專(zhuān)利名稱(chēng)：具熒光素酶活性抗輻射菌的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因載體及其轉(zhuǎn)化子的制備方法，即一種具熒光素 酶活性的抗輻射菌的制備方法。
技術(shù)背景不同的生物對(duì)放射線(xiàn)的抵抗性不同，自然界中存在對(duì)放射線(xiàn)抵抗性很強(qiáng)的微生物，這類(lèi) 微生物通常稱(chēng)為放射線(xiàn)抵抗性細(xì)菌，又稱(chēng)抗輻射菌或抗輻射奇球菌等，本文以下稱(chēng)抗輻射菌。 代表性的抗輻射菌為"e&ococciAS屬，現(xiàn)在已經(jīng)鑒定的有7類(lèi)菌種(".ra力'o^/ra/w; Z .縦輝j') (Ferreira et a丄，Int. J. Syst. BacterioL, 47: 939-947, 1997)。這些細(xì)菌 對(duì)放射線(xiàn)的抵抗性約為大腸桿菌的100倍，人細(xì)胞的1000倍以上。利用基因工程的方法將外 源基因?qū)朐摷?xì)菌，能夠改變抗輻射菌的性狀，能夠從被放射性物質(zhì)污染的廢棄物中除去難 分解的物質(zhì)和有毒物質(zhì)，及利用該改造菌進(jìn)行放射性重金屬的收集等。迄今為止，將外源基因?qū)肟馆椛渚?ei/70coccz^屬，誘導(dǎo)表達(dá)異種蛋白質(zhì)的有1、表 達(dá)甲苯雙加氧酶，將難分解的甲苯變成容易分解的物質(zhì)(Lange eta丄，Nature Biotechnol.， 16:929-933, 1998)， 2、表達(dá)2價(jià)水銀離子還原酶，將2價(jià)水銀離子還原為毒性很低的揮發(fā) 性金屬水銀(Brim et al. ， Nature Biotechnol. ， 18: 85-90, 2000)。但到目前為止，將包 含外源基因的質(zhì)粒載體進(jìn)行抗輻射菌Zfej'"ococc"s _rac//w/iyra/7s以外的Zfei加cocc"s屬細(xì)菌 (如上述的Z .」ra必o/w《/73/w; A ^ra/7力's等)的轉(zhuǎn)化的研究還沒(méi)有。另外，上述重組轉(zhuǎn)化子的制作存在一些弊端使用了在""/JOCOCC"S屬細(xì)菌中不能自我復(fù)制的整合質(zhì)粒，不能控制拷貝數(shù)，表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量少，培養(yǎng)液中需要添加抗生素等。為了克服這些缺點(diǎn)，已有抗 輻射菌Zfei/ ococc"s 7"aoYooi/ra/7^大腸桿菌穿梭載體pRADl (用".Sark株由 來(lái)的質(zhì)粒pUE10的復(fù)制子和大腸桿菌載體pMTL23開(kāi)發(fā)而成)(Meima & Lidstrom, Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000 )，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)用pRADl進(jìn)行抗輻射菌 "ej'"ococcz^ raWo^ra/w以外的Ztei"ococc^屬細(xì)菌的重組轉(zhuǎn)化的研究報(bào)告；同時(shí)pRADl 在含有抗生物質(zhì)氯霉素的選擇性培養(yǎng)基中能穩(wěn)定復(fù)制，在不含氯霉素的非選擇性培養(yǎng)基中不 能穩(wěn)定存在，這個(gè)缺點(diǎn)在將導(dǎo)入外源基因的抗輻射菌釋放到野外開(kāi)放環(huán)境時(shí)特別成為問(wèn)題 在放射性物質(zhì)污染的土壤及廢水等環(huán)境中保持一定濃度的抗生物質(zhì)是非常困難的，而且野外 投放抗生物質(zhì)不但極有可能出現(xiàn)沒(méi)有必要的抗生物質(zhì)的耐性細(xì)菌，同時(shí)引起環(huán)境的二次污染; 其次，雖然作為野外開(kāi)放環(huán)境的代替，可以用大規(guī)模的封閉環(huán)境來(lái)處理污染物質(zhì)，但大量的抗生物質(zhì)使用不可避免污染環(huán)境。另外，將導(dǎo)入外源基因的抗輻射菌釋放到野外的時(shí)候，有 必要隨時(shí)監(jiān)控投放野外以后的生育、分布及對(duì)環(huán)境的影響等狀況，所以希望開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便的、 可實(shí)時(shí)監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供有關(guān)抗輻射菌itei/70cocc"s ra^'op"^3朋s ATCC19172由來(lái)的潛在 性質(zhì)粒pUE30、在抗輻射菌屬及大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)能夠復(fù)制的穿梭載體，及將這些穿梭載體導(dǎo) 入到抗輻射菌屬細(xì)菌，通過(guò)制備熒光素酶活性的轉(zhuǎn)化子，制備一種具熒光素酶活性抗輻射菌 的制備方法。