專利名稱：一種快速紅細(xì)胞凍存和解凍方法及其使用的冰凍保護(hù)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)用試劑紅細(xì)胞的長(zhǎng)期保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)均是將紅細(xì)胞先懸浮在高滲透壓凍存保護(hù)液中，其中主要有效成分是甘油或葡萄糖。
例如Meryman液57％甘油，3％乳酸鈉，0.2％Na2HPO4，0.03％KCl。
Huggins液79％甘油，8％葡萄糖，1％果糖，0.3％EDTA-2Na。
Krijnen液35％甘油，2.9％山梨醇，0.63％NaCl。
Valeri液35％甘油，2.88％甘露醇，0.65％NaCl。
其工作原理是讓高滲透壓甘油滲入紅細(xì)胞內(nèi)部，置換出其中的水份，從而減少在凍存過(guò)程中紅細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，保護(hù)紅細(xì)胞不被破壞。在紅細(xì)胞解凍的過(guò)程中，由于紅細(xì)胞內(nèi)部的高滲狀態(tài)，必須通過(guò)逐步降低紅細(xì)胞解凍液滲透壓的方法，將紅細(xì)胞內(nèi)部的甘油或葡萄糖重新置換出來(lái)，以防止紅細(xì)胞內(nèi)部滲透壓相對(duì)過(guò)高而造成的紅細(xì)胞漲破。整個(gè)過(guò)程需要2-3小時(shí)左右。紅細(xì)胞的回收率大約在70％-85％。如果將冰凍紅細(xì)胞直接置于等滲的溶液中解凍，則紅細(xì)胞將基本完全溶血。
這種將紅細(xì)胞先懸浮在高滲透壓凍存保護(hù)液中再重新置換的方法，其主要缺點(diǎn)是過(guò)程比較復(fù)雜，且耗時(shí)。
例如Meryman液保存方法在1單位紅細(xì)胞(約50ml)中加入160ml甘油保護(hù)劑，20分鐘加完，室溫放置30分鐘后，直接放入-80℃冰箱。解凍時(shí)先在37-40℃快速融化，離心去除甘油，10分鐘內(nèi)緩慢加入9％高滲NaCl溶液80ml，靜置3分鐘后加入300ml羥乙基淀粉，混勻后，離心10分鐘去上清，再加入150ml羥乙基淀粉和100ml生理鹽水，1500g離心10分鐘。去上清，加200ml生理鹽水，1500g離心10分鐘。去上清。冰凍和溶解洗滌總耗時(shí)約3.5小時(shí)。紅細(xì)胞回收率約85％。
Huggins液保存方法冷凍方法同上。解凍方法使用和紅細(xì)胞等體積(50ml左右)的50％葡萄糖溶液和1000ml5％果糖，離心10分鐘。去上清，再加入5％果糖500ml，混勻后離心10分鐘。去上清。同樣方法再洗滌1-2次，至上清液中無(wú)明顯溶血。耗時(shí)和回收率大體同上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的長(zhǎng)期冰凍保存紅細(xì)胞的方法，該方法解決了現(xiàn)有試劑紅細(xì)胞凍存技術(shù)繁瑣、耗時(shí)等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的之二是提供一種與上述冰凍保存紅細(xì)胞的方法相適應(yīng)的紅細(xì)胞解凍方法。
同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述方法所使用的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液和解凍液。
本發(fā)明利用等滲的保存液，加入高濃度大分子膠體介質(zhì)，配置成紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液。該冰凍保護(hù)液懸浮紅細(xì)胞時(shí)，不會(huì)使紅細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)高滲狀態(tài)。在隨后的解凍過(guò)程中，利用和凍存保護(hù)液類似的溶液快速融化紅細(xì)胞，然后通過(guò)生理鹽水洗滌去除大分子膠體物質(zhì)，即可以得到紅細(xì)胞鹽水懸液，用于相關(guān)試驗(yàn)，整個(gè)凍融過(guò)程大約15分鐘。紅細(xì)胞的得率可達(dá)到80％以上。
