專利名稱：一種交替假單胞菌及其產(chǎn)右旋糖苷酶的方法與產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，特別是一種分離自中國江蘇省連云港海域的交替假單胞菌 LP602 (.Pseudoalteromonassp. LP602) CGMCC NO. 4319 (已于 2010 年 11 月 10 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC NO. 4319)； 本發(fā)明還涉及該菌株產(chǎn)右旋糖苷酶的方法及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
右旋糖苷(Dextean)主要是α-1，6-糖苷鍵連接的葡萄糖。右旋糖苷酶(Dextran ase, α-D-1, 6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase, EC3. 2· 1· 11)，又叫 α-葡聚糖酶，是專一切割右旋糖苷中α-1，6糖苷鍵的水解酶。目前國內(nèi)外報道的產(chǎn)生右旋糖苷酶微生物主要為青霉)、斯達油月旨酵母5 tarkeyi ) > X^t^J ^^ lif (Chae tomium gracile ) > ( {.Aspergillus Mtos)、芽孢桿菌UaciB^s sp.)、鏈球菌(份r^iococcM sp.)均能產(chǎn)生右旋糖苷酶。右旋糖苷酶有很重要的應用價值，右旋糖苷酶在制糖工業(yè)中降解多糖聚合物，降低多糖的相對分子質(zhì)量，從而降低糖的黏性。右旋糖苷酶還可以用于口腔醫(yī)用制品和代血漿右旋糖苷的酶法生產(chǎn)。右旋糖苷酶在口腔醫(yī)用制品中的應用。口腔中的細菌發(fā)酵食物中的蔗糖，生成右旋糖苷(α -D-glucan)。右旋糖苷在牙齒面形成牙菌斑，它是導致細菌在牙齒表面積累的決定因素。菌斑中微生物則在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保護下大量繁殖，其酸性代謝物破壞牙釉質(zhì)，從而導致齲齒，造成無法再生的牙齒損傷，同時也給患者帶來巨大痛苦。牙菌斑是齲齒和牙周病重要的致病因素之一。因此為了預防和控制齲齒和牙周病，抑制牙菌斑的發(fā)生和發(fā)展是至關(guān)重要的。右旋糖苷由α-1，4、α-1，3、以及α-1，6糖苷鍵構(gòu)成，其中α-1，6糖苷鍵形成的側(cè)鏈決定其粘附性，而這種粘附性是形成菌斑和齲齒的重要物化因素。右旋糖苷通過其粘附性相互交聯(lián)，形成保護性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得其中微生物，特別是具有齲齒形成能力的鏈球菌非常容易滋生。由于右旋糖苷在牙齒表面或縫隙中形成堅固的并具有一定韌性的菌斑結(jié)構(gòu)，這種保護性結(jié)構(gòu)使得具有齲齒形成能力的微生物很難根除，因此傳統(tǒng)的牙刷、牙線等物理治療方法難以杜絕齲齒損害。普通的化學口腔護理劑中通常含有硼酸、甲硝唑、西吡氯銨、氯己定、碘酒、乙醇等化合物，通常情況下以及口腔粘膜破損的情況下，這些物質(zhì)可能會引起副反應，增加病人的痛苦。右旋糖苷酶可以降解口腔中的右旋糖苷。右旋糖苷酶是一種生物制劑，使用和保存簡便易行。無毒性，無耐藥性，不影響口腔內(nèi)的生物生態(tài)平衡，對不會刷牙的嬰幼兒和不具備洗漱條件的情況下，是一種良好的預防牙齲齒斑的制劑。而每個人飯后，尤其是食糖后應用添加有此酶的漱口劑，是一項很好的抑制菌斑形成，預防齲齒和牙周病的有效措施。近幾年各國在這一領(lǐng)域已作了深入研究，將具有降解菌齒斑能力的右旋糖苷酶添加到牙膏、漱口水和口香糖中，取得了良好的防治齲齒的效果。右旋糖苷酶在代血漿右旋糖苷的酶法生產(chǎn)中的應用。右旋糖苷主要用作血漿增量劑，即代血漿。目前醫(yī)藥上用的右旋糖苷有中分子量和低分子量兩種，中分子量限于70000 左右，低分子量的為40000。目前，藥用右旋糖苷的生產(chǎn)主要是采用酸水解法，條件激烈，得率低，要求生產(chǎn)設(shè)備條件苛刻，如能采用酶法生產(chǎn)，可提高產(chǎn)率，降低成本。國外對這兩個領(lǐng)域的研究與應用均有報道，但國內(nèi)目前相關(guān)研究較少，經(jīng)查新尚無海洋來源右旋糖苷酶應用于醫(yī)學制品的相關(guān)專利。而且國外的右旋糖苷酶制品的生產(chǎn)菌株多為陸源的真菌，例如ster^^i等，其酶活性參數(shù)不甚理想。這是由于陸源的右旋糖苷酶最適溫度較高，并且在比較溫和的酸堿條件下發(fā)揮作用，不耐有機溶劑。而海洋來源的右旋糖苷酶可以在極端條件下發(fā)揮作用，例如低溫、極端PH、高鹽、有機溶劑，這為開發(fā)出更多新型海洋生物醫(yī)用材料提供了最佳的條件。當今國內(nèi)外對海洋微生物產(chǎn)右旋糖苷酶用于生物醫(yī)學制品的開發(fā)研究尚未見報道。