使用技術(shù)人員已知的合適的技術(shù)幾乎可轉(zhuǎn)化所有分化過程中的植物組織。
引入植物的外來遺傳物質(zhì)可包含選擇標(biāo)記。具體的標(biāo)記可由技術(shù)人員判斷，但以下選擇標(biāo)記可與任何其它可用作選擇標(biāo)記的本文未列出的基因一起使用。這種選擇標(biāo)記包括，但不限于編碼抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，以及編碼對N-膦酰甲基甘氨酸、潮霉素、氨甲喋呤、草銨膦(phosphinothricin)(bar)、咪唑啉酮、磺酰脲和三唑并嘧啶除草劑，例如chlorosulfuron、溴苯腈、茅草枯等具抗性或耐受性的那些基因。
除了選擇標(biāo)記以外，可能需要使用報道基因。在一些例子中，可使用報道基因而無需選擇標(biāo)記。報道基因是通常不存在于或不表達(dá)于受者生物體或組織中的基因。報道基因通常編碼提供一些表型改變或酶性能的蛋白質(zhì)。這種基因的例子見納入本文作為參考的K.Weising等，Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)。優(yōu)選的報道基因包括，但不限于葡糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。
一旦引入植物組織后，可通過任何本領(lǐng)域已知的方法來評價結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，可以mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成或發(fā)生沉默基因的量來檢測表達(dá)(參見納入本文作為參考的美國專利號5,583,021)。用于體外培養(yǎng)植物細(xì)胞和在許多情況中，用于再生完整植物的技術(shù)是已知的(歐洲申請?zhí)?8810309.0)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知將引入的表達(dá)復(fù)合物變?yōu)樯虡I(yè)有用品種的方法。
一旦獲得表達(dá)所需水平的p450酶的植物細(xì)胞，可使用本領(lǐng)域熟知的方法和技術(shù)再生植物組織和完整的植物。再生的植物可通過常規(guī)方法繁殖，引入的基因可通過常規(guī)植物育種技術(shù)轉(zhuǎn)入其它品系或品種。
以下實施例描述了實施本發(fā)明的方法并且應(yīng)理解為是說明性的，而非基于此來限制本發(fā)明在權(quán)利要求中所定義的范圍。
實施例實施例1植物組織的發(fā)育和乙烯處理植物生長將植物種在盆中，在溫室中生長4周。將4周齡的幼苗移到單獨的盆中，溫室中生長2個月。生長過程中，每天給植物澆水2次，水中含有150ppm的NPK肥料。將展開的綠葉與植物分離，以進行下面所述的乙烯處理。
細(xì)胞系78379由肯塔基大學(xué)發(fā)放的煙草品系78379用作植物材料的來源，它是一種白肋(burley)煙草品系。用本領(lǐng)域種植煙草的標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)100株植物，移植，并且用不同的數(shù)字(1-100)給它們貼注標(biāo)簽。用推薦的方法施肥和進行田間管理。
100株植物中的3/4將20-100％的煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿。100株中的1/4將小于5％的煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿。植株87轉(zhuǎn)化率最低(2％)，而植株21的轉(zhuǎn)化率為100％。將轉(zhuǎn)化率小于3％的植株分類為非轉(zhuǎn)化株。對植株87和21自花授粉的種子以及雜交(21×87和87×21)的種子進行遺傳差異和表型差異的研究。來自植株21自花授粉種子的植物是轉(zhuǎn)化株，99％的來自植株87自花授粉種子的植物是非轉(zhuǎn)化株。剩余1％的來自植株87自花授粉種子的植物有較低的轉(zhuǎn)化率(5-15％)。雜交種均為轉(zhuǎn)化株。
細(xì)胞系4407煙草品系4407用作植物材料來源，它是一種白肋品系。選擇均一的并且具代表性的植物(100)并貼上標(biāo)簽。在這100株植物中，97株是非轉(zhuǎn)化株，3株是轉(zhuǎn)化株。植株56的轉(zhuǎn)化率最低(1.2％)，植株58的轉(zhuǎn)化水平最高(96％)。將這兩株植物進行自花授粉和雜交。
來自植株58自花授粉種子的植株產(chǎn)生3∶1的分離比(轉(zhuǎn)化株∶非轉(zhuǎn)化株＝3∶1)。植株58-33和58-25分別被鑒定為純合轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株植物品系。植株58-33下一代后裔中的分析確證了該植株的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率。
細(xì)胞系PBLB01PBLB01是由ProfiGen，Inc.研究開發(fā)的一種白肋品系，用作植物材料的來源。從PBLB01的第一代(foundation)種子中選擇轉(zhuǎn)化株植株。
乙烯處理方法將綠色葉片從溫室生長2-3個月的植物分離，噴施0.3％的乙烯溶液(商品名Ethephon(Rhone-Poulenc))。將每片經(jīng)噴施的葉子懸掛在配有加濕器的養(yǎng)護架(curing rack)上，覆蓋塑料膜。在處理期間，用乙烯溶液定期噴施樣品葉片。乙烯處理后約24-48小時，收集葉子提取RNA。取同一組樣品的另外一份(sup-sample)用于代謝成分分析以測定葉片代謝物的濃度以及感興趣的更具體的成分如多種生物堿的分析。
例如，可如下進行生物堿分析。樣品(0.1克)和0.5毫升2N NaOH以及含有喹啉(作為內(nèi)標(biāo))和甲基叔丁基乙醚的5毫升提取液在150rpm振蕩。在配有FID檢測器的HP 6890GC上分析樣品。250℃的溫度用于檢測器和上樣器(injector)。使用含有與5％苯酚和95％甲基硅酮(methyl silicon)交聯(lián)的熔融硅石的HP柱(30m-0.32nm-1m)，溫度梯度為每分鐘10℃，110-185℃。該柱在100℃工作，用氦氣作為運載氣體，流速為1.7cm3min-1，分流比為40∶1，上樣體積為2·1。
實施例2分離RNA對于RNA的提取，如上所述用乙烯處理2月齡溫室植物的中等大小的葉片。0和24-48小時的樣品用于RNA提取。在有些情況下，從打頂(flower-head removal)后10天的植物取處于衰老過程的葉片樣品。這些樣品也用于提取。用Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia，California)按照生產(chǎn)商的方法分離總RNA。
用DEPC處理過的研缽和杵在液氮中將組織樣品研磨為細(xì)粉。將約100毫克磨碎的組織轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5毫升eppendorf管中。將樣品管置于液氮中，直到收集完所有樣品。然后，將試劑盒中提供的450μl RLT緩沖液加入各管中。劇烈振蕩樣品，然后在56℃溫育3分鐘。將裂解物加在放于2毫升收集管中的QIAshredderTM旋轉(zhuǎn)柱上，最大速度離心2分鐘。收集流出液，加0.5體積的乙醇到澄清的裂解液中。充分混合樣品，轉(zhuǎn)移到放在2毫升收集管中的小旋轉(zhuǎn)柱中。10,000rpm離心樣品1分鐘。然后，吸取700μl RW1緩沖液到Rneasy柱上，10,000rpm離心1分鐘。吸取RPE緩沖液到置于新收集管中的Rneasy柱上，10,000rpm離心1分鐘。再將RPE緩沖液加到Rneasy旋轉(zhuǎn)柱上，以最大速度離心2分鐘以使膜干燥。為了除掉殘留的乙醇，將膜置于一空收集管上，再以最大速度離心1分鐘。將Rneasy柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5毫升收集管中，將40μl不含RNA酶的水直接吸到Rneasy膜上。該最終洗脫物在10,000rpm離心1分鐘。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質(zhì)量和數(shù)量。
按照生產(chǎn)商的方法用OligotexTMpoly A+RNA純化試劑盒(Qiagen Inc.)分離Poly(A)RNA。使用溶于最大為250μl體積的約200μg總RNA。將250μl OBB緩沖液和15μl OligotexTM懸浮液加到250μl總RNA中。通過吸打使這些物質(zhì)徹底混合，在加熱器(heating block)上70℃保溫3分鐘。然后，將樣品置于室溫約20分鐘。最大速度離心2分鐘得到oligotexmRNA復(fù)合物團塊。從微離心管中除去全部上清液，僅剩約50μl。再用OBB緩沖液處理樣品。通過渦旋將oligotexmRNA團塊重新懸浮在400μl OW2緩沖液中。將該混合物轉(zhuǎn)移到置于新管中的小旋轉(zhuǎn)柱上，以最大速度離心1分鐘。將旋轉(zhuǎn)柱移到新管中，再往該柱中加入400μl OW2緩沖液。然后，以最大速度離心該管。將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到最終的1.5毫升微量離心管中。用60μl熱的(70℃)OEB緩沖液洗脫樣品。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析Poly A產(chǎn)物。