本發(fā)明具體的技術(shù)方案是一種紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液，由基本等滲的溶液和具有生物相容性的大分子物質(zhì)組成，其中基本等滲的溶液滲透壓在250-400mOsm/L，大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000之間，濃度為15-40％。
上述基本等滲的溶液可以是市售的各種試劑紅細(xì)胞保存液，也可以根據(jù)試劑紅細(xì)胞保存液的配方自行配置，滲透壓要求在250-400mOsm/L(毫滲)范圍內(nèi)(血漿的滲透壓約為313mOsm/L，約相當(dāng)于7個(gè)大氣壓或5330毫米汞柱)。例如下述的檸檬酸緩沖液檸檬酸0.8％、氯化鈉0.4％、葡萄糖1.8％。
上述的大分子物質(zhì)包括聚乙烯基吡咯烷酮40T(PVP)、右旋糖苷或白蛋白等，要求分子量在20000-400000之間。
一種快速紅細(xì)胞凍存方法，首先將新鮮紅細(xì)胞洗滌壓積，然后取上述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液配成體積濃度為50％或以下的紅細(xì)胞懸液，混勻后用滴管滴入液氮中。然后可在液氮或-80℃保存。
上述快速凍存紅細(xì)胞的解凍方法，在液氮中取出冰凍紅細(xì)胞小球，立即放入上述的解凍液中，待紅細(xì)胞完全融化后加入解凍液1倍或以上體積量的生理鹽水離心洗滌紅細(xì)胞，去除離心上清液后，將壓積紅細(xì)胞直接配制成紅細(xì)胞鹽水懸液即可。
本發(fā)明和現(xiàn)有方法的最大區(qū)別在于冰凍保護(hù)液的成份。冰凍保護(hù)液即紅細(xì)胞在冰凍時(shí)所處的液體，其作用在于保護(hù)懸浮于其中的紅細(xì)胞不受冰凍過(guò)程的傷害。本發(fā)明的冰凍保護(hù)液中沒(méi)有使用高濃度的甘油、葡萄糖等藥品，因此不會(huì)在紅細(xì)胞內(nèi)部或/和外部造成高滲透壓的環(huán)境。本發(fā)明所用的冰凍保護(hù)液含有基本等滲的檸檬酸緩沖液加大分子物質(zhì)。
本發(fā)明的第二個(gè)特點(diǎn)在于解凍方法。在解凍過(guò)程中，直接將冰凍紅細(xì)胞置于解凍液(成份同冰凍保護(hù)液，20-50℃)中，待紅細(xì)胞完全解凍，加入倍量或更多的鹽水離心洗滌紅細(xì)胞，去除離心上清液后，將壓積紅細(xì)胞直接配制成紅細(xì)胞鹽水懸液即完成解凍過(guò)程。
試劑紅細(xì)胞屬于珍稀資源，在輸血領(lǐng)域有著十分重要的作用。免疫血液學(xué)試驗(yàn)的水平高低，在很大程度上依賴試劑紅細(xì)胞品種的多少和質(zhì)量的高低。但由于保存和溶解方法復(fù)雜，耗時(shí)，使得臨床發(fā)現(xiàn)的許多珍稀紅細(xì)胞資源難以得到有效的保存和充分的利用。本發(fā)明使得稀有試劑紅細(xì)胞資源的保存和應(yīng)用變得十分方便，快捷。因此將有效的提高稀有紅細(xì)胞資源的利用率，節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，進(jìn)而間接提高免疫血液學(xué)試驗(yàn)的水平，對(duì)輸血的有效性和安全性的提高以及血液免疫學(xué)研究提供有力的支持。


圖1是不同濃度右旋糖苷凍融液和對(duì)照凍融保護(hù)液的效果比較圖具體實(shí)施方式
以下試驗(yàn)比較了不同濃度的右旋糖苷和檸檬酸緩沖液以及經(jīng)典冰凍保護(hù)液之間的比較。方法均為快速液氮凍存和快速解凍法，將新鮮紅細(xì)胞洗滌壓積后，各取0.5ml用不同冰凍保護(hù)液配成50％紅細(xì)胞懸液，混勻后滴入液氮中，放置2分鐘左右，取出冰凍紅細(xì)胞小球，立即放入相應(yīng)解凍液中，用吸管吹打混勻，待紅細(xì)胞完全融化，第一次離心，取上清液待測(cè)；去盡上清液后加入生理鹽水，混勻，室溫放置1小時(shí)，第二次離心，取上清液待測(cè)。去盡第二次離心上清液，在剩余壓積細(xì)胞中加鹽水至1ml，使用COULTER血細(xì)胞分析儀計(jì)算剩余回收紅細(xì)胞占原始紅細(xì)胞的百分比。第一次和第二次離心上清液用多功能分光光度計(jì)檢測(cè)540nm光吸收值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線將上清液中的血紅蛋白量換算成紅細(xì)胞濃度。
