專利名稱：蝦青素含量高的綠藻及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蝦青素的高效生產(chǎn)。更具體而言，涉及蝦青素含量高的綠藻及其制造方法。
背景技術(shù)：
已知蝦青素是紅色類胡蘿卜素之一種，具有很強的抗氧化作用。因此用作食物、化妝品、保健食品和醫(yī)藥品中的色素。蝦青素除了化學合成，還可來自天然產(chǎn)物。來自天然產(chǎn)物的蝦青素從蝲蛄蝦(euphausiids)、南極磷蝦(Pandalus borealis)等蝦類(Eucarida)、法夫(Phaffia)酵母和藻類等中提取而來。但是在蝲蛄蝦等蝦類和酵母中蝦青素的含量很低，不能有效地抽提蝦青素。
另一方面，藻類適應(yīng)外界環(huán)境改變而形成胞囊并在藻體內(nèi)集聚蝦青素。為此對以藻類生產(chǎn)蝦青素進行了研究。非專利文獻1中，報道了2步培養(yǎng)方法，即將紅球藻(Haematococcus)的營養(yǎng)細胞以每天10～40％的量置換培養(yǎng)液進行培養(yǎng)(流加式培養(yǎng))，再在光照條件下批式培養(yǎng)15天。專利文獻1中報道了在培養(yǎng)末期改變培養(yǎng)基成分中碳元素和氮元素的比率培養(yǎng)紅球藻生成蝦青素的方法。專利文獻2報道了用添加了金屬鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球藻生成蝦青素的方法，但該文獻沒有記載藻體中蝦青素的含量。
專利文獻3以干的藻體中蝦青素含量的實例，記載了其數(shù)值為0.3～10wt％，但在限制氮源、以40000勒克斯(lx)光照的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的實例中，達到大約2％的水平，并未得到蝦青素濃度達到或超過10wt％的藻體。而專利文獻4報道在室外培養(yǎng)池中培養(yǎng)的紅球藻中蝦青素含量可達按藻體計的4.5wt％。
另外，在每個藻體內(nèi)蝦青素含量的研究方面，例如在專利文獻5和非專利文獻2中，報道了在30℃、有鐵離子和乙酸存在的條件下，產(chǎn)生約600pg/細胞的蝦青素。而在專利文獻6中，報道有可能將蝦青素含量提高到700pg/細胞或以上。但實際上并未得到含有如此高濃度蝦青素的藻類，即使在專利文獻6實施例中記載的最高值也不過156pg/細胞。
專利文獻7中，公開報道了將含有葉黃素的微藻，例如形成胞囊的微藻接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中使營養(yǎng)細胞生長生長，并進一步使其形成胞囊，高效制造葉黃素的方法。在該專利文獻7的實施例中，干燥藻體中葉黃素(蝦青素)的最高含量是3.5wt％。
為了高效制造蝦青素，希望得到含有更高濃度蝦青素的藻類。
專利文獻1特表平2-501189號公報專利文獻2特開平1-187082號公報專利文獻3特開平3-83577號公報專利文獻4特開2000-60532號公報專利文獻5特開平7-39389號公報專利文獻6特開2004-129504號公報專利文獻7國際公開第2005/116238號單行本非專利文獻1Fabregas等、J.Biotech.，89，p.65-71，(2001)非專利文獻2Tjahjono等、BIOTECHNOLOGY LETTERS，vol.16，p133-138，(1994)發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種在細胞內(nèi)蝦青素濃度高的藻類。
本發(fā)明提供一種制造綠藻的方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻的工藝。
本發(fā)明還提供含有700pg/細胞或以上蝦青素的綠藻。
本發(fā)明還提供含有按藻體濕重計蝦青素濃度在1.2wt％或以上的綠藻。
本發(fā)明還提供綠藻干制品的制造方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻的工藝，以及將獲得的綠藻干燥。
本發(fā)明還進一步提供含有蝦青素濃度在5wt％或以上的綠藻干制品。