實施例3反轉(zhuǎn)錄-PCR按照生產(chǎn)商的方法用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，California)制備第一鏈cDNA。富集了poly A+RNA的寡聚dT引物混合物由少于5μg的總RNA、1μl 10mM dNTP混合物、1μl Oligo d(T)12-18(0.5μg/μl)和至多10μl的經(jīng)DEPC處理的水組成。各樣品在65℃溫育5分鐘，然后置于冰上至少1分鐘。按順序加入下列各組分，以制備反應(yīng)混合物2μl 10X RT緩沖液、4μl 25mM MgCl2、2μl 0.1M DTT和1μl去除RNA酶的重組RNA酶抑制劑(Rnase OUT Recombinant RNaseInhibitor)。吸取9μl反應(yīng)混合物到各RNA/引物混合物，輕柔混合。42℃溫育2分鐘，在各管中加入1μl Super Script IITMRT，42℃溫育50分鐘。在70℃終止反應(yīng)15分鐘，冰上冷卻。離心收集樣品，在各管中加入1μlRNase H，37℃溫育20分鐘。用200pmoles正向引物(如圖75所示的變性引物，SEQ ID NO.149-156)和100pmoles反向引物(18堿基的寡聚d(T)，接一個隨機堿基)進行第二次PCR。
反應(yīng)條件是94℃ 2分鐘；然后進行40個循環(huán)的PCR94℃ 1分鐘，45-60℃ 2分鐘，72℃ 3分鐘；最后72℃再延伸額外的10分鐘。
用1％的瓊脂糖凝膠電泳分析10微升的擴增樣品。將大小正確的條帶從瓊脂糖凝膠上純化出來。
實施例4PCR片段群體的產(chǎn)生按照生產(chǎn)商的方法將實施例3得到的PCR片段連接到pGEM-T EasyVector(Promega，Madison，Wisconsin)中。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB培養(yǎng)基平板上，進行藍(lán)/白選擇。選擇克隆，置于96孔板上在1.2毫升LB培養(yǎng)基中37℃生長過夜。對于所有選出的集落保留凍存管。用Beckman′s Biomeck 2000小制備機器人技術(shù)(miniprep robotics)以WizardSVMiniprep試劑盒(Promega)從平板上純化質(zhì)粒。用100μl水洗脫質(zhì)粒DNA，存貯于96孔板中。用EcoR1消化質(zhì)粒，并用1％瓊脂糖凝膠分析以確證DNA的量和插入片段的大小。用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，California)測序含有400-600bp插入片段的質(zhì)粒。用BLAST搜索將測得的序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進行比對。鑒定與p450相關(guān)的片段并進一步分析?；蛘?，將p450片段從差減文庫中分離出來。如上所述分析這些片段。
實施例5CDNA文庫的構(gòu)建如下所述從乙烯處理的葉片中制備總RNA以構(gòu)建cDNA文庫。首先，用改良的酸酚和氯仿提取方法從乙烯處理的煙草品系58-33葉片中提取總RNA。改良的方法是用1克組織進行研磨，隨后在5毫升加入了5毫升苯酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.5；200mMNaCl；10mM EDTA；0.5％ SDS)中渦旋。將提取的樣品離心，保留上清。該提取步驟再重復(fù)2-3次直到上清變得澄清。加入約5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。加入3倍體積的ETOH和1/10體積的3M NaOAc(pH5.2)以從混合的上清組分中沉淀RNA，在-20℃存貯1小時。轉(zhuǎn)移到Corex玻璃容器中以后，在4℃ 9,000RPM離心RNA組分45分鐘。離心下來的團塊用70％乙醇洗滌，4℃ 9,000RPM離心5分鐘。團塊干燥以后，將RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。分別用變性甲醛和分光光度計分析總RNA的質(zhì)量和數(shù)量。
以下述步驟用Oligo(dT)纖維素方法(Invitrogen)和微離心旋轉(zhuǎn)柱(Invitrogen)從得到的總RNA中分離poly A+RNA。約20mg總RNA進行兩次純化以獲得高質(zhì)量的poly A+RNA。用變性甲醛和隨后的已知全長基因的RT-PCR(確保高質(zhì)量的mRNA)來分析PolyA+RNA產(chǎn)物。
接著，以poly A+RNA作模板用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNAGigapackIII金克隆試劑盒(gold cloning kit)(Stratagene，La Jolla，California)來產(chǎn)生cDNA文庫。其中的方法按照生產(chǎn)商規(guī)定的步驟來進行。用約8μg polyA+RNA來構(gòu)建cDNA文庫。初級文庫的分析顯示約有2.5×106-1×107pfu。用IPTG和X-gal進行了互補分析，以檢測文庫的質(zhì)量背景，其中重組噬菌斑的表達(dá)高出背景反應(yīng)100倍以上。
用隨機PCR對文庫進行的更為定量的分析表明，插入的cDNA的平均大小約為1.2kb。該方法采用了如下所述的兩步法PCR。對于第一步，反向引物的設(shè)計是基于從p450片段獲得的初級序列信息。設(shè)計的反向引物和T3(正向)引物用于從cDNA文庫中擴增相應(yīng)的基因。PCR反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割高分子量的相應(yīng)條帶，純化、克隆并測序。在第二步中，用根據(jù)p450的5′UTR或翻譯起始區(qū)域設(shè)計的新引物作為正向引物，和反向引物一起(根據(jù)p450的3′UTR設(shè)計)用于下一步的PCR以獲得全長p450克隆。
如實施例3所述(反向引物除外)從構(gòu)建的cDNA文庫中用PCR擴增獲得p450片段。用位于質(zhì)粒上cDNA插入片段下游(見圖75)的T7引物作為反向引物。如實施例4所述分離、克隆和測序PCR片段。
從構(gòu)建的cDNA文庫中用PCR方法分離全長p450基因。用基因特異性反向引物(根據(jù)p450片段的下游序列設(shè)計)和正向引物(位于文庫質(zhì)粒上的T3)來克隆全長基因。分離、克隆并測序PCR片段。如果需要，可進行第二步PCR。在第二步PCR中，用根據(jù)克隆的p450的5′UTR設(shè)計的新正向引物和根據(jù)p450的3′UTR設(shè)計的反向引物來進行下一步的PCR反應(yīng)，以獲得全長p450克隆。然后對克隆測序。
實施例6克隆片段的鑒定-反向SOUTHERN印跡分析在以上實施例中鑒定的所有p450克隆上進行非放射性大規(guī)模反向southern印跡試驗以檢測差異性表達(dá)。觀察到不同p450基因簇之間的表達(dá)水平非常不同。在高水平表達(dá)的克隆上又進行了實時檢測。
非放射性southern印跡方法按如下所述進行。
1)如實施例2所述用Qiagen Rnaeasy試劑盒從乙烯處理和未處理的轉(zhuǎn)化株(58-33)和非轉(zhuǎn)化株(58-25)葉片提取總RNA。
2)用生物素加尾標(biāo)記從上述步驟產(chǎn)生的富含poly A+的RNA中衍生的單鏈cDNA來制備探針。該標(biāo)記的單鏈cDNA是如實施例3所述用轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株的總RNA(Invitrogen)進行RT-PCR產(chǎn)生的，但用了生物素化的寡聚dT作為引物(Promega)。這些用作探針與克隆的DNA雜交。
3)用限制性內(nèi)切酶EcoR1消化質(zhì)粒DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳。將這些凝膠同時干燥并轉(zhuǎn)到兩個尼龍膜上(BiodyneB)。一個膜與轉(zhuǎn)化株探針雜交，另一個膜與非轉(zhuǎn)化株探針雜交。在雜交之前將膜進行紫外線交聯(lián)(自動交聯(lián)設(shè)備，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
或者，用位于p-GEM兩臂上的序列，T3和SP6作為引物從各質(zhì)粒中PCR擴增插入片段。PCR產(chǎn)物在96孔的即時(Ready-to-run)瓊脂糖凝膠上電泳以進行分析。經(jīng)確證的插入片段點到兩個尼龍膜上。一個膜與轉(zhuǎn)化株探針雜交，另一個膜與非轉(zhuǎn)化株探針雜交。