雖然我國酶制劑市場增長較快，但是海洋來源酶制劑研究不足。我國酶制劑研究多集中在食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)中，但是對于醫(yī)藥用酶研究不足。我國對于海洋來源的右旋糖苷酶的酶學性質(zhì)研究以及工業(yè)化應用研究，尤其是在生物醫(yī)學上的應用研究起步較晚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的能產(chǎn)右旋糖苷酶的海洋細菌替假單胞菌LP602。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是研究交替假單胞菌的生長特性，及其產(chǎn)右旋糖苷酶的方法與酶產(chǎn)品。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明的特征包括交替假單胞菌LP602 O^ewi/oa/teroffloftas·^. LP602)菌株本身，以及利用該菌株產(chǎn)右旋糖苷酶的方法，以及利用該菌株所產(chǎn)的右旋糖苷酶產(chǎn)品。本發(fā)明所涉及的菌株是在中國江蘇省連云港海域的海水中分離到的交替假單胞菌 WmZiPseudoalteromonas sp. LP602),該交替假單胞菌 LP602 于 2010 年 11 月 10 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC NO. 4319， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。一、本發(fā)明菌株的篩選方法。1. 1本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)基
2216E培養(yǎng)基蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 1%，瓊脂2%，陳海水配制，pH8。初篩培養(yǎng)基蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，右旋糖苷0.2%，瓊脂洲，陳海水配制，pH 8. 0 ；
產(chǎn)酶培養(yǎng)基酵母膏0. 1%，蛋白胨0. 1%，右旋糖苷1%，陳海水配制，PH 8. 0。微量礦物鹽溶液(每升)CuS04*5H20，0.01g; ZnSO4 ·7Η20，0. lg; CoCl2 ·6Η20， 0. 005g; MnCl2 ·4Η20, 0. 2g; Na2MoO4 ·2Η20, 0. lg; KBr, 0. 05g; ΚΙ, 0. 05g; H3BO3, 0. Ig； NaF, 0. 05g; LiCl, 0. 05g; A12(S04)3; 0. 05g; NiCl2 ·6Η20, 0. Olg; VoSO4 ·2Η20, 0. 005g; H2WO4 · 2H20, 0. 002g; Na2SeO4j 0. 005g; SrCl · 6H20, 0. 005g; BaCl2, 0. 005g。1.2菌株的篩選方法海泥直接取Ig放入50ml 2216E培養(yǎng)基中，20°C、180r/min培養(yǎng)2-5d。選取合適的培養(yǎng)液的稀釋液涂布初篩培養(yǎng)基，20°C培養(yǎng)3-4d，菌落長出后加入95%乙醇，-20°C冷凍3、h， 觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈。挑取有透明圈的單菌落菌株接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，20°C、180r/ min培養(yǎng)2d，10000r/min離心15min取上清液測定酶活力大小。選出透明圈較大和酶活力較高的LP602菌株。二、本發(fā)明菌株的形態(tài)特征與生理生化特征。1. 1形態(tài)特征
菌株為革蘭氏陰性桿狀細菌、有莢膜、無芽孢，大小約為1. 7-2 μ mXO. 8-1. 2 μ m，參見圖1。在含有右旋糖苷固體培養(yǎng)基上的菌落特征菌落直徑4 mm-7 mm,圓形、乳白色、濕潤、邊緣光滑、中間突起，菌落長出后加入95%乙醇，-20°C冷凍3、h，菌落周圍出現(xiàn)透明圈， 參見圖2。1. 2生理生化特征
交替假單胞菌LP602的生理生化特征以及與其他交替假單胞菌的比較見圖3、4。菌株 LP602氧化酶為陽性，能發(fā)酵葡萄糖、甲基紅，V-P試驗陰性，無氯化鈉不可生長，能液化明膠，不能產(chǎn)生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖° 通過 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (second edition) 分析比較，初步判定該菌株LP602為交替假單胞菌屬O^wi/oWteroMwa^A )。1. 3菌株LP602的分子生物學鑒定