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是-以抗輻射菌Zfe^ococc^raA'cp^/ a/w由來(lái)的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，與大腸桿菌中能自我復(fù)制的 質(zhì)粒進(jìn)行重組，制作穿梭載體。其次，將上述穿梭載體與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段重組，成功構(gòu)建具有熒光素酶 基因的質(zhì)粒。再將該質(zhì)粒導(dǎo)入抗輻射菌/^//7^0"^屬細(xì)菌，得到具有高熒光素酶活性的抗 輻射菌，從而成功構(gòu)建了本發(fā)明。以抗輻射菌Zfe'加coco/sj"aJio/w/卵a(bǔ)/w由來(lái)的質(zhì)粒，包含SEQ ID NO: 1所表示的堿基序 列或其誘導(dǎo)體為基礎(chǔ)，與大腸桿菌中能自我復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行重組而成的穿梭載體，以及穿梭 載體的轉(zhuǎn)化子。所述穿梭載體以及穿梭載體的轉(zhuǎn)化子與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)的寄主 DNA由來(lái)的熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段重組成具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo) 入抗輻射菌"^Vwcocc"s屬細(xì)菌，獲得的熒光素酶活性抗輻射菌。具體制備方法為以下步驟(1) 質(zhì)粒的分離精制將抗輻射菌"w'"ococciAS rarf/cp收"朋s ATCC19172用含0. 5 %胰蛋白胨、0.1 %葡萄糖、 0. 3 %酵母提取物的TGY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，離心分離收集菌體，用QIAfilter Plasmid kit提 取質(zhì)粒成分，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離精制，將2.45 kb的質(zhì)粒作為pUE30;(2) 堿基序列的測(cè)定制作pUE30的酶切圖譜，獲取HincII及Aor51HI的酶切位點(diǎn)，用HincII消化pUE30的 2. 5 kb斷片，或用Aor51HI消化2. 5 kb的斷片與大腸桿菌載體質(zhì)粒pGBM5的多克隆部位連 接制成質(zhì)粒，然后用Kilo-sequence Deletion kit制作上述質(zhì)粒的嵌套缺失的克隆，再用這些嵌套缺失的克隆作為模板，用市場(chǎng)上的通用引物，采用熒光標(biāo)記鏈終止循環(huán)測(cè)序法測(cè)定 p,的DNA序列，電泳反應(yīng)用DNA Sequencer ABI PRISM 377進(jìn)行。測(cè)定得到如SEQ ID NO: l所示堿基序列；(3) 穿梭載體的構(gòu)建以pUE30為模板，SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3所示的堿基序列(根據(jù)上述pUE30的 堿基序列自行設(shè)計(jì))合成的DNA為引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)， 得到兩端設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶Sphl部位、包含pUE30的全堿基序列的PCR產(chǎn)物，用Sphl消 化包含有大腸桿菌載體PUC19復(fù)制開(kāi)始領(lǐng)域、大腸桿菌中有活性的A即抗性基因、抗輻射菌 Z ej'/7ococcz^raWoo^朋s中有活性的氯霉素抗性基因的質(zhì)粒pKatCAT，再與上述PCR產(chǎn)物的 Sphl消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株， 從抗Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30和沐atCAT連接的質(zhì)粒的株，獲穿梭載體質(zhì)粒。(4) 以抗輻射菌Z ei/70cocc〃si-arf/octo"朋sATCC 13939的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7所示的堿基序列合成的DNA為引物，用Pfu Turbo DNA polymerase進(jìn)行 PCR反應(yīng)，增幅在抗輻射菌Z w'/ ococc"s ra^'oo^"a;w中具有活性的已知的groEL啟動(dòng)子領(lǐng) 域，然后用Ncol內(nèi)切酶消化含有熒光素酶基因的質(zhì)粒pSP-lux+,用T4 DNA polymerase進(jìn) 行DNA斷片末端的平滑化，將本步驟所述的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與平滑化的pSP-lux+連接，得到 pGroE-lux+2及pGroE-lux+4兩種質(zhì)粒；(5) 用HindIII消化上述兩種質(zhì)粒，進(jìn)行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV消化，得 到含有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA斷片插入步驟3所獲穿梭載體 質(zhì)粒的EcoRV部位，構(gòu)建具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，用構(gòu)建的熒光素酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 "wVjococcm《ra"Ws，得到具有熒光素酶基因以及氯霉素抗性的菌株。