淋巴細(xì)胞的凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于外周血或臍帶血分離的淋巴細(xì)胞的凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞，廣泛存在于人外周血液、骨髓或人臍帶血中。高純度的淋巴細(xì)胞的獲取對(duì)于疾病的細(xì)胞學(xué)診斷、成分輸血、治療用細(xì)胞產(chǎn)品的制備等具有非常重要的意義。在臨床應(yīng)用過(guò)程中，常見(jiàn)的問(wèn)題是很難保證提供足夠數(shù)量的淋巴細(xì)胞。針對(duì)該問(wèn)題目前常用的做法是，利用低溫凍存技術(shù)保存外周血或臍帶血個(gè)細(xì)胞，在需要時(shí)復(fù)蘇并誘導(dǎo)培養(yǎng)為各種免疫細(xì)胞。但凍存過(guò)程會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時(shí)伴隨生物性損傷的危險(xiǎn)。
[0003]為了將凍存過(guò)程中細(xì)胞的損傷降至最低，使細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)存活率最高，最佳的冷凍條件是盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成，減少細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的低溫?fù)p傷。因此需要采取緩慢冷凍、加入冷凍保護(hù)劑排除水分、在盡可能低的溫度下保存細(xì)胞、快速?gòu)?fù)蘇等方法來(lái)達(dá)到對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生最低損傷的目的，其中冷凍保護(hù)劑的作用十分重要。常用的冷凍保護(hù)劑主要有甘油、二甲基亞砜(DMSO)等滲透性試劑，以及羥乙基淀粉(HES)、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非滲透性試劑，目前常用的是DMSO。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率通常在70%_90%之間。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率可能會(huì)受到細(xì)胞采集、分離、凍存等過(guò)程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細(xì)胞，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率仍需進(jìn)一步提高，同時(shí)也應(yīng)避免回輸給患者時(shí)出現(xiàn)惡心、嘔吐或過(guò)敏等不良反應(yīng)，提尚安全性。
[0005]因此，有必要提供一種能夠有效提高細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的凍存方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠有效提高細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的淋巴細(xì)胞的凍存方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下:
[0008]—方面，提供一種淋巴細(xì)胞的凍存方法，包括如下步驟:
[0009]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0010]2)將抗凝劑處理過(guò)的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后平鋪在所述分離液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞；
[0011]3)配制凍存液:將12%DMS0+10%右旋糖酐+18%所述上層血漿+1 %海藻糖+59%注射用生理鹽水混合作為凍存液；
[0012]4)將所述淋巴細(xì)胞與所述凍存液按0.9?1.1:1的比例混勻，分裝于細(xì)胞凍存管中；
[0013]5)將所述細(xì)胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉(zhuǎn)入液氮中凍存。
[0014]本發(fā)明中涉及的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料不確定性小，安全性高；本發(fā)明使用的分離液包含海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨，海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于紅細(xì)胞的沉淀;利用本發(fā)明的分離液對(duì)血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層;本發(fā)明使用的分離液凍存方法首先從分離單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始，并將上層血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應(yīng)，使用DMS0、海藻糖降低低溫對(duì)細(xì)胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進(jìn)一步減少外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害，提尚安全性。
[0015]進(jìn)一步地，所述淋巴細(xì)胞與所述凍存液的按1:1的比例混勻。
[0016]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐2?4重量份，海藻糖5?7重量份，超低粘度海藻酸鈉0.5?I重量份，泛影葡胺3?5重量份，聚二烯丙基二甲基氣化錢0.04?0.1重量份，L-繳氛酸0.008-0.01重量份和L-殼氛酸0.009-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過(guò)0.22μπι濾膜過(guò)濾制得分離液。
[0017]本發(fā)明分離液中的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過(guò)一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用；超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于紅細(xì)胞的沉淀;L-纈氨酸、L-亮氨酸在保持淋巴細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上對(duì)提高分離淋巴細(xì)胞分離率也具有一定的幫助;本發(fā)明的分離液對(duì)于獲得高純度的淋巴細(xì)胞具有重要意義;本發(fā)明配方中的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料不確定性小，安全性高。
[0018]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐2.5?3.5重量份，海藻糖5.5?6.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.6?0.9重量份，泛影葡胺3.5?4.5重量份，聚二稀丙基二甲基氯化錢0.06?0.09重量份，L-繳氨酸0.008-0.01重量份和L-殼氨酸0.009-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過(guò)0.22μπι濾膜過(guò)濾制得分離液。
[0019]優(yōu)選地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3重量份，海藻糖6重量份，超低粘度海藻酸鈉0.8重量份，泛影葡胺4重量份，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.08重量份，L-纈氨酸0.009重量份和L-亮氨酸0.011重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過(guò)0.22μπι濾膜過(guò)濾制得分離液。
[0020]進(jìn)一步地，所述右旋糖酐為Dextran70。
[0021]進(jìn)一步地，所述分離液的密度為1.070?1.09(^/0113，滲透壓為275?300811101/1^，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0022]綜上所述，本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
[0023]本發(fā)明中涉及的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料不確定性小，安全性高；本發(fā)明使用的分離液包含海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨，海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于紅細(xì)胞的沉淀;利用本發(fā)明的分離液對(duì)血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層;本發(fā)明使用的分離液凍存方法首先從分離單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始，并將上層血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應(yīng)，使用DMS0、海藻糖降低低溫對(duì)細(xì)胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進(jìn)一步減少外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害，提高安全性。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明的實(shí)施例要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。但本發(fā)明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發(fā)明較好的實(shí)施例，僅僅用以解釋本發(fā)明，并不能因此而理解為本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
[0025]實(shí)施例一
[0026]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0027]2)將抗凝劑處理過(guò)的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后平鋪在分離液上，在8-25°C，200g-800g，10?30min條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞；
[0028]3)配制凍存液:將12 % DMS0+10%右旋糖酐+18 %上層血漿+1 %海藻糖+59 %注射用生理鹽水混合作為凍存液；
[0029]4)將淋巴細(xì)胞與凍存液按0.9?1.1:1的比例混勻，分裝于細(xì)胞凍存管中；
[0030]5)將細(xì)胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉(zhuǎn)入液氮中凍存。
[0031]其中，分離液的制備方法為:在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐4g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸鈉0.5g，泛影葡胺5g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1g，L-纈氨酸0.0lg和L-亮氨酸0.009g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過(guò)0.22μπι濾膜過(guò)濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0032]實(shí)施例二
[0033]I)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨的分離液加入到離心管中；
[0034]2)將抗凝劑處理過(guò)的外周血或臍帶血中加入等體積的生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后平鋪在分離液上，在8-25°C，200g-800g，10