用Takara試劑盒提取DNA模板，并于_40°C保存。正向弓丨物Pl :5'-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，反向弓丨物 P2 5‘ -CGGCTACCTTGTTACGAC-3‘。反應體系 25μ1，Taq 酶 2U，反應條件為 95°C預變性 5min，94°C 變性30s，53°C退火45s，72°C延伸70s，35個循環(huán)，72°C延伸6min。PCR產(chǎn)物的純化、克隆、 測序由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。擴增菌株LP602的16S rDNA，其長度為 1500bp。將菌株LP602的16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，通過16S rDNA序列同源性比較，可以初步確認該菌株為交替假單胞菌屬iFseuckmltercmoims sp.)。將親緣關(guān)系較近的菌株16S rDNA應用MEGA軟件進行多重比較，用中鄰接法(Neibor-joining method) 建系統(tǒng)進化樹，從進化樹表明菌株LP602與交替假單胞菌屬(NR(^8992 Pseudoalteromonas mariniglutinosa)位于同一簇群，親緣關(guān)系最近，參見圖5。三、本發(fā)明菌株LP602的生長特性
本發(fā)明提供的菌株LP602，對其生長特性進行了細致的研究，了解不同條件下該菌的生長情況。3. 1種子液的制備將保藏在2216E培養(yǎng)基的交替假單胞菌LP602接種到2216E培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%，培養(yǎng)12h。3. 2溫度對菌株LP602生長的影響
將種子液以洲接種量于2216E培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%，分別在不同溫度下培養(yǎng)，每隔一段時間測定細胞濃度，選擇在600nm波長下測定OD值，該菌株能夠在4°C下生長，其生長溫度范圍為4 37°C，最適生長溫度為25°C，見圖6。3. 3pH對菌株LP602生長的影響
在2216E培養(yǎng)基中加入終濃度為IOmM的磷酸醋酸硼酸(1 1 :1)作為緩沖液，使培養(yǎng)基的PH分別為4. 0 11. 0之間，在25°C培養(yǎng)M小時，測定細胞濃度，生長pH范圍為6 11，最適生長pH為9.0，見圖7。3. 4 NaCl對菌株LP602生長的影響
按照3. 1方法制備種子液，在2216E培養(yǎng)基(將陳海水改用微量礦物鹽溶液代替，每升培養(yǎng)基加入IOml)中加入NaCl，使之為0%到12%的NaCl，在25°C培養(yǎng)M小時，測定細胞濃度，生長的NaCl濃度為0. 5% 10%，最適生長的NaCl濃度為7%，見圖8。四、菌株產(chǎn)右旋糖苷酶的方法。將種子液以m的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，180r/min, 25°C培養(yǎng)Mh，10000r/min 離心lOmin，取上清液，加入65%硫酸銨，靜置3h后，12000r/min離心20min，用適量50mM， PH為7. O的Tris-HCL緩沖液溶解沉淀，然后4°C透析Mh，再經(jīng)過DEAE-s印harose Flat Flow和kphacryl S-200等方法得到右旋糖苷酶。五、右旋糖苷酶的性質(zhì)。5. 1酶作用溫度對酶活性的影響
將右旋糖苷酶置于不同溫度下與底物發(fā)生反應，測定酶活力，結(jié)果見圖9，酶的最適作用溫度為20°C，5°C仍有45%的酶活力，在5°C 40°C溫度范圍時有較高的催化活力。5. 2酶的熱穩(wěn)定性 取適量酶液分別在不同溫度(30°〇、401、501和80°C)下保溫2. 5h，每隔0. 5 h取出
一組樣品，迅速置于4°C冰箱內(nèi)，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一在標準條件下測定殘余酶活，以未處理酶液的酶活設(shè)為100%，結(jié)果見圖10，產(chǎn)生的右旋糖苷酶的熱穩(wěn)定性較好，在50°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持74%以上，在80°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持50%。5. 3酶的作用pH對酶活性的影響