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)-本發(fā)明除能解決前述穿梭載體的各種問(wèn)題。如己有的穿梭載體pRADl不能在抗輻射菌 Ztei/7ococc"s raWoc/i/rafls以外的Zte// ococci/s屬細(xì)菌內(nèi)重組轉(zhuǎn)化，而本發(fā)明的載體能提供 在抗輻射菌/fe^ococc^屬細(xì)菌中進(jìn)行基因重組操作技術(shù)時(shí)有用的質(zhì)粒，在抗輻射菌屬及大 腸桿菌細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制；其次，PRADl在含有抗生物質(zhì)氯霉素的選擇性培養(yǎng)基中能穩(wěn)定復(fù) 制，在不含氯霉素的非選擇性培養(yǎng)基中不能穩(wěn)定存在，而本載體在沒(méi)有抗生物質(zhì)的非選擇性培養(yǎng)基條件下，能在抗輻射菌""/7MOCCM屬細(xì)菌中穩(wěn)定存在。同時(shí)，本發(fā)明的載體中插入有熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段，在抗輻射菌中具有高熒光素酶活性，可實(shí)時(shí)監(jiān)控重組 轉(zhuǎn)化子。發(fā)明的應(yīng)用前景本發(fā)明的穿梭載體在抗輻射菌屬細(xì)菌及大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)能夠自我復(fù)制，可利用于載體DNA 的基因重組及將外源基因?qū)氲娇馆椛渚鷮偌?xì)菌中。特別在抗輻射菌中進(jìn)行DNA損傷修復(fù)基 因的克隆及表達(dá)方面有非常廣泛的應(yīng)用前景。其次可利用在從包含放射性物質(zhì)污染的廢棄物 中除去難分解的物質(zhì)和有毒物質(zhì)、及進(jìn)行放性線(xiàn)重金屬的收集技術(shù)上。本發(fā)明的穿梭載體因
為在非選擇性培養(yǎng)基條件下能在寄主內(nèi)穩(wěn)定保持，所以可以使用在無(wú)論是野外開(kāi)放環(huán)境或封 閉環(huán)境的上述各種應(yīng)用領(lǐng)域。另外，本發(fā)明的穿梭載體具有熒光素酶基因，在實(shí)時(shí)監(jiān)控重組 轉(zhuǎn)化子的生育、分布及對(duì)環(huán)境的影響等方面也非常有用。


圖1是本發(fā)明的穿梭載體pZT15的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切圖。 圖2是本發(fā)明的穿梭載體pZT17的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切圖。圖3是抗輻射菌i)eZ"ocoa^ ra必o/;"g"a7w ATCC43672株中本發(fā)明的穿梭載體的穩(wěn)定性 調(diào)查結(jié)果。〇為用pZT15進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株；攀為用pZT17進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株;A為用pRADl 進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株。縱坐標(biāo)表示全細(xì)菌中具有氯霉素抗性基因的細(xì)菌的比率，橫坐標(biāo)表示繁 殖世代。圖4是本發(fā)明中包含熒光素酶基因的穿梭載體pZTGL2及pZTGL4構(gòu)建方法的略圖。 圖5是用本發(fā)明pZTGL2及pZTGL4轉(zhuǎn)化到De/"ococc^ ra&o/wg/ta/w ATCC43672株中的熒光素酶活性的測(cè)定結(jié)果。熒光素酶活性單位用106個(gè)菌中1秒的發(fā)光量RLU (RelativeLight Unit)表示。
具體實(shí)施方式