本發(fā)明還進一步提供為每1L培養(yǎng)液中含有的蝦青素濃度為150mg或以上的綠藻培養(yǎng)液制備方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻。
本發(fā)明還提供每1L培養(yǎng)懸浮液中含有的蝦青素濃度為150mg或以上的綠藻培養(yǎng)懸浮液。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻；干燥得到的綠藻；和從得到的綠藻干制品提取蝦青素。
在一個實施方案中，在上述方法中營養(yǎng)培養(yǎng)基為自養(yǎng)培養(yǎng)基。
在一個實施方案中，上述方法中的光合成有效光量子束投入量是750000μmol-光子/m3/s以下。
在一個實施方案中，綠藻是屬于紅球藻屬(Haematococcus)的單細胞藻類，優(yōu)選雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)。
根據(jù)本發(fā)明，提供蝦青素含量為700pg/細胞或以上的綠藻。因為綠藻每細胞的蝦青素含量稿，通過使用這種綠藻，蝦青素的生產(chǎn)效率比以前大大提高。
附圖簡述

圖1表示每個細胞蝦青素含量隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化的坐標圖。
圖2表示每個細胞蝦青素生成速率隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化的坐標圖。
圖3表示按干藻體計蝦青素含量隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化的坐標圖。
圖4表示培養(yǎng)懸浮液中蝦青素濃度隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化的坐標圖。
圖5表示每單位體積培養(yǎng)懸浮液中蝦青素生成速率隨時間發(fā)生變化的坐標圖。
圖6表示培養(yǎng)懸浮液中固形物的干重隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化的坐標圖。
發(fā)明詳述通過本發(fā)明，可以提供每個細胞含有蝦青素700pg/細胞或以上，優(yōu)選1000pg/細胞或以上的綠藻。該綠藻可在光照培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)胞囊生成而獲得。優(yōu)選是將已成胞囊的綠藻接種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在通氣泡條件下，于強光照射的條件中培養(yǎng)來獲取。采用這種培養(yǎng)方法，可以得到按干重計蝦青素濃度在5wt％(50mg/g干燥藻體)或以上，優(yōu)選6wt％(60mg/g干燥藻體)或以上的綠藻干制品。甚至培養(yǎng)液蝦青素濃度達到150mg/L或以上，優(yōu)選為200/L或以上，優(yōu)選為250mg/L或以上。
以下就蝦青素含量為700pg/細胞或以上的綠藻、蝦青素含量5wt％(50mg/g干燥藻體)或以上的綠藻以及含有的蝦青素濃度達到150mg/L的綠藻培養(yǎng)懸浮液加以說明。
本發(fā)明的方法，其特征是將含有蝦青素的綠藻，優(yōu)選是形成胞囊的綠藻接種到生長生長培養(yǎng)基中使之生長生長，再在光照下使其形成胞囊。將含有蝦青素的綠藻，優(yōu)選是大量積聚蝦青素的的形成胞囊的綠藻接種到生長生長培養(yǎng)基中使之生長生長時，形成胞囊的綠藻釋放出含有蝦青素的游動孢子。該游動孢子成為含有蝦青素的營養(yǎng)細胞。如此，通過使這種生長含有蝦青素的綠藻(營養(yǎng)細胞)再形成胞囊，新的蝦青素便在綠藻中產(chǎn)生和積聚。因此，通過本發(fā)明的方法形成胞囊的綠藻中，除本來存在于綠藻內(nèi)的蝦青素外，還含有新產(chǎn)生的蝦青素，因而提高了蝦青素的含量。