4)按生產(chǎn)商的說明書將這些膜雜交并洗滌，其中對洗滌的嚴(yán)格性進行了改變(Enzo MaxSenceTM試劑盒，Enzo Diagnostics，Inc，F(xiàn)armingdale，NY)。膜與雜交緩沖液(2×SSC緩沖的甲酰胺，含有去垢劑和雜交增強劑)在42℃預(yù)雜交30分鐘，與10μl變性的探針42℃雜交過夜。然后室溫用1X雜交洗滌緩沖液洗滌雜交膜一次，10分鐘；68℃洗滌15分鐘，4次。然后可以對雜交膜進行檢測。
5)按生產(chǎn)商提供的檢測方法(Enzo Diagnostics，Inc.)，經(jīng)洗滌的膜用堿性磷酸酶標(biāo)記，然后用NBT/BCIP顏色檢測方法進行檢測。用1X封閉液室溫封閉雜交膜1小時，用1X檢測試劑洗滌10分鐘(3次)，用1X預(yù)顯影反應(yīng)緩沖液洗滌5分鐘(2次)，然后在顯影液中顯影直到出現(xiàn)點狀印跡。所有的試劑都由生產(chǎn)商提供(Enzo Diagnostics，Inc)。此外，還用KPL southern雜交和檢測試劑盒TM按生產(chǎn)商的方法(KPL，Gaithersburg，Maryland)進行了大規(guī)模反向Southern試驗。
實施例7克隆的鑒定-NORTHERN印跡分析除Southern印跡分析之外，如Northern印跡分析的實施例所述，一些膜進行了Northern雜交和檢測。如下所述，采用Northern雜交檢測煙草中差異表達(dá)的mRNA。
采用隨機引發(fā)方法從克隆的p450制備探針(MegaprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)，Amersham Biosciences)。
混合下述組分25ng變性的DNA模板；未標(biāo)記的dTTP、dGTP和dCTP各4μl；5μl反應(yīng)緩沖液；P32標(biāo)記的dATP和2ul Klenow I；以及水，使反應(yīng)體系達(dá)到50μl。該混合物在37℃溫育1-4小時，然后以2μl 0.5M的EDTA終止。使用前，95℃溫育5分鐘使探針變性。
從幾對煙草品系經(jīng)乙烯處理和未經(jīng)處理的新鮮葉片中制備RNA樣品。在有些情況下，使用了富含poly A+的RNA。用DEPC水(5-10μl)使約15μg總RNA或1.8μg mRNA(RNA或mRNA提取方法如實施例5所述)的體積相同。加入等體積的上樣緩沖液(1×MOPS；18.5％甲醛；50％甲酰胺；4％ Ficoll 400；溴酚藍(lán))和0.55μl EtBr(0.5μg/μl)。將樣品變性，準(zhǔn)備用電泳分離RNA。
將樣品用1XMOP緩沖液(0.4M嗎啉苯磺酸；0.1M乙酸鈉-3×H2O；10mM EDTA；用NaOH調(diào)pH至7.2)在甲醛凝膠(1％瓊脂糖，1×MOPS，0.6M甲醛)上電泳。用毛細(xì)方法在10×SSC緩沖液(1.5M NaCl；0.15M檸檬酸鈉)中將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+上(Nylon，AmershamPharmaciaBiotech)24小時。在雜交前，將有RNA樣品的膜紫外交聯(lián)(自動交聯(lián)設(shè)備，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
膜和5-10毫升預(yù)雜交緩沖液(5×SSC；50％甲酰胺；5×Denhardt′s-溶液；1％ SDS；100g/ml熱變性的平端非同源DNA)在42℃預(yù)雜交1-4小時。將舊的預(yù)雜交緩沖液棄去，加入新的預(yù)雜交緩沖液和探針。雜交在42℃過夜進行。用2×SSC室溫洗滌膜15分鐘，然后用2×SSC洗滌一次。
本發(fā)明的一個主要焦點是發(fā)現(xiàn)了可被乙烯處理誘導(dǎo)的新基因或者在煙草葉片的質(zhì)量和成分中起主要作用的新基因。如下表所示，Northern印跡和反向Southern印跡可用于測定哪些基因受乙烯處理的誘導(dǎo)(相對于不受誘導(dǎo)的植株)。令人感興趣的是，在轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株植株中并非所有的片段都受到相似的影響。對感興趣的細(xì)胞色素p450片段部分測序以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。該信息被用于后續(xù)分離和鑒定感興趣的全長基因克隆。

用全長克隆在從乙烯處理誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株白肋品系獲得的煙草組織上進行Northern分析。目的是鑒定在乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化株植株中(相對于乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化株品系相對于乙烯誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)化株白肋品系)表達(dá)有所提高的那些全長基因克隆。用這種Northern分析方法，可以通過比較轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系之間葉片組成的生化差異來確定全長克隆的功能關(guān)系。如下表所示，6個克隆在乙烯處理的轉(zhuǎn)化株植物組織中(標(biāo)記為++和+++)顯示出比在乙烯處理的非轉(zhuǎn)化株植物組織中(標(biāo)記為+)表達(dá)顯著升高。在未經(jīng)乙烯處理的轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系中所有這些克隆顯示出很少的表達(dá)或不表達(dá)。

實施例8由克隆的基因編碼的p450S的免疫檢測選擇來自3個p450克隆的長度相應(yīng)于20-22個氨基酸的肽區(qū)域，這些肽區(qū)域1)與其它克隆具有很低的同源性或沒有同源性，和2)具有很好的親水性和抗原性。下面列出了選自各個p450克隆的肽區(qū)域的氨基酸序列。將合成的肽與KHL偶聯(lián)，然后注射到家兔中。
第4次注射后2周和4周收集抗血清(Alpha Diagnostic Intl.Inc.SanAntonio，TX)。
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILGD90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNYD89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY用Western印跡分析來檢測抗血清對煙草植物組織靶蛋白的交叉活性。
從乙烯處理的(0-40小時)轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系的中等大小的葉片獲得蛋白粗提物。按生產(chǎn)商的方法用RC DC蛋白檢測試劑盒(BIO-RAD)測定該提取物的蛋白濃度。
將2微克蛋白加到各泳道中，用Laemmli SDS-PAGE體系在10％-20％梯度凝膠上分離蛋白。用Trans-Blot半干槽(Semi-Dry cell)(BIO-RAD)將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PROTRAN硝化纖維轉(zhuǎn)移膜(Schleicher & Schuell)上。用ECL AdvanceTMWestern印跡檢測試劑盒(Amersham Biosciences)檢測和顯影p450蛋白。在家兔中制備針對合成的KLH耦合物的一抗。針對兔IgG的二抗(與過氧化物酶偶聯(lián))購自Sigma。一抗和二抗都以1∶1000稀釋液使用?？贵w對Western印跡上的一條單一條帶顯示出很強的反應(yīng)性，說明該抗血清對感興趣的靶肽是單一特異性的。抗血清對與KLH耦合的合成肽也具有交叉反應(yīng)性。
實施例9分離的核酸片段的核酸同一性和結(jié)構(gòu)相關(guān)性超過100個克隆的p450片段結(jié)合Northern印跡分析來測序，以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。所用方法中使用的正向引物基于兩個共有的p450基序，這兩個基序鄰近p450基因的羧基末端。該正向引物對應(yīng)于如圖1所示的細(xì)胞色素p450基序FXPERF或GRRXCP(A/G)。反向引物使用來自質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)引物(位于pGEMTM質(zhì)粒的兩臂)SP6或T7，或使用多聚A尾巴。所用方法如下所述。
按生產(chǎn)商(Beckman Coulter)的方法用分光光度法評價起始雙鏈DNA的濃度。將模板用水稀釋到合適的濃度，95℃ 2分鐘加熱變性，然后置于冰上。測序反應(yīng)液在冰上制備，其包括0.5-10μl變性DNA模板，2μl 1.6pmole正向引物，8μl DTCS Quick Start Master Mix，用水調(diào)節(jié)總體積到20μl。溫度循環(huán)程序包括以下30個循環(huán)96℃20秒，50℃20秒，60℃4分鐘，然后4℃保溫。