以下根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明，本發(fā)明沒(méi)有限定這些實(shí)施例。實(shí)施例h質(zhì)粒的調(diào)制(1) 質(zhì)粒的分離精制抗輻射菌Zfey"ococciAS ra力'opi/g朋/7s ATCC19172用TGY培養(yǎng)基(含0. 5 %胰蛋白胨、0.1 %葡萄糖、0.3 %酵母提取物)進(jìn)行培養(yǎng)，離心分離收集菌體。用QIAfilter Plasmid kit (德 國(guó)QIAGEN)提取質(zhì)粒成分，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離精制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了約2.45kb的質(zhì)粒。 Mackay等(Arch. Microbiol., 141:91-94, 1985)用電子顯微鏡觀察抗輻射菌Zfe '"ococc"s /"a力'o/w卵a(bǔ)/7s，報(bào)道了存在大小約2. 5 kb的質(zhì)粒pUE30。因此，這次分離精制的2. 45 kb的 質(zhì)粒作為pUE30。(2) 堿基序列的測(cè)定制作上述精制的PUE30的酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)在pUE30中各存在一個(gè)HincII及Aor51HI的酶 切位點(diǎn)。接下去將用HincII (New England Biolabs, Inc.)消化pUE30的2.5 kb的斷片， 或用Aor51HI (Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化的2. 5 kb的斷片與大腸桿菌載體質(zhì)粒pGBM5的 多克隆部位連接制作質(zhì)粒，然后用Kilo-sequence Deletion kit (Takara Shuzo公司)制作上述質(zhì)粒的嵌套缺失的克隆，再用這些嵌套缺失的克隆作為模板，用市場(chǎng)上的通用引物，采 用熒光標(biāo)記鏈終止循環(huán)測(cè)序法(BioDye Terminator cycle Sequencing kit, Applied Biosystems公司)測(cè)定pUE30的DNA序歹ij，電泳反應(yīng)用DNA Sequencer ABI PRISM 377(Applied Biosystems公司)進(jìn)行。測(cè)定得到的堿基序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。 實(shí)施例2:穿梭載體pZT15、 pZT17的構(gòu)建(1) pZT15的構(gòu)建以pUE30為模板，SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3所示的堿基序列(根據(jù)上述pUE30的 堿基序列自行設(shè)計(jì))合成的DNA為引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems)進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到兩端設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶Sphl部位、包含pUE30的全堿基 序列的PCR產(chǎn)物。接著，用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開(kāi)始領(lǐng)域、大腸桿菌中 有活性的Amp抗性基因、抗輻射菌Zfe/zjococcz/^raG^^^s/w中有活性的氯霉素抗性基因的 質(zhì)粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res. ， 435: 151-161, 1999)，再與上述PCR產(chǎn)物的Sphl 消化物混合，用DNA連接酶連接。采用電穿孔法將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。從抗 Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的質(zhì)粒(大小約為6.1 kb)的株，將該質(zhì)粒 命名為穿梭載體pZT15， pZT15的構(gòu)造如圖1。(2) pZT17的構(gòu)建以PUE30為模板，SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5所示的堿基序列合成的DNA為引物， 用與(i)同樣的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到包含部分pUE30的堿基序列(約2.3kb),同時(shí)兩 端設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶Sphl部位的PCR產(chǎn)物。接著，與(1)同樣，和質(zhì)粒pKatCAT連接， 再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。從抗Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30的一部分和pKatCAT連接的 質(zhì)粒(大小約為5.8 kb)的株，將該質(zhì)粒命名為穿梭載體pZT17， pZT17的構(gòu)造如圖2。 實(shí)施例3:本發(fā)明穿梭載體pZT15及pZT17性質(zhì)驗(yàn)證(1) 用穿梭載體進(jìn)行抗輻射菌/teJ'加coccus 5ra/7c//s ATCC43672株的重組轉(zhuǎn)化 用上述穿梭載體pZT15或pZT17重組轉(zhuǎn)化抗輻射菌Z ej'/70cocc^《ray^/s ATCC43672株，重組轉(zhuǎn)化參考Kitayama等的方法(J. BacterioL, 155: 1200-1207， 1983),采用CaCV法。 