綠藻在本發(fā)明中采用的綠藻，只要是有產(chǎn)生蝦青素能力的綠藻即可，無特別限制。例如可以優(yōu)選采用屬于紅球藻屬(Haematococcus)的單細胞藻類。可用的綠藻的例子，有雨生紅球藻(H.pluvialis)、湖生紅球藻(H.lacustris)、紅球藻(H.capensis)、紅球藻(H.droebakensi)和津巴布韋紅球藻(H.zimbabwiensis)等。
雨生紅球藻(H.pluvialis)的藻株包括保藏在獨立行政法人國立環(huán)境研究所的NIES144株、保藏在美國德克薩斯大學藻類保藏機構(gòu)的UTEX2505株、保藏在丹麥哥本哈根大學植物學研究所斯堪的納維亞藻類和原生動物保藏中心(Scandinavian Culture Center for Algae andProtozoa，Botanical Institute)的K0084株等。
湖生紅球藻(H.lacustris)藻株有保藏在ATCC的ATCC30402株和30453株、保藏在東京大學應(yīng)用微生物學研究所的IAMC-392、IAMC-393、IAMC-394株和IAMC-339株、或UTEX16株及IAM294株等。
紅球藻(H.capensis)有UTEX LB1023株。
紅球藻(H.droebakensi)有UTEX55株。
津巴布韋紅球藻(H.zimbabwiensis)有UTEX LB1758株等。
其中雨生紅球藻最適采用。
(胞囊形成)本發(fā)明中，采用含有蝦青素的上述綠藻。綠藻在受到來自環(huán)境的營養(yǎng)不足、存在氧化物等脅迫因子作用時，便積聚蝦青素，形成休眠孢子。進入休眠狀態(tài)即稱為胞囊形成。本說明書中，胞囊形成指從進入休眠狀態(tài)開始積聚蝦青素的狀態(tài)到完全形成胞囊成為休眠孢子的全部狀態(tài)。為提高蝦青素含量起見，應(yīng)采用盡可能多形成胞囊，大量積聚蝦青素的綠藻。同時，此處使用的所謂[培養(yǎng)形成了胞囊的綠藻]，也包含在綠藻達到胞囊狀態(tài)后，接種已經(jīng)在營養(yǎng)培養(yǎng)基生長了的含有蝦青素的綠藻。
(培養(yǎng)基)培養(yǎng)綠藻所用的培養(yǎng)基并無特別限制。一般使用含有為生長生長必需的氮源、微量金屬的無機鹽(例如磷、鉀、鎂、鐵等)、維生素類(例如硫胺素等)等的培養(yǎng)基。例如VT培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MBM培養(yǎng)基、MDM培養(yǎng)基等(這些培養(yǎng)基可參見《藻類研究法》，干原光雄、西澤一俊編，共立出版(1979))、OHM培養(yǎng)基(參見非專利文獻1)BG-11培養(yǎng)基及將它們加以改變的培養(yǎng)基。本發(fā)明中，為防止雜菌混入，優(yōu)選采用實際上不合有機碳源的自養(yǎng)培養(yǎng)基。
可以根據(jù)這些培養(yǎng)基的使用目的來選擇生長培養(yǎng)基，所述目的例如生長或形成胞囊。例如為生長生長綠藻，采用含氮源成分多的培養(yǎng)基(富營養(yǎng)培養(yǎng)基含氮源0.15g/L以上的培養(yǎng)基)。為形成胞囊，則采用含氮源成分少的培養(yǎng)基(胞囊形成培養(yǎng)基含氮源0.02g/L以下的培養(yǎng)基)。任選也采用氮源濃度處于上述兩種培養(yǎng)基氮源濃度之間的培養(yǎng)基(低營養(yǎng)培養(yǎng)基含氮源0.02g/L以上，0.15g/L以下)。
培養(yǎng)基中的氮源濃度，磷濃度和培養(yǎng)基的其他性質(zhì)最好根據(jù)待接種綠藻的量來確定。例如，當開始培養(yǎng)時綠藻濃度為105的程度，如果采用低營養(yǎng)培養(yǎng)基，則綠藻只有一定程度的生長生長，因為氮源不足，生長生長很快停止。在這種情況下，低營養(yǎng)培養(yǎng)基適合于連續(xù)進行以單步驟(批式)生長和胞囊形成。此外，將N/P比(摩爾比)調(diào)整到10～30，優(yōu)選為15～25，可以誘導(dǎo)胞囊形成。
當用于接種的綠藻濃度更高時，可以采用富營養(yǎng)培養(yǎng)基進行上述培養(yǎng)。
可以根據(jù)各種條件來確定這些培養(yǎng)基的成分。而優(yōu)選適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基，即自養(yǎng)培養(yǎng)基，由于幾乎不含有乙酸或葡萄糖等有機碳源，即使培養(yǎng)時間很長，也幾乎沒有雜菌混入。