實(shí)施例1～6所用的冰凍保護(hù)液/解凍液為檸檬酸緩沖液檸檬酸0.8％、氯化鈉0.4％、葡萄糖1.8％；再加入右旋糖苷(40T)。各實(shí)施例中紅細(xì)胞保存液中分別加入10％、15％、20％、25％、30％、40％的右旋糖苷(40T)。
對(duì)比例“經(jīng)典方法對(duì)照”使用Valeri液，配方見(jiàn)前文。
結(jié)果見(jiàn)下圖，“解凍后溶血％”即第一次離心上清液中血紅蛋白換算成紅細(xì)胞后，占初始紅細(xì)胞的百分比，“鹽水懸浮1小時(shí)后溶血％”即第二次離心上清液中血紅蛋白換算成紅細(xì)胞后，占初始紅細(xì)胞的百分比?？梢?jiàn)，當(dāng)右旋糖苷濃度在15％-40％時(shí)其凍融紅細(xì)胞的效果均好于對(duì)照。紅細(xì)胞的最高回收率可達(dá)80％左右，而同樣操作條件下，檸檬酸緩沖液和經(jīng)典冰凍保護(hù)液的紅細(xì)胞回收率僅為45％-65％。因此本方法在快速凍融條件下，效果明顯好于現(xiàn)用方法。
權(quán)利要求
1.一種紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液，由基本等滲的溶液和具有生物相容性的大分子物質(zhì)組成，其中基本等滲的溶液滲透壓在250-400mOsm/L，大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000之間，濃度為15-40％。
2.如權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液，其特征在于基本等滲的溶液是下述的檸檬酸緩沖液檸檬酸0.8％、氯化鈉0.4％、葡萄糖1.8％。
3.如權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液，其特征在于所說(shuō)的大分子物質(zhì)為聚乙烯基吡咯烷酮、右旋糖苷或白蛋白。
4.一種快速紅細(xì)胞凍存方法，該方法是首先將新鮮紅細(xì)胞洗滌壓積，然后取權(quán)利要求1～3所述的任一紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液配成體積比為50％或以下的紅細(xì)胞懸液，混勻后滴入-80℃以下的環(huán)境中保存。
5.一種快速凍存紅細(xì)胞的解凍方法，該方法是取出冰凍紅細(xì)胞，立即放入權(quán)利要求1～3所述的任一紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液中，待紅細(xì)胞完全融化后加入解凍液1倍或以上體積量的生理鹽水離心洗滌紅細(xì)胞，去除離心上清液后，將壓積紅細(xì)胞直接配制成紅細(xì)胞鹽水懸液即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)用試劑紅細(xì)胞的長(zhǎng)期保存技術(shù)。本發(fā)明所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液/解凍液，由基本等滲的溶液和具有生物相容性的大分子物質(zhì)組成，其中基本等滲的溶液滲透壓在250－400mOsm/L，大分子物質(zhì)的分子量在20000－400000之間，濃度為15－40％。本發(fā)明利用等滲的保存液，加入高濃度大分子膠體介質(zhì)，配置成紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液不會(huì)使紅細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)高滲狀態(tài)。在隨后的解凍過(guò)程中，利用和凍存保護(hù)液類似的溶液快速融化紅細(xì)胞，然后通過(guò)生理鹽水洗滌去除大分子物質(zhì)，即可以得到紅細(xì)胞鹽水懸液。用于相關(guān)試驗(yàn)，整個(gè)凍融過(guò)程大約15分鐘，紅細(xì)胞的得率可達(dá)到80％以上。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1935989SQ20061011721
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日
發(fā)明者向東 申請(qǐng)人:上海市血液中心