無(wú)論用pZT15還是pZT17穿梭載體，都能得到含有氯霉素抗性基因的菌株。用QIApr印 Minipr印Plasmid kit (Qiagen)從這些株中提取質(zhì)粒成分，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析， 確認(rèn)在重組轉(zhuǎn)化株中保持有導(dǎo)入的質(zhì)粒。(2) 穿梭載體在抗輻射菌Zfe^ococciAs gr朋必s的穩(wěn)定性驗(yàn)證將包含穿梭載體PZT15或pZT17的抗輻射菌/^'"ococc"s gra/^j's在含有氯霉素的TGY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 Hr，將上述培養(yǎng)液稀釋256倍后在沒(méi)有含有氯霉素的TGY培養(yǎng)基中接種， 30'C培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)8世代分裂后的培養(yǎng)液再稀釋256倍，然而再在沒(méi)有含有氯霉素的TGY培養(yǎng)
基中接種，30'C培養(yǎng)。重復(fù)上述操作直到在非選擇培養(yǎng)基中分裂40代為止。每分裂8世代后 提取一部分培養(yǎng)液，分別在沒(méi)有含有氯霉素的TGY平板培養(yǎng)基及含有氯霉素的TGY平板培養(yǎng) 基上涂抹接種，測(cè)定培養(yǎng)液中氯霉素抗性細(xì)菌占全細(xì)菌數(shù)的比率；作為對(duì)照，用Meima & Lidstrom(AppL Environ. Microbiol., 66: 3856-3867， 2000)記載的抗輻射菌Zfei"ococc〃5^ 大腸桿菌穿梭載體pRADl導(dǎo)入抗輻射菌Z e&oc0cci/s gra/^is后得到的重組轉(zhuǎn)化株中pRADl 的穩(wěn)定性。其結(jié)果，pRADl在非選擇培養(yǎng)基中不能穩(wěn)定存在，而pZT15及pZT17在非選擇培 養(yǎng)基條件下能夠在"ej'/ ococcivs《ra/ &'s中穩(wěn)定存在(圖3)。 實(shí)施例4:具有熒光素酶基因的穿梭載體的構(gòu)建及性質(zhì)測(cè)定(1) pZTGL2及pZTGL4的構(gòu)建以抗輻射菌""/70cocciAS j"aW0(A/ray7s ATCC13939的基因組DNA為模板，SEQ ID N0: 6 及SEQ ID NO: 7所示的堿基序列(根據(jù)Meima等的論文自行設(shè)計(jì)，J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001)合成的DNA為引物，用Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，增幅Meima等(J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001 )記載的在抗輻射菌 Z w'加cocc"5Lra力'o^/ra/w中具有活性的已知的groEL啟動(dòng)子領(lǐng)域(131 bp)。然而用Ncol 內(nèi)切酶消化含有熒光素酶基因的質(zhì)粒。5 -11^+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara) 進(jìn)行DNA斷片末端的平滑化。最后，將上述的PCR產(chǎn)物與平滑化的pSP-lux+連接，得到 pGroE-lux+2及pGroE-lux+4 (4235 bp)。用HindIII消化這些質(zhì)粒，進(jìn)行切斷末端的平滑化處理后，再用EcoRV進(jìn)行消化，得到 含有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因的DNA斷片。接著將這個(gè)DNA斷片插入穿梭載體pZT17的 EcoRV部位，構(gòu)建pZTGL2及pZTGL4 (7618 bp) 。 pZTGL2及pZTGL4的構(gòu)建略圖如圖4。用構(gòu) 建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化"e^ococcu5 ^^/7^'s，得到氯霉素抗性的菌株。(2) 熒光素酶活性的測(cè)定將上述得到的重組轉(zhuǎn)化子在TGY培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)，24 Hr后將培養(yǎng)液10 TL與等量的 Bright-Glo Uiciferase Assay Solution (Promega)混合，1分鐘后用Uimi Imager Fl (Roche Molecular Biochemicals)測(cè)定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性。測(cè)定結(jié)果如圖5。