將酶液與在不同PH的1%的右旋糖苷溶液中在20°C下進行酶活力測定，不同pH值的緩沖液為50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0到6. 0);50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0到8. 0);50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0 to 9.0) ；50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9. 0到10. 0)。結(jié)果見圖11，pH8. 0該酶的活性最高。5.4酶的pH穩(wěn)定性
將50 ul酶液與150 ul不同pH的緩沖液混合，緩沖液為伯瑞坦-羅賓森 (Britton-Robinson)緩沖溶液，pH 分別為 4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0，在 20°C水浴鍋中保溫Ih取出測定殘余酶活，將未處理酶液的酶活設(shè)為100%。結(jié)果見圖12，結(jié)果表明在 20° C保溫下Ih后，右旋糖苷酶在pH7. 0 9. 0范圍內(nèi)穩(wěn)定，殘余酶活力保持在55%以上， 在ρΗ4· 0和ρΗΙΟ. 0分別有8. 28%和21. 6%的殘余酶活力。5. 5右旋糖苷酶活測定
①右旋糖苷酶活測定方法取1%右旋糖苷溶液100 μ L加入100 μ L酶液，空白以 100 μ L滅活的酶液代之，20°C反應15min，立即放入冰浴中終止反應，加入200 μ L DNS 100°C煮沸5min，終止反應并顯色，加入3mL去離子水振蕩混勻，取200 μ L于96孔酶標板上于520nm下進行吸光值測定。②酶活力單位定義上述反應條件下每分鐘水解右旋糖苷產(chǎn)生1 μ g麥芽糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位(U)。


圖1為菌株LP602形態(tài)染色特征(10 X 100)圖。圖2為菌株LP602在含右旋糖苷的平板上的透明圈圖。圖3為菌株LP602的生理生化特征圖表。圖4為菌株LP602理化特征與其他交替假單胞菌的比較圖。圖5為菌株LP602的16S rRNA進化樹分析圖。圖6為溫度對菌株LP602生長的影響圖。圖中15°C ( )，20 °C ( □ ),25°C (▲)，30°C (■)。圖7為pH對菌株LP602生長的影響圖。圖8為NaCl濃度對菌株生長的影響圖。圖9為溫度對酶活性的影響圖。圖10為溫度對酶熱穩(wěn)定性的影響圖。圖中30°C (O),40°C (X ),50 (4),80^ (■)。圖11為pH對酶活力的影響圖。圖12為pH對酶穩(wěn)定性的影響圖。本發(fā)明所涉及的菌株交替假單胞菌LP602 O^ewi/oa/teroffloftas·^. LP602)已于 2010年11月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC NO. 4319 ；保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。
具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本實用新型的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實施例1。一種交替假單胞菌 LP602 (.Pseudoal teromonassp. LP602) CGMCC N0. 4319。該菌株具有以下特征菌株為革蘭氏陰性桿狀細菌、有莢膜、無芽孢，大小約為 1.7-2μπιΧ0.8-1.2μπι;在含有右旋糖苷固體培養(yǎng)基上的菌落特征菌落直徑4 mm-7 mm, 圓形、乳白色、濕潤、邊緣光滑、中間突起，菌落長出后加入95%乙醇，-20°C冷凍；T4h，菌落周圍出現(xiàn)透明圈；氧化酶為陽性，能發(fā)酵葡萄糖、甲基紅，V-P試驗陰性，無氯化鈉不可生長，能液化明膠，不能產(chǎn)生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖。交替假單胞菌LP602的生長特性為該菌株生長溫度范圍為 4 37°C，生長pH范圍為6. 0 11. 0，生長的NaCl濃度范圍為0. 5% 10%，最適生長溫度為25°C，最適生長pH為9. 0，最適生長的NaCl濃度為7%。實施例2。一種實施例1所述的交替假單胞菌LP602 (.Pseudoalteromonassp. LP602)CGMCC NO. 4319產(chǎn)右旋糖苷酶的方法，其步驟如下將交替假單胞菌LP602菌株接種到2216E培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%，培養(yǎng)12h，得種子液；將種子液以m的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，25°C培養(yǎng)Mh，10000r/min離心5min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。實施例3。