(培養(yǎng)裝置)綠藻的培養(yǎng)裝置沒有特別限制，只要能供給二氧化碳并能光照培養(yǎng)懸浮液即可。例如在小型培養(yǎng)試驗中，可以優(yōu)選使用扁平培養(yǎng)瓶。大規(guī)模培養(yǎng)時，可以用玻璃或塑料等透明板材構(gòu)成的培養(yǎng)罐，必要時其裝備了照明設(shè)備和攪拌機培養(yǎng)罐。這類培養(yǎng)罐的例子是平板型培養(yǎng)罐，管型培養(yǎng)罐，充氣型(airdome)培養(yǎng)罐或中空圓筒型培養(yǎng)罐等等。任何情況下優(yōu)選是密閉的容器。
(培養(yǎng)條件)培養(yǎng)條件沒有特別限制，采用一般培養(yǎng)綠藻的溫度和pH等。綠藻的培養(yǎng)可在例如15～35℃，優(yōu)選20～25℃下進行。整個培養(yǎng)過程中的pH保持6～8即可。二氧化碳以0.2～2vvm的速率通入含有1～3v/v％二氧化碳的氣體來供應(yīng)。在采用平板培養(yǎng)罐罐時，通過供給二氧化碳而攪拌培養(yǎng)液，使得綠藻收到均勻的光照。
(光照)本發(fā)明中，對綠藻的培養(yǎng)物施以光照，使得光合成有效光量子通量輸入為25000μmol-光子/m3/s(此單位以下簡化為μmol-p/m3/s)水平的。為增加蝦青素生成量起見，可以用30000μmol-p/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入，更優(yōu)選40000μmol-p/m3/s或以上。此外，由于強光會抑制光合成而停止細胞的生長生長，所以光合成有效光量子束投入量應(yīng)在750000μmol-p/m3/s以下。從開始培養(yǎng)到形成胞囊為止的培養(yǎng)全過程中都以這樣的光合成有效光量子通量輸入進行光照，蝦青素的產(chǎn)量將增加非常多。
光合成有效光量子通量輸入通過先測定光合成有效光量子通量密度(PPFD)來求出。在培養(yǎng)裝置的幾個部位安裝平面光量子傳感器-LI-190(LICOR公司，Lincoln，美國)，測定光照的各部位的PPFD，將測定值平均，即可求出PPFD。有多個光源時的PPFD，則將每個光源所接受的PPFD加以合計。在用玻璃或丙烯酸樹脂等透明板材構(gòu)成的裝置中，通過透明板測定PPFD，然后測定根據(jù)獲得測定的PPFD所需的光源強度或光源的距離，配置光源。采用兩塊透明平板構(gòu)成的培養(yǎng)罐罐，從培養(yǎng)罐兩側(cè)照射光時，則其數(shù)值為兩側(cè)的PPFD值相加。
光合成有效光量子通量輸入根據(jù)以下公式求出
(培養(yǎng)方法)適當選擇上述培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)條件等并加以組合，在光照條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法有兩種。一種是在同一培養(yǎng)基中使形成胞囊的綠藻連續(xù)生長生長和形成胞囊，這是一步培養(yǎng)法；另一種是二步培養(yǎng)法，使形成胞囊的綠藻生長生長的培養(yǎng)基和是生長的綠藻形成胞囊的培養(yǎng)基是不同的培養(yǎng)基，并且分別進行生長生長和形成胞囊。
(一步培養(yǎng)法)一步法是從接種形成胞囊的綠藻到營養(yǎng)培養(yǎng)基中開始到培養(yǎng)結(jié)束，不更換培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)形成胞囊的綠藻的的方法。即，用預(yù)定的培養(yǎng)基在同一培養(yǎng)罐罐中進行綠藻的生長生長和胞囊形成。采用這種一步培養(yǎng)法，綠藻一旦生長生長，在以下的至少一種脅迫下即轉(zhuǎn)而形成胞囊狀態(tài)消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分而受到營養(yǎng)缺少的脅迫，受到光照的脅迫生長。用這種一步法得到的形成胞囊的綠藻，可以用于以后的一步培養(yǎng)或用于接種到下述的二步法培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。