加入5μl終止緩沖液(等體積的3M NaOAc、100mM EDTA和1μl20mg/ml肝糖)使測序終止。用60μl 95％的冷乙醇沉淀樣品，6000g離心6分鐘。棄去乙醇。團塊用200μl冷的70％乙醇洗滌2次。團塊干燥以后，加入40μl SLS溶液，使團塊重懸。在表面上加入一層礦物油。然后，將樣品置于CEQ 8000自動測序儀中進行進一步分析。
為了驗證核酸序列，用基于p450基因的FXPERF或GRRXCP(A/G)區(qū)域的正向引物或基于質(zhì)粒或多聚A尾巴的反向引物對核酸序列在兩個方向進行重新測序。在兩個方向上所有的測序至少進行兩次。
將細(xì)胞色素p450片段的核酸序列彼此比較，從編碼區(qū)(與編碼GRRXCP(A/G)的區(qū)域之后的第一個核酸相對應(yīng))一直到終止子。選擇該區(qū)域作為p450蛋白遺傳多態(tài)性的一個指示參數(shù)。觀察到大量的(超過70種)遺傳上不同的p450基因，類似于其它植物物種中所觀察到的。在比較核酸序列時發(fā)現(xiàn)，這些基因根據(jù)其序列同一性可置于不同的序列組群中。發(fā)現(xiàn)p450成員的最好的唯一的(unique)分組確定為那些具有75％或更大核酸同一性的序列(見表1)。降低同一性百分?jǐn)?shù)導(dǎo)致組群明顯變大。觀察到優(yōu)選的分組是那些具有81％或更大核酸同一性的序列，更優(yōu)選的分組是具有91％或更大核酸同一性的序列，最優(yōu)選的分組是具有99％或更大核酸同一性的序列。大多數(shù)組群包括至少2個成員，經(jīng)常為3個或更多個成員。沒有重復(fù)觀察到其它情況，說明所采用的方法既能夠在所用組織中分離低表達(dá)的mRNA又能夠分離高表達(dá)的mRNA。
基于75％或更大核酸同一性，發(fā)現(xiàn)兩個細(xì)胞色素p450組群與之前(發(fā)現(xiàn))的遺傳上與這兩個組群不同的煙草細(xì)胞色素基因具有核酸序列同一性。第23組在表I所用的指數(shù)范圍內(nèi)，顯示出與之前分別由Czernic等和Ralston等提交的GenBank序列GI1171579(CAA64635)和GI14423327(或AAK62346)具有核酸同一性。GI1171579與第23組成員的核酸同一性為96.9％-99.5％，而GI14423327與第23組成員的核酸同一性為95.4％-96.9％。第31組的成員與Ralston等提交的GenBank序列GI14423319(AAK62342)有76.7％-97.8％的核酸同一性。表1中沒有其它p450同一性組群在表1所用的參數(shù)范圍內(nèi)與Ralston等、Czernic等、Wang等或LaRosa和Smigocki報道的煙草p450基因具有同一性。
如圖76所示，對于各組，可衍生合適的核酸變性探針的共有序列，以優(yōu)先從煙草植物中鑒定和分離各組的其它成員。
表I煙草p450核酸序列同一性組群組群 片段1 D58-BG7(SEQ ID No.1)，D58-AB1(SEQ ID No.3)；D58-BE4(SEQ IDNo.7)2 D56-AH7(SEQ ID No.9)；D13a-5(SEQ ID No.11)3 D56-AG10(SEQ ID No.13)；D35-33(SEQ ID No.15)；D34-62(SEQ IDNo.17)4 D56-AA7(SEQ ID No.19)；D56-AE1(SEQ ID No.21)；185-BD3(SEQ ID No.143)5 D35-BB7(SEQ ID No.23)；D177-BA7(SEQ ID No.25)；D56A-AB6(SEQ ID No.27)；D144-AE2(SEQ ID No.29)6 D56-AG11(SEQ ID No.31)；D179-AA1(SEQ ID No.33)7 D56-AC7(SEQ ID No.35)；D144-AD1(SEQ ID No.37)8 D144-AB5(SEQ ID No.39)9 D181-AB5(SEQ ID No.41)；D73-Ac9(SEQ ID No.43)10 D56-AC12(SEQ ID No.45)11 D58-AB9(SEQ ID No.47)；D56-AG9(SEQ ID No.49)；D56-AG6(SEQID No.51)；D35-BG11(SEQ ID No.53)；D35-42(SEQ ID No.55)；D35-BA3(SEQ ID No.57)；D34-57(SEQ ID No.59)；D34-52(SEQ IDNo.61)；D34-25(SEQ ID No.63)12 D56-AD10(SEQ ID No.65)13 56-AA11(SEQ ID No.67)14 D177-BD5(SEQ ID No.69)；D177-BD7(SEQ ID No.83)15 D56A-AG10(SEQ ID No.71)；D58-BC5(SEQ ID No.73)；D58-AD12(SEQ ID No.75)16 D56-AC11(SEQ ID No.77)；D35-39(SEQ ID No.79)；D58-BH4(SEQID No.81)；D56-AD6(SEQ ID No.87)17 D73A-AD6(SEQ ID No.89)；D70A-BA11(SEQ ID No.91)18 D70A-AB5(SEQ ID No.95)；D70A-AA8(SEQ ID No.97)19 D70A-AB8(SEQ ID No.99)；D70A-BH2(SEQ ID No.101)；D70A-AA4(SEQ ID No.103)20 D70A-BA1(SEQ ID No.105)；D70A-BA9(SEQ ID No.107)21 D70A-BD4(SEQ ID No.109)22 D181-AC5(SEQ ID No.111)；D144-AH1(SEQ ID No.113)；D34-65(SEQ ID No.115)
23 D35-BG2(SEQ ID No.117)24 D73A-AH7(SEQ ID No.119)25 D58-AA1(SEQ ID No.121)；D185-BC1(SEQ ID No.133)；D185-BG2(SEQ ID No.135)26 D73-AE10(SEQ ID No.123)27 D56-AC12(SEQ ID No.125)28 D177-BF7(SEQ ID No.127)；D185-BE1(SEQ ID No.137)；D185-BD2(SEQ ID No.139)29 D73A-AG3(SEQ ID No.129)30 D70A-AA12(SEQ ID No.131)；D176-BF2(SEQ ID No.85)31 D176-BC3(SEQ ID No.145)32 D176-BB3(SEQ ID No.147)33 D186-AH4(SEQ ID No.5)實施例10分離的核酸片段的相關(guān)氨基酸序列同一性推測實施例8中獲得的細(xì)胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。被推測的區(qū)域?qū)?yīng)于緊跟在GXRXCP(A/G)序列基序之后的氨基酸到羧基末端，或終止子。在比較片段的序列同一性時，氨基酸同一性為70％或更大的那些序列觀察到唯一的分組(unique grouping)。氨基酸同一性為80％或更大的那些序列觀察到優(yōu)選的分組，更優(yōu)選為90％氨基酸同一性或更大，最優(yōu)選的分組是氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。組群和組群成員的相應(yīng)氨基酸序列示于圖2。發(fā)現(xiàn)這些唯一的(unique)氨基酸序列中的幾個與其它序列具有完全的序列同一性，因此只報道了具有相同氨基酸的一個成員。
根據(jù)它們的核苷酸序列，表II第19組的氨基酸同一性對應(yīng)于3個不同的組群。各組成員的氨基酸序列和它們的同一性示于圖77。相應(yīng)標(biāo)示了氨基酸差異。
選擇了各氨基酸同一性組群中的至少一個成員用植物進行基因克隆和功能性研究。此外，經(jīng)Northern和Southern分析評定為受乙烯處理的影響不同或具有其它生物學(xué)差異的組群成員也被選擇作基因克隆和功能研究。為有助于基因克隆，將基于序列同一性和差異序列進行表達(dá)研究和完整植物評價以及肽特異性抗體的制備。