由測(cè)定得知，含 有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因順向連接的pZTGL2的重組轉(zhuǎn)化子發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性，而在含 有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因逆連接的pZTGL4的重組轉(zhuǎn)化子中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性。 本發(fā)明所涉及的序列表 SEQ ID NO: 1tagggcagag aaactataga aaacttattc ggtttttctt gcagaagags ttagaactag 120 tccgccgccc actatscats acagagctas ggcgtttatt agaaagttgg gggacagaat 180 ttcgtaattg 3aacttattt tactagtsat cagttctatt tttttattaa acagatttat 240 tctctcaact attataattc ctataccgaa gagtacgaag atggatgcca agagcatagt 300 cattactccc ttttgcattg tcgctccttt casatcgtat gatacagtgt tctgacgcggcaatatg333 gggsgtgscg tgctgctgtg cctgtcgctt gagg33c3gc agcaggatgs aatccatgat cggctgaccs g己cgcggaca cctgtcggac tcgtcgtctt tgcgtaaggc360 420 480 540 600 660 720 780 84Q 900 960ggctgaggcg gagcgaaacc gggctaggta ggccaaatcc tgaccgtgcc aaagccccagctaaagtgca tcttgcctct gaaactgcgt tccagagggg aaaaaaccag ggtgctgtta attttaatta ctggtcaact tttgggccgt ttttcgaggg gtcaatgcgc gagaaatggc ccaaaaaatc agcagggsgg gaggtgctgg scctgccgtt csccccsact ggcsscsccc cgctgggagg cggggtgcta aggtaattct cgaagccagt caaaagtgtc tccaaacacc 1020 gttgattgag ccatcccact ccgaaggacc acttccgatg aacastcaaa agcaggacag 1080 ctataccgat agggtacggc aaatcgcccc cgtagttcca ctcctggacc tcattgttaa 1140 gcccctcatc cctgaacgag cagcccctaa tccctatctg gagatgggcc tagccgccct 1200 gcgtggcgag ccggtggaca cccgccgcgc ccaggtgcsg cccagcaagc agttccagaa 1260 ggccsgccgc ccagccccag ccgccccccc ccttgtgctg acctcagacc 3gggcg3gg3 1320 ccaggaggcc gccatgctgc tgcccgagat cgtcgaagag acgcgccgcc gcctggagaa 1380 gcaggcccgc gagaaccgcg agacgcgccg cgccgaacag cgcgcccgct ttcaccagct 1440aggccgcgcc ggacttcgtg ccgcctgtga gccttcagga 1500 gcagtgtgcg cgtcaccttg ccccgccctg aagtccctgg 1560 gcgccgacgc ggtgcttgat tcggtgccgt ggctgagcaa 1620:cc，actg 1680actcggcggc cttccscacg ccccasctgt tgctggcctt 1740 ggcacttccg gcgactgacc aatgagctgg agcacgctgg 1800 acgccgcgaa ggtcaagscc ggcatcggca ccacccggca 1860 gggcggtcaa gctscggccc agcacctgtg acgcctacct 1920sgtcgggcsg 1980cctatctaaa cacctgtgag ggtttagcca ggcaggagca 2040 ttaatcccaa tgcgaaaatg acttcgttgt gtttsgagcg 2100 aaatgaccct ccaggacacg gtttatgccc tgccgctgat 2160 agcaggccgg agccatcgga aacgcggcgt cgatcatctc 2220 gcacgccctg ggcgacagcc acagccgaag attctggtgt gggttgctgt gggcagccsc 2280 ccggaacggc tctttagagg cgttctcggc ccagttgctg cggttgctgg cggatgtgca 2340 ggagtccagc gagctgagaa accccggcgc gctgttcgcg gcccgccttc gcagcgcctg 2400 accttcgggg accgcgcccg aagaccaggc gctgctcagt tgggcttgag ggtgattacg 24 60 ttctgsg 