接種含有蝦青素的綠藻，優(yōu)選是形成胞囊的綠藻到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，綠藻釋放出2n(n＝1～4)個含有蝦青素的游動孢子。這些游動孢子變成仍含有蝦青素的營養(yǎng)細胞，所以增加了含蝦青素的營養(yǎng)細胞數(shù)目(換言之即綠藻生長可以生長)。通過將含有蝦青素的營養(yǎng)細胞形成胞囊，即在綠藻中原有包含的蝦青素的基礎(chǔ)上積聚了新的蝦青素，因而顯著提高了細胞內(nèi)蝦青素的含量。
據(jù)信如果連續(xù)使營養(yǎng)細胞生長生長，營養(yǎng)細胞內(nèi)的蝦青素濃度最終將會降低，因此生長應(yīng)在細胞內(nèi)保留著蝦青素的點停止生長。
為了在營養(yǎng)細胞生長生長到某種程度時的點停止綠藻生長，優(yōu)選把培養(yǎng)基設(shè)計為營養(yǎng)不足的狀態(tài)。為此，在一步法中，優(yōu)選含氮源濃度較低的培養(yǎng)基，例如上述低營養(yǎng)培養(yǎng)基。在大量接種形成胞囊的細胞時，則，應(yīng)采用高氮源培養(yǎng)基，例如上述高營養(yǎng)培養(yǎng)基。
此外，當綠藻在低營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長不充分時，也可以追加高營養(yǎng)培養(yǎng)基或低營養(yǎng)培養(yǎng)基，使綠藻生長生長到所需濃度。
再者，采用低營養(yǎng)培養(yǎng)基時，將N/P比(摩爾比)調(diào)整到10～30，更合適為15～25，可以使生長生長后順利形成胞囊。
采用一步法，優(yōu)點是工藝管理簡便，由于不必轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)罐，可防止雜菌污染，而且只用一個培養(yǎng)罐，不僅如此，還可以簡便地得到含有高濃度蝦青素的綠藻。
(二步培養(yǎng)法)二步培養(yǎng)法是先使形成胞囊的綠藻在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長生長，然后用形成胞囊的培養(yǎng)基代替營養(yǎng)培養(yǎng)基，使之形成胞囊的培養(yǎng)方法。換句話說，二步培養(yǎng)包含首先將會形成胞囊的綠藻接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基，最好是高營養(yǎng)培養(yǎng)基中使綠藻生長的第一步，以及收集綠藻，并轉(zhuǎn)移到幾乎不含有氮源的形成胞囊培養(yǎng)基中使之形成胞囊的第二步。
在第一步工藝中，綠藻的生長必須在蝦青素保留在營養(yǎng)細胞中的時候停止，所以在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間要短。如果培養(yǎng)開始時采用高營養(yǎng)培養(yǎng)基，營養(yǎng)細胞的生長速度要比在低營養(yǎng)培養(yǎng)基中更快，所以優(yōu)選采用高營養(yǎng)培養(yǎng)基。生長結(jié)束后收集綠藻，轉(zhuǎn)移到形成胞囊的培養(yǎng)基中，在第二步形成胞囊。
第一步和第二步，可以分別在不同的培養(yǎng)罐中進行批式培養(yǎng)。也可以在第一步結(jié)束后，將生長的綠藻洗凈回收，放回同一培養(yǎng)罐進行第二步。
采用這種二步培養(yǎng)法可以得到蝦青素含量高的綠藻細胞。這種二步培養(yǎng)法的優(yōu)點是比一步培養(yǎng)法生長工藝時間短，但中途必須經(jīng)過將生長的綠藻加以轉(zhuǎn)移的操作。
得到的形成胞囊的綠藻，一部分可以用于回收蝦青素，剩下的部分則可用于再接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