表II煙草p450氨基酸序列同一性分組組群片段1 D58-BG7(SEQ ID No.2)，D58-AB1(SEQ ID No.4)2 D58-BE4(SEQ ID No.8)3 D56-AH7(SEQ ID No.10)；D13a-5(SEQ ID No.12)4 D56-AG10(SEQ ID No.14)；D34-62(SEQ ID No.18)5 D56-AA7(SEQ ID No.20)；D56-AE1(SEQ ID No.22)；185-BD3(SEQID No.144)6 D35-BB7(SEQ ID No.24)；D177-BA7(SEQ ID No.26)；D56A-AB6(SEQ ID No.28)；D144-AE2(SEQ ID No.30)7 D56-AG11(SEQ ID No.32)；D179-AA1(SEQ ID No.34)8 D56-AC7(SEQ ID No.36)；D144-AD1(SEQ ID No.38)9 D144-AB5(SEQ ID No.40)10 D181-AB5(SEQ ID No.42)；D73-Ac9(SEQ ID No.44)11 D56-AC12(SEQ ID No.46)12 D58-AB9(SEQ ID No.48)；D56-AG9(SEQ ID No.50)；D56-AG6(SEQ ID No.52)；D35-BG11(SEQ ID No.54)；D35-42(SEQ ID No.56)；D35-BA3(SEQ ID No.58)；D34-57(SEQ ID No.60)；D34-52(SEQ ID No.62)13 D56AD10(SEQ ID No.66)14 56-AA11(SEQ ID No.68)15 D177-BD5(SEQ ID No.70)；D177-BD7(SEQ ID No.84)16 D56A-AG10(SEQ ID No.72)；D58-BC5(SEQ ID No.74)；D58-AD12(SEQ ID No.76)
17 D56-AC11(SEQ ID No.78)；D56-AD6(SEQ ID No.88)18 D73A-AD6(SEQ ID No.90)19 D70A-AB5(SEQ ID No.96)；D70A-AB8(SEQ ID No.100)；D70A-BH2(SEQ ID No.102)；D70A-AA4(SEQ ID No.104)；D70A-BA1(SEQ ID No.106)；D70A-BA9(SEQ ID No.108)20 D70A-BD4(SEQ ID No.110)21 D181-AC5(SEQ ID No.112)；D144-AH1(SEQ ID No.114)；D34-65(SEQ ID No.116)22 D35-BG2(SEQ ID No.118)23 D73A-AH7(SEQ ID No.120)24 D58-AA1(SEQ ID No.122)；D185-BC1(SEQ ID No.134)；D185-BG2(SEQ ID No.136)25 D73-AE10(SEQ ID No.124)26 D56-AC12(SEQ ID No.126)27 D177-BF7(SEQ ID No.128)；185-BD2(SEQ ID No.140)28 D73A-AG3(SEQ ID No.130)29 D70A-AA12(SEQ ID No.132)；D176-BF2(SEQ ID No.86)30 D176-BC3(SEQ ID No.146)31 D176-BB3(SEQ ID No.148)32 D186-AH4(SEQ ID No.6)實施例11全長克隆的相關(guān)氨基酸序列同一性推測實施例5中克隆的煙草全長基因核酸序列的完整氨基酸序列。通過3個保守p450結(jié)構(gòu)域基序的存在來鑒定細(xì)胞色素p450基因，所述3個保守p450結(jié)構(gòu)域基序?qū)?yīng)于羧基末端的UXXRXXZ、PXRFXF或GXRXC，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是P、T、S或M。還注意到這些克隆中的兩個，D130-AA1和D101-BA2幾乎是完整的但缺少合適的終止子，然而它們都含有上述的3個p450細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域。用BLAST程序鑒定所有p450具有的氨基酸同一性，把它們的全長序列彼此比較并且和已知的煙草基因比較。該程序使用了NCBI特定的BLAST工具(兩序列比對(Aligntwo sequences，b12seq)，http//www.ncbi.nlm.nih.oov/blast/b12sea7b12.html)。在沒有過濾器的情況下用BLASTN比對兩個核酸序列，用BLASTP比對氨基酸序列?；谒鼈兊陌被嵬恍园俜直?，將各序列分到同一性組群中，其中各組群中包括的成員與另一個成員至少具有85％同一性。氨基酸同一性為90％或更大的那些序列觀察到優(yōu)選的分組，更優(yōu)選的分組具有95％氨基酸同一性或更大，最優(yōu)選的分組具有氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。采用這些標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出25個不同的組群，示于表III。
在表III用于氨基酸同一性的參數(shù)范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)3個組群與已知煙草基因具有大于85％或更大的同一性。第5組的成員與先前Ralston等提交的GenBank序列GI14423327(或AAK62346)具有高達(dá)96％的全長序列氨基酸同一性。第23組與Ralston等提交的GI14423328(或AAK62347)有高達(dá)93％的氨基酸同一性。第24組與Ralston等提交的GI14423318(或AAK62343)有92％的氨基酸同一性。
表III煙草全長p450基因的氨基酸序列同一性組群1 D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No.180)；D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)；D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)；D-235-ABI(SEQ.ID.No.246)2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)；D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE24 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)；D205-AH4(SEQ.ID.No.294)5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)；D147-AD3(SEQ.ID.No.194)6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF10
8 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No.220)；D135-AE1(SEQ.ID.No.190)9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11(SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)；D96-AB6(SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)；D207-AB4(SEQ.ID.No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID.No.214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No.154)14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No.241)，D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No.248)；D125-AF11(SEQ.ID.No.228)17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)根據(jù)靠近羧基末端的UXXRXXZ p450結(jié)構(gòu)域和GXRXC p450結(jié)構(gòu)域之間高度保守的氨基酸同源性進一步將這些全長基因分組。如圖3所示，比對各克隆保守結(jié)構(gòu)域彼此之間的序列同源性，并將這些克隆分到不同的同源性組群中。在幾種情況下，雖然某克隆的核酸序列是不同的，但該區(qū)域的氨基酸序列是相同的。氨基酸同一性為90％或更大的那些序列觀察到優(yōu)選的分組，更優(yōu)選的分組具有95％氨基酸同一性或更大，最優(yōu)選的分組具有氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。最終的分組類似于根據(jù)這些克隆的完整氨基酸序列的同一性百分比而做的分組，第17組除外(表III)，它被分為2個不同的組。
在表IV用于氨基酸同一性的參數(shù)范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)3個組群與已知煙草基因具有90％或更大的同一性。第5組的成員與先前Ralston等提交的GenBank序列GI14423326(或AAK62346)具有高達(dá)93.4％的全長序列氨基酸同一性。第23組與Ralston等提交的GI14423328(或AAK62347)有高達(dá)91.8％的氨基酸同一性。第24組與Ralston等提交的GI14423318(或AAK62342)有98.8％的同一性。