2467cgtg3ccgcc cccaccgaicg aggccgtcag ccccccagcg gcctgcctgg ggcg3gctg3 gggcgcgcgg ccggtstccg gtg3tcccc3 cgtggcgcgg tacaccaccc ggtgattgsc ggcggcgcgc cctgtgggac ggctcgstctcgtcctgaaa acctgggccg gac3tttc3g gccgagcaga cggggsactg agcgaactcaSEQ ID NO: 2cgcggtacca tcttgcctct gaaactgcgt31SEQ ID NO: 3gcgggtsccg cactttagtg ctaiaitcttgc g31SEQ ID NO: 4gaaaccgggc taggtacccc aaatcctgac30 SEQ ID NO: 5Ggtggtaccc tcagacatga tcgggcctc SEQ ID NO: 6ttgtcagctt cggtcagttg acatSEQ ID NO: 7tggggtcctc ctgtgagtga
權(quán)利要求
1.具熒光素酶活性抗輻射菌的制備方法，其特征在于以下步驟(1)以SEQ ID NO1所表示的堿基序列或其誘導(dǎo)體為基礎(chǔ)，與大腸桿菌中能自我復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行重組成穿梭載體，以及穿梭載體的轉(zhuǎn)化子；(2)所述穿梭載體以及穿梭載體的轉(zhuǎn)化子與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段重組成具有熒光素酶基因的質(zhì)粒pSP-lux+，將該質(zhì)粒pSP-lux+導(dǎo)入抗輻射菌Deinococcus屬細(xì)菌，獲得具熒光素酶活性的抗輻射菌。
2. 按權(quán)利要求1所述具熒光素酶活性抗輻射菌的制備方法，其特征在于所述步驟(2) 的具體操作為(1) 以抗輻射菌Z e^ococciAsra力'oo^r朋sATCC13939的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7所示的堿基序列合成的DNA為引物，用Pfu Turbo ■ polymerase進(jìn)行 PCR反應(yīng)，增幅在抗輻射菌Ztei/70cocc"s rafl^o^a/ s中具有活性的已知的groEL啟動(dòng)子領(lǐng) 域，然后用Ncol內(nèi)切酶消化含有熒光素酶基因的質(zhì)粒pSP-lux+，用T4 DNA polymerase進(jìn) 行DNA斷片末端的平滑化，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與平滑化的pSP-lux+連接，得到pGroE-lux+2及 pGroE-lux+4兩種質(zhì)粒；(2) 用HindIII消化上述兩種質(zhì)粒，進(jìn)行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV消化，得 到含有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA斷片插入步驟1所獲穿梭載體 質(zhì)粒的EcoRV部位，構(gòu)建具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，用構(gòu)建的熒光素酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Ztej'/ ococci/s ^ra/7￡/i&得到具有熒光素酶基因的菌株。
全文摘要
具熒光素酶活性抗輻射菌的制備方法。以抗輻射菌Deinococcus radiopugnans由來(lái)的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，與大腸桿菌中能自我復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行重組而成穿梭載體。載體與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段重組成具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入抗輻射菌屬細(xì)菌，用構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Deinococcus grandis，得到氯霉素抗性的菌株。使用本發(fā)明制備的抗輻射菌可使用在野外開(kāi)放封閉環(huán)境的各種領(lǐng)域，載體具有熒光素酶基因，在實(shí)時(shí)監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育、分布及對(duì)環(huán)境的影響等方面有較好的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101113426SQ20061015466
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日
發(fā)明者屠振力 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)