(蝦青素量的測定)通過上述培養(yǎng)，可得到每1L培養(yǎng)懸浮液含蝦青素(游離的或未酯化的形式)濃度達到150mg/L或以上，優(yōu)選150～250mg/L，更優(yōu)選為200～250mg/L的綠藻培養(yǎng)懸浮液。單位體積培養(yǎng)懸浮液中蝦青素量可通過收集預(yù)定體積的培養(yǎng)懸浮液并測定收集的培養(yǎng)懸浮頁中所含蝦青素的量來求得。
樣品(培養(yǎng)懸浮液)中蝦青素量(游離或未酯化的形式)可采用例如以下方法測定。首先，收集一定量樣品，清洗，置于干凈的玻璃珠細胞研磨專用小管中。向同一小管中加入氧化鋯珠，加入丙酮，用玻璃珠細胞研磨破碎。破碎后，將樣品離心分開上清液和沉淀，回收上清液(即，丙酮級分)。向沉淀中再加入丙酮，進行同樣操作，如此反復(fù)直至沉淀完全成白色。將回收的丙酮級分組合，用二甲亞砜(DMSO)稀釋100倍，測定492nm波長下的吸光度(A492)和750nm波長下的吸光度(A750)?；厥盏谋壏?樣品)中的蝦青素濃度用以下公式計算，根據(jù)此測定值，可求得培養(yǎng)液中蝦青素的含量。
樣品中的蝦青素濃度(μg/mL)＝4.5×100×(A492-A750)(含蝦青素的濕藻體)按上述條件進行的培養(yǎng)，可以得到含有700pg/細胞或以上，優(yōu)選800pg/細胞或以上，更優(yōu)選900pg/細胞或以上，更優(yōu)選1000pg/細胞或以上的蝦青素(游離體)的綠藻。用本發(fā)明的方法，可得到含有1100pg/細胞，或以上(例如1200pg/細胞)蝦青素的綠藻。
此處所謂濕藻體，指未從藻體中除去水分，藻體內(nèi)充滿液體的藻體。例如存在于培養(yǎng)懸浮液中的綠藻。
此外，收集預(yù)定量的綠藻，根據(jù)測定收集的綠藻細胞數(shù)量和從細胞中抽提出的蝦青素量，可以求得每個細胞中蝦青素的量。細胞數(shù)量可以用諸如測定粒徑分布的裝置(SYSMEX FPI-3000)來測定。
(含蝦青素的綠藻干制品)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的干燥手段(轉(zhuǎn)鼓干燥，熱風式干燥、噴霧干燥、或冷凍干燥)將上述含蝦青素的濕藻體進行干燥，即可得到綠藻干制品。
得到的綠藻干制品，含有蝦青素(游離或未酯化形式)的濃度在5wt％或以上。優(yōu)選為5～8wt％，更優(yōu)選為6～7wt％。而此處所指的“干制品”中所含水分為7wt％或以下，優(yōu)選為5wt％，更優(yōu)選為大約2wt％。
(蝦青素的制造方法)從得到的綠藻干燥物抽提蝦青素和收集提取的蝦青素，可以制造蝦青素。蝦青素的抽提收集方法并無特別限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法。例如將綠藻干燥物加以機械破壞后，然后從其中抽提蝦青素。抽提方法包括用氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等有機溶劑，或用食用油脂抽提的化學方法，或通過壓榨綠藻干燥物抽提的物理方法?；蛘咭部梢圆捎贸R界抽提法抽提回收。抽提后，采用濃縮、結(jié)晶、合成樹脂分部分離等方法可以純化蝦青素。
實施例以下用雨生紅球菌(H.pluvialis)K0084株為例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此實施例。
在本實施例中，蝦青素量和細胞數(shù)用上述方法測定。
綠藻干重量的測定方法如下所述。首先，采取預(yù)定體積的培養(yǎng)液，在減壓下抽濾到GC50玻璃纖維濾器(TOYO·ADVANTEC制)上，為溶解無機鹽，用5mL pH4的鹽酸水溶液洗滌兩次。然后將吸收綠藻的濾器置105℃恒溫干燥箱中干燥3小時，在真空干燥器中于室溫下冷卻1小時，測定干重。GC50玻璃纖維濾器要預(yù)先在上述恒溫干燥箱中105℃干燥1小時，并測定它的質(zhì)量。將吸附了綠藻的干燥濾紙的質(zhì)量減去預(yù)先測定的濾紙的干重，求出綠藻的干重。再根據(jù)一定量培養(yǎng)液中蝦青素量的測定值，求出相應(yīng)于每單位干重的蝦青素量。
實施例1(形成胞囊的綠藻的制備)將雨生紅球菌(H.pluvialis)K0084株接種到含有表1所述成分的培養(yǎng)基(低營養(yǎng)培養(yǎng)基)中。