表IV煙草p450基因保守結(jié)構(gòu)域之間區(qū)域的氨基酸序列同一性組群11 D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No.180)；D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)；D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)；D-235-ABI(SEQ.ID.No.246)2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)；D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE24 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)；D205-AH4(SEQ.ID.No.294)5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)；D147-AD3(SEQ.ID.No.194)6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF108 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No.220)；D135-AE1(SEQ.ID.No.190)
9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11(SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)；D96-AB6(SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)；D207-AB4(SEQ.ID.No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID.No.214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No.154)14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No.241)，D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No.248)；D125-AF11(SEQ.ID.No.228)17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)26 D110-AF12(SEQ.ID.No.176)實施例12缺少一個或多個煙草細(xì)胞色素p450特異性結(jié)構(gòu)域的煙草細(xì)胞色素p450克隆4個克隆與表III報道的其它煙草細(xì)胞色素基因具有高度的核酸同源性，核酸同源性介于90％至99％之間。這4個克隆包括D136-AD5、D138-AD12、D243-AB3和D250-AC11。然而，因為核苷酸移碼框的原因，這些基因不含有細(xì)胞色素p450C-末端的3個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個，因此排除在表III和IV所示的同一性組群之外。
有一個克隆，D95-AG1的氨基酸同一性不含有第3個結(jié)構(gòu)域GXRXC，該結(jié)構(gòu)域用來對表III或表IV中的p450煙草基因分組。該克隆的核酸同源性與其它煙草細(xì)胞色素基因的同源性低。該克隆代表了煙草中細(xì)胞色素p450基因的一個新的、不同的組群。
實施例13煙草細(xì)胞色素p450片段和克隆在改變煙草性質(zhì)調(diào)控方面的應(yīng)用煙草p450核酸片段或整個基因可用于鑒定和選擇煙草表型或組成有所改變的植株，更重要的是，可用于鑒定和選擇代謝物發(fā)生了變化的植株。用例如以反義方向(用于下調(diào))或有義方向(用于上調(diào))將摻入選自本文所述的核酸片段或全長基因的多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草植物。對于全長基因的過量表達(dá)，編碼本文所述全長基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的任何核酸序列都是理想的，它們可有效增加某個酶的表達(dá)并因此在煙草中產(chǎn)生表型效果。通過一系列的回交獲得純合煙草品系，并評價其表型變化，包括但不限于，用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可獲得的常用技術(shù)來分析內(nèi)源性p450RNA、轉(zhuǎn)錄物、p450表達(dá)的肽和植物代謝物的濃度。
煙草植物中表現(xiàn)出來的變化提供了感興趣的所選基因的功能性作用的信息，或者可用作優(yōu)選的煙草植物品種。
實施例14鑒定乙烯處理的轉(zhuǎn)化株品系中誘導(dǎo)的基因采用高密度寡核苷酸陣列技術(shù)，Affymetrix基因芯片(GeneChip)(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA)陣列來進行基因表達(dá)的定量和高度平行性檢測。在使用該技術(shù)時，通過在固體表面上直接合成寡核苷酸來制作核酸陣列。這種固相化學(xué)能夠產(chǎn)生含有數(shù)十萬個寡核苷酸探針的陣列，這些寡核苷酸探針以極高的密度壓縮在芯片上，這種芯片稱為GeneChip?？捎梢粋€雜交同時篩選幾千個基因。每個基因通常由一組的11-25對探針來代表，這取決于基因的大小。設(shè)計探針以使其具有最大的敏感性、特異性和可重復(fù)性，從而使其總是可以分辨出特異性和背景信號以及密切相關(guān)的靶序列。
Affymetrix基因芯片雜交試驗包括下列步驟設(shè)計和制備陣列，從分離自生物樣品的RNA中制備熒光標(biāo)記的靶，標(biāo)記的靶與基因芯片雜交，篩選芯片，分析掃描的圖像，產(chǎn)生基因表達(dá)譜。
A.Affymetrix基因芯片的設(shè)計和定制定制Affymetrix Inc.(Santa Clara，CA)生產(chǎn)的GeneChip CustomExpressAdvantage Array。芯片的大小是18微米，芯片的格式是100-2187，可容納528組探針(11,628個探針)。除了來自GenBank的核酸序列之外，所有序列都選自我們之前鑒定出的煙草克隆，所有探針都是定制設(shè)計的。共選擇了400個煙草基因或片段包括在基因芯片中。所選擇的寡核苷酸的序列是基于基因3’末端的獨特區(qū)域。所選擇的核酸序列由如(本專利申請)所述從煙草中克隆的56個全長p450基因和71個p450片段組成。其它煙草序列包括270個煙草EST，用Clontech SSH試劑盒(BD Biosciences，PaloAlto，CA)從抑制差減文庫產(chǎn)生了這些EST。在這些基因中，一些寡核苷酸序列選自GenBank所列的細(xì)胞色素p450基因。多達(dá)25個探針用于每個全長基因，11個探針用于每個片段。因為缺乏獨特的、高質(zhì)量的探針，有些克隆所用的探針數(shù)目要少。GeneChip中也包括了合適的對照序列。
探針陣列是25聚寡核苷酸，用基于半導(dǎo)體的光刻蝕法結(jié)合固相化學(xué)合成技術(shù)將這些寡核苷酸直接合成到玻璃片上。各陣列含有多達(dá)100,000個不同的寡核苷酸探針。因為寡核苷酸探針合成在陣列中已知的位置上，所以可用Affymetrix Microarray Suite軟件將雜交模式和信號強度解釋為基因同一性和相對表達(dá)水平。各探針對由一個完全配對的寡核苷酸和一個錯配的寡核苷酸組成。完全配對的探針具有與特定基因準(zhǔn)確互補的序列，因此可檢測該基因的表達(dá)。錯配探針在其堿基的中心位置有一個堿基置換，因此區(qū)別于完全配對的探針，所述的一個堿基置換干擾了靶基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。錯配產(chǎn)生非特異性的雜交信號或背景信號，將該信號與完全配對的寡核苷酸檢測到的信號比較。
B.樣品制備雜交試驗由Genome Explorations，Inc.(Memphis，TN)進行，雜交中所用的RNA樣品由6對受乙烯誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)化株/轉(zhuǎn)化株等基因系組成。
這些樣品包括1對4407-25/4407-33未處理的白肋煙草樣品，3對乙烯處理的4407-25/4407-33樣品，1對乙烯處理的深色煙草NL Madole/181和1對乙烯處理的白肋變種PBLB01/178。乙烯處理如實施例1所述。