一種實施例2所述的方法所產(chǎn)右旋糖苷酶，該右旋糖苷酶具有以下特征所述的右旋糖苷酶的性質(zhì)為右旋糖苷酶的適合作用溫度為20°C，5°C仍有45%的酶活力，在5°C 40°C溫度范圍時有較高的催化活力，產(chǎn)生的右旋糖苷酶的熱穩(wěn)定性較好，在 50°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持74%以上，在80°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持50%。 右旋糖苷酶在PH7. 0 9. 0范圍內(nèi)穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.一種交替假單胞菌 LP602 (.Pseudoal teromonassp. LP602) CGMCC NO. 4319。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述交替假單胞菌LP602CGMCC NO. 4319，其特征在于，該菌株具有以下特征菌株為革蘭氏陰性桿狀細菌、有莢膜、無芽孢，大小為1. 7-2 μ mXO. 8-1. 2 μ m ； 在含有右旋糖苷固體培養(yǎng)基上的菌落特征為菌落直徑4 mm-7 mm，圓形、乳白色、濕潤、邊緣光滑、中間突起，菌落長出后加入95%乙醇，-20°C冷凍；T4h，菌落周圍出現(xiàn)透明圈；氧化酶為陽性，能發(fā)酵葡萄糖、甲基紅，V-P試驗陰性，無氯化鈉不可生長，能液化明膠，不能產(chǎn)生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸和丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纖維二糖和麥芽糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述交替假單胞菌LP602(.Pseudoalteromonassp. LP602) CGMCC NO. 4319，其特征在于，其生長特性為該菌株生長溫度范圍為4 37°C，生長pH范圍為 6. 0 11. 0，生長的NaCl濃度范圍為0. 5% 10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述交替假單胞菌LP602(.Pseudoalteromonassp. LP602) CGMCC NO. 4319，其特征在于該菌株最適生長溫度為25°C，最適生長pH為9.0，最適生長的NaCl 濃度為7%。
5.一種如權(quán)利要求1-4中任何一項所述的所述交替假單胞菌LP602 (.Pseudoalteromonassp. LP602) CGMCC NO. 4319產(chǎn)右旋糖苷酶的方法，其特征在于，其步驟如下將交替假單胞菌LP602菌株接種到2216E培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20%， 培養(yǎng)16h，得種子液；將種子液以m的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，180r/min，25°C培養(yǎng)Mh， 10000r/min離心5min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。
6.一種如權(quán)利要求5所述的方法所產(chǎn)右旋糖苷酶，其特征在于，所述的右旋糖苷酶的理化性質(zhì)為右旋糖苷酶的適合作用溫度為20°C，5°C仍有45%的酶活力，在5°C 40°C溫度范圍時有催化活力，產(chǎn)生的右旋糖苷酶的熱穩(wěn)定性好，在50°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持74%以上，在80°C下保溫2. 5 h后酶活仍能保持50% ；該酶在pH 7. 0 9. 0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明是一種交替假單胞菌LP602(Pseudoalteromonassp.LP602)CGMCCN0.4319。該菌株具有以下特征菌株為革蘭氏陰性桿狀細菌、有莢膜、無芽孢；該菌株生長溫度范圍為4～37℃，生長pH范圍為6.0～11.0，生長的NaCl濃度范圍為0.5%～10%。本發(fā)明還公開了一種利用交替假單胞菌產(chǎn)右旋糖苷酶的方法及按該方法得到的右旋糖苷酶產(chǎn)品，該右旋糖苷酶在齲齒防治和藥用右旋糖苷的生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要的作用。
文檔編號C12N9/26GK102154158SQ201010609348
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者劉姝, 呂明生, 房耀維, 曹茜, 李瑛 , 焦豫良, 王淑軍 申請人:淮海工學院