表1
更具體而言，即把形成胞囊的K0084株接種到裝了1L低營養(yǎng)培養(yǎng)基的1.5L扁平培養(yǎng)瓶中。用白色熒光燈以25000μmol-光子/m3/s的光合成有效光量子通量輸入進行光照，以0.5L/分的速率通入含3vol％CO2的空氣(即通氣速率0.5vvm)，在25℃培養(yǎng)K0084株7天。7天后，收集形成胞囊的K0084株，用低營養(yǎng)培養(yǎng)基調(diào)整藻體細胞濃度為1.5×106個/ml。
(主培養(yǎng))丙烯酸透明板制培養(yǎng)罐對向排列，使其內(nèi)壁之間隔3cm的扁平培養(yǎng)罐，裝入9L低營養(yǎng)培養(yǎng)基，接種1L上述形成胞囊的K0084株，以1.5×105個/ml的濃度開始培養(yǎng)。在此扁平培養(yǎng)罐兩側(cè)各裝6支白色熒光燈，以25000μmol-光子/m3/s的光合成有效光量子通量輸入進行光照，以5L/分的速率通入含3％體積CO2的空氣(通氣速率0.5vvm)，在25℃培養(yǎng)21天。培養(yǎng)過程中定期用上述方法測定培養(yǎng)懸浮液中蝦青素含量、細胞數(shù)以及從培養(yǎng)液中取得的藻體干重。結(jié)果示于表2和圖1～6。
活細胞數(shù)在第3天為6.5×105個/ml，約4倍增長，以后即緩緩減少(圖中未表示)。按每活細胞計的蝦青素含量，如圖1所示，第14日達到600pg/細胞，第18日達到800pg/細胞以上，第19日達到900pg/細胞以上，第21日更達到1000pg/細胞。又由圖2可見，按每細胞計的蝦青素生成速率，在培養(yǎng)的第7日左右達到最高，每個細胞1天產(chǎn)生約54pg。此后每個細胞1天產(chǎn)生約45pg。
此外，如圖3所示，按每干燥藻體計的蝦青素含量，在細胞的營養(yǎng)生長在第3日即減少，此時細胞已經(jīng)植物性生長，但胞囊化開始后，其開始急劇增加，在第7日達到6wt％(60mg/g干燥藻體)。如果繼續(xù)培養(yǎng)，按每藻體計的蝦青素含量緩緩增加，到第21日達到6.8wt％(68mg/g干燥藻體)。
圖4表示培養(yǎng)液中蝦青素濃度隨培養(yǎng)時間而發(fā)生的變化。在培養(yǎng)的第7日每升培養(yǎng)液中濃度高達150mg，第10日后濃度為200mg/L，第21日濃度為250mg/L。又如圖5所示，每1ml培養(yǎng)液每日蝦青素生成速率，在培養(yǎng)的第7日左右達到最高，每培養(yǎng)液每日約為19mg。此后蝦青素的生成速率即漸漸降低。
圖6表示隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)液中固形物的質(zhì)量逐漸增加，到第13日達到高峰，以后即幾乎無變化。如果考慮到活細胞緩緩減少的情況，固形物質(zhì)量的增加，可認為是由于胞囊形成而造成細胞重量增加所引起的。
(比較例1)除了以12000μmol-光子/m3/s的光合成有效光量子通量輸入進行光照之外，用與實施例1相同條件培養(yǎng)，在第21日測定按每濕藻體計的蝦青素濃度、干燥藻體中蝦青素濃度、以及每升培養(yǎng)液中蝦青素的含量。結(jié)果表示在表2中。
(比較例2)方法，除采用按非專利文獻2所述的8000μmol-p/m3/s的光合成有效光量子通量輸入進行光照外，用與實施例1相同條件進行培養(yǎng)，在第21日測定按每濕藻體計的蝦青素濃度、干燥藻體中蝦青素濃度、以及每升培養(yǎng)液中蝦青素的含量。結(jié)果表示在表2中。
表2
*1μmol-p/m3/s
在產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用之可能性因為本發(fā)明的藻類比以往通用的藻類含有更高濃度蝦青素，從而可以大大提高蝦青素的生成效率，所述蝦青素在抗氧化劑、食品、醫(yī)藥品、化妝品等領(lǐng)域使用。因此，在有效制造蝦青素的方法中，本發(fā)明的藻類非常有用。