用改良的酸酚和氯仿方法從上述乙烯處理和未處理的葉片中提取總RNA。改良的方法是用1克組織進行研磨，隨后在5毫升加入了5毫升苯酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.5；200mMNaCl；10mM EDTA；0.5％SDS)中渦旋。將提取的樣品離心，保留上清。該提取步驟再重復(fù)2-3次直到上清變得澄清。加入約5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。加入3倍體積的ETOH和1/10體積的3M NaOAc(pH5.2)以從混合的上清組分中沉淀RNA，在-20℃存貯1小時。轉(zhuǎn)移到Corex玻璃容器中以后，在4℃9,000RPM離心RNA組分45分鐘。離心下來的團塊用70％乙醇洗滌，4℃9,000RPM離心5分鐘。團塊干燥以后，將RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。分別用變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質(zhì)量和數(shù)量。3-5μg/μl的總RNA樣品送至Genome explorations，inc.進行雜交試驗。
C.雜交、檢測和數(shù)據(jù)輸出如下所述制備標(biāo)記的RNA材料。按生產(chǎn)商的方法用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒(Gibco Life Technologies)和寡-dT24-T7(5′-GGC CAGTGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGG CGG-3′)引物從5-15μg總RNA中合成第一鏈和第二鏈cDNA。
T7啟動子連接的雙鏈cDNA作為模板，用T7RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(ENZO Diagnostics Inc.)通過體外轉(zhuǎn)錄同時合成并用生物素化的UTP和CTP來標(biāo)記cRNA。簡言之，用70％乙醇洗滌前述步驟中合成的雙鏈cDNA，重新懸浮在22μl不含RNA酶的水中。cDNA與下列物質(zhì)一起37℃溫育5小時10X的反應(yīng)緩沖液、生物素標(biāo)記的核糖核苷酸、DTT、RNA酶抑制劑混合物各4μl，以及2μl 20×T7 RNA多聚酶。經(jīng)過CHROMA SPIN-100柱(Clontech)并在-20℃沉淀1小時至過夜，將標(biāo)記上的RNA與未摻入的核糖核苷酸分離。
如下所述進行寡核苷酸陣列雜交和分析。將RNA團塊重新懸浮在10μl不含RNA酶的水中，10.0μg在200mM Tris-乙酸，pH8.1，500mMKOAc，150mM MgOAc中95℃下用熱和離子介導(dǎo)的水解片段化35分鐘。片段化的cRNA與HG U95Av2寡核苷酸陣列(Affymetrix)45℃雜交16小時，該寡核苷酸陣列上含有約12,500個經(jīng)注釋的全長基因以及設(shè)計用于代表EST序列的其它探針組。用6×SSPE(0.9M NaCl，60mM NaH2PO4，6mMEDTA+0.01％ Tween 20)25℃下洗滌陣列，然后50℃下用100mM MES、0.1M[Na+]、0.01％ Tween 20進行嚴(yán)格條件下的洗滌。以藻紅素(phycoerythrein)偶聯(lián)的鏈霉親和素(Molecular Probes)對陣列染色，用激光共聚焦掃描儀(Hewlett-Packard)來測定熒光強度。用Microarray軟件(Affymetrix)分析掃描的圖像。對于所用的所有陣列，通過將某陣列上所有基因的平均熒光強度校正(scaling)到恒定的目標(biāo)強度(250)來使上樣和染色中的差異標(biāo)準(zhǔn)化。按用戶指南用Microarray Suite 5.0(Affymetrix)進行數(shù)據(jù)分析。各基因的信號強度計算為平均強度差異，以[∑(PM-MM)/(探針對的數(shù)目)]代表，其中PM和MM標(biāo)示完全配對和錯配的探針。
D.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果Genome Explorations的檢測儀器產(chǎn)生的表達(dá)報告證實，12組雜交是成功的。該報告上主要的參數(shù)包括噪音、校正因子、背景、總探針組、存在和不存在的探針組的數(shù)目和百分比、管家基因?qū)φ盏男盘枏姸?。然后，用GCOS結(jié)合其它Microsoft的軟件來分析和表示數(shù)據(jù)。分析了處理的各對之間的信號對比。經(jīng)過不同處理的基因和片段所對應(yīng)的各探針的總體數(shù)據(jù)被編譯，分析編譯的表達(dá)數(shù)據(jù)，如變化呼叫(call of the changes)和信號LOG2比例變化。
基因芯片技術(shù)的一個常規(guī)用途是發(fā)現(xiàn)在不同組織中有差異性表達(dá)的基因。在本發(fā)明中，通過成對的轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株煙草品系，包括4407-25/4407-33白肋變種、PBLB0l/178白肋變種和NL Madole/181深色煙草變種，測定了乙烯處理引起的遺傳表達(dá)變化。這些分析只檢測由于生物學(xué)變化而使其表達(dá)發(fā)生了顯著改變的那些基因。這些分析采用了倍數(shù)(Fold)變化(信號比率)作為鑒定受誘導(dǎo)基因的重要標(biāo)準(zhǔn)。還考慮了其它參數(shù)，如信號密度、存在/不存在呼叫。
在分析了轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株樣品對中約400個基因表達(dá)差異的數(shù)據(jù)之后，基于信號強度的結(jié)果說明，與非轉(zhuǎn)化株品系相比，只有兩個基因D121-AA8和D120-AH4在轉(zhuǎn)化株品系中可重復(fù)地被乙烯處理所誘導(dǎo)。如下所述表示這些數(shù)據(jù)，以說明這些基因的差異性表達(dá)。如表V所示，在轉(zhuǎn)化株品系，例如白肋煙草變種4407-33中，某基因的信號測定為與相關(guān)的非轉(zhuǎn)化株等基因品系4407-25的比率。在沒有乙烯誘導(dǎo)時，對于所有基因，轉(zhuǎn)化株與非轉(zhuǎn)化株信號的比率都接近于1.00。用3種獨立的分析方法對等基因白肋品系的分析證明，受乙烯誘導(dǎo)時，相對于非轉(zhuǎn)化株品系，兩個基因D121-AA8和D120-AH4在轉(zhuǎn)化株品系中受到誘導(dǎo)。這些基因是彼此高度同源的，約有99.8％或更大的核酸序列同源性。如表V所示，它們在轉(zhuǎn)化株品系中的相對雜交信號約比相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化株品系中高2-12倍。相比較的，根據(jù)兩個肌動蛋白樣對照克隆(內(nèi)部對照)標(biāo)準(zhǔn)化的比例，沒有發(fā)現(xiàn)它們在轉(zhuǎn)化株品系中受誘導(dǎo)。此外，片段D35-BG11(其編碼區(qū)的序列完全包含在D121-AA8和D120-AH4基因中)在成對的等基因轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系的相同樣品中被高水平誘導(dǎo)。白肋煙草變種的另一個等基因?qū)?，PBLB01和178被顯示具有相同的基因D121-AA8和D120-AH4，乙烯處理時在轉(zhuǎn)化株中受誘導(dǎo)。此外，D121-AA8和D120-AH4基因優(yōu)先在等基因深色煙草對NL Madole和181的轉(zhuǎn)化株品系中受誘導(dǎo)，證明這些基因在轉(zhuǎn)化株品系中的乙烯誘導(dǎo)不限于白肋煙草變種。在所有情況下，相對于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化株品系，D35-BG11片段在轉(zhuǎn)化株品系中都是受誘導(dǎo)最高的一個。
表V乙烯處理的轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系中克隆誘導(dǎo)的比較

實施例15克隆相關(guān)的D35-BG11全長基因基因芯片雜交基于3′反轉(zhuǎn)錄(cRNA)。選自基因3′端(在下游1000個核苷酸的區(qū)域中)的探針在基因芯片上合成。因此，為了獲得D121-AA8和D120-AH4克隆的所有可能的變化形式，用5′序列從煙草cDNA文庫中進行了另外的克隆。
全長基因克隆自如實施例5所述從乙烯處理的4407-33組織中構(gòu)建的cDNA文庫。采用如下所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。基于D121-AA8基因的3′序列(包括非翻譯區(qū)部分)設(shè)計反向引物。D121-P2引物5′-AGC AAG ATGATC TTA GGT TTTAA-3′和D121-R-2引物5′-CAA GCA AGA TGA TCTTAG GTT TTA ATA AAG CTC AGGT-3′。T3引物(5′CAA TTA ACC CTCACTAAA GGG 3′)位于質(zhì)粒上插入片段的上游，用作正向引物。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，切下高分子量的相應(yīng)條帶，純化、克隆并測序。用于克隆和測序的方法如實施例4所述。測序和鑒定了9個新的克隆，它們是D425-AB10、D425-AB11、D425-AC9、D425-AC10、D425-AC11、D425-AG11、D425-AH7、D425-AH11和D427-AA5。觀察到這些克隆中的每一個都與克隆D121-AA8和D120-AH4具有99％或更大的核酸序列同一性。
實施例16煙草轉(zhuǎn)化株品系中微粒體煙堿去甲基酶的乙烯誘導(dǎo)如下所述，對乙烯處理和非處理的成對的轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株中富含微粒體的組分中去甲基酶的酶活進行生化分析。
A.微粒體的制備在4℃分離微粒體。在由50mM N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)，pH7.5，3mM DL-二硫蘇糖醇(DTT)和蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche)(1片/50毫升)組成的緩沖液中提取煙草葉片。粗提物通過4層粗棉布(cheesecloth)過濾以除去未打碎的組織，濾出液20,000xg離心20分鐘以除去細(xì)胞碎片。將上清以100,000xg超離心60分鐘，得到的上清即含有微粒體。將微粒體組分懸浮在提取緩沖液中，進行超離心步驟，其中提取緩沖液中采用0.5M的不連續(xù)蔗糖梯度。將純化的微粒體重新懸浮在添加了10％(w/v)甘油作為低溫保護劑的提取緩沖液中。將此微粒體制品存貯在液氮冷藏罐中直到使用。
B.蛋白濃度測定用溶解在丙酮中的10％三氯乙酸(TCA)(w/v)沉淀微粒體蛋白，用RCDC蛋白檢測試劑盒(BIO-RAD)按生產(chǎn)商的方法測定微粒體的蛋白濃度。
3.煙堿去甲基酶活性試驗DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)獲得自Moravek Biochemicals，比活為54mCi/mmol。氯丙嗪(CPZ)和氧化的細(xì)胞色素(Cyt.C)(二者均為P450抑制劑)購自Sigma。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH)是細(xì)胞色素P450的典型電子供體，它通過NADPH細(xì)胞色素P450還原酶供應(yīng)電子。在對照組的溫育中去掉了NADPH。常規(guī)的酶活試驗由微粒體蛋白(約2mg/ml)、6mM NADPH、55μM14C標(biāo)記的煙堿組成。CPZ和Cyt.C的使用濃度分別是1mM和100μM。反應(yīng)在25℃進行1小時，加入300μl甲醇到各25μl反應(yīng)混合物中終止反應(yīng)。離心后，用Inertsil ODS-33p(150×4.6mm)柱(Varian)以反相高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(Agilent)分離20μl的甲醇提取物。等梯度(isocratic)流動相是甲醇、50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.25)的混合物，其中二者的比例為60∶40(v/v)，流速為1毫升/分鐘。通過與真正的未標(biāo)記的降煙堿的峰進行比較，收集降煙堿的峰，用2900tri-carbLiquid Scintillation Counter(LSC)(Perkin Elmer)進行定量。基于1小時溫育中產(chǎn)生的14C標(biāo)記的降煙堿來計算煙堿去甲基酶的活性。
從乙烯處理和未處理的成對的白肋轉(zhuǎn)化株(4407-33品系)和非轉(zhuǎn)化株(4407-25品系)煙草品系獲得樣品。所有未處理的樣品都沒有任何可檢測到的微粒體煙堿去甲基酶活性。相反，發(fā)現(xiàn)從乙烯處理的轉(zhuǎn)化株品系獲得的微粒體樣品中含有大量的煙堿去甲基酶活性。已顯示，煙堿去甲基酶受P450特異性抑制劑的抑制，證明該去甲基酶活性與P450微粒體來源的酶一致。
表VI顯示了從白肋轉(zhuǎn)化株煙草品系中獲得的一組典型的酶活結(jié)果。相反的是，從乙烯處理的非轉(zhuǎn)化株煙草中獲得的樣品不含有任何煙堿去甲基酶活性。這些結(jié)果證明，在轉(zhuǎn)化株品系中煙堿去甲基酶受乙烯處理的誘導(dǎo)，但在相應(yīng)的等基因非轉(zhuǎn)化株品系中不受誘導(dǎo)。對于成對的等基因深色煙草品系獲得了類似的結(jié)果，其中在轉(zhuǎn)化株品系中微粒體煙堿去甲基酶活性被誘導(dǎo)，但在相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化株品系中未檢測到該酶被誘導(dǎo)。這些結(jié)果都證明了，微粒體煙堿去甲基酶在轉(zhuǎn)化株品系中受乙烯處理的誘導(dǎo)，但在相應(yīng)的等基因非轉(zhuǎn)化株品系中不受誘導(dǎo)。那些衍生自P450基因并且優(yōu)先在轉(zhuǎn)化株品系(相對于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化株品系)中被誘導(dǎo)的基因是編碼煙堿去甲基酶的候選基因。
表VI乙烯誘導(dǎo)的白肋轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株品系中的去甲基酶活性

考慮到本發(fā)明前面的詳細(xì)描述，預(yù)期在本發(fā)明的實施中本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行很多改進和變化。因此，這些改進和變化都包括在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的煙草核酸分子，該核酸分子含有選自SEQ.ID.No.299-357的核酸序列。
2.一種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物含有如權(quán)利要求1所述的核酸分子。
3.如權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述植物是煙草植物。
4.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括以下步驟(i)將如權(quán)利要求1所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體；(ii)用步驟的所述植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述植物；(iii)選擇用所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和(iv)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達(dá)為雙鏈RNA分子。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述雙鏈RNA分子長度為約15-25個核苷酸。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物是煙草植物。
11.一種選擇含有核酸分子的植物的方法，其中分析所述植物中是否存在選自299-357的核酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述選擇植物的方法，其特征在于，通過DNA雜交分析所述植物。
13.如權(quán)利要求11所述選擇植物的方法，其特征在于，所述DNA雜交是Southern印跡分析。
14.如權(quán)利要求11所述選擇植物的方法，其特征在于，所述DNA雜交是Northern印跡分析。
15.如權(quán)利要求11所述選擇植物的方法，其特征在于，通過PCR檢測分析所述植物。
16.如權(quán)利要求11所述選擇植物的方法，其特征在于，所述植物是煙草植物。
17.一種增加或降低植物中降煙堿水平的方法，所述方法包括以下步驟(i)將如權(quán)利要求1所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體；(ii)用步驟(i)所述植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述植物；(iii)選擇用所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和(iv)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達(dá)為雙鏈RNA分子。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物是煙草植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及p450酶和在煙草中編碼p450酶的核酸序列，以及使用這些酶和序列來改變植物表型的方法。
文檔編號C12N9/02GK1867674SQ200480030385
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者D·徐 申請人:美國無煙煙草公司