本發(fā)明可以以其他形式實施而不偏離本發(fā)明的精神或關(guān)鍵的特征。本發(fā)明公開的實施方案應(yīng)當在所有的方面被視為示例性的而不是限制性的。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求指明，而不是由上述說明書指明，處于與權(quán)利要求等同的含義和范圍的所有改變應(yīng)當包括在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)綠藻的方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基是自養(yǎng)培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光合成有效光量子通量輸入是750000μmol-光子/m3/s以下。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述綠藻含有的蝦青素在700pg/細胞或以上。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述綠藻所含有的蝦青素濃度按藻體濕重計在1.2wt％或以上以上。
6.一種綠藻，其蝦青素含量在700pg/細胞或以上。
7.一種綠藻，其蝦青素濃度按藻體濕重計在1.2wt％或以上。
8.權(quán)利要求6所述的綠藻，其是屬于紅球藻屬(Haematococcus)的單細胞藻類。
9.權(quán)利要求8所述的綠藻，其是雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)。
10.一種生產(chǎn)綠藻干制品的方法，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻，和干燥獲得的綠藻。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述培養(yǎng)基是自養(yǎng)培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述光合成有效光量子通量輸入是750000μmol-光子/m3/s以下。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述干制品含有的蝦青素濃度在5wt％以上。
14.綠藻干制品，其含有的蝦青素濃度在5wt％或以上。
15.權(quán)利要求14所述的綠藻干制品，其中所述綠藻是屬于紅球藻屬的單細胞藻類。
16.權(quán)利要求15所述的綠藻干制品，其中所述綠藻為雨生紅球藻。
17.一種綠藻培養(yǎng)液的制備方法，該培養(yǎng)液含有的蝦青素濃度為每1L培養(yǎng)液中含有150mg或以上，該方法包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述培養(yǎng)基為自氧培養(yǎng)基。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述光合成有效光量子通量輸入是750000μmol-光子/m3/s以下。
20.綠藻培養(yǎng)液，其包含的蝦青素濃度為每1L培養(yǎng)液中含有150mg或以上。
21.權(quán)利要求20所述的綠藻培養(yǎng)液，其中所述綠藻是屬于紅球藻屬的單細胞藻類。
22.權(quán)利要求21所述的綠藻培養(yǎng)液，其中所述綠藻為雨生紅球藻。
23.一種生產(chǎn)蝦青素的方法，包括在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol-光子/m3/s或以上的光合成有效光量子通量輸入進行光照，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞囊化的綠藻；使所獲得的綠藻干燥；和從得到的綠藻干制品中抽提蝦青素。
全文摘要
本發(fā)明公開了在供給二氧化碳的條件下，以25000μmol－光子/m
文檔編號C12P23/00GK1928066SQ20061012816
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月6日
發(fā)明者張凱 申請人:雅馬哈發(fā)動機株式會社