專利名稱：?jiǎn)伟岬拿阜ㄖ苽涞闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將假單胞菌酸(pseudomonic acid)及其酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的單胞菌酸(monic acid)的方法。
已經(jīng)知道假單胞菌酸有抗細(xì)菌特性，所知的假單胞菌酸包括四氫吡喃基化合物假單胞菌酸A(Nature，1971，234-416，JCS Perkin，Trans.I，1977，294)、假單胞菌酸B(JCS Perkin，Trans I，1982，2827)、假單胞菌酸C(JCS Perkin，Trans I，1982，2827)和假單胞菌酸D(JCS Perkin，Trans I，1983，2655)。
特別地是，本發(fā)明提供了將假單胞菌酸A(麥吡羅素mupirocin)(I)轉(zhuǎn)化成單胞菌酸A(II)或?qū)⒓賳伟酑(III)或其甲酯轉(zhuǎn)化成單胞菌酸C(IV)的方法，所說物質(zhì)通式如下 單胞菌酸在生產(chǎn)生物活性的化合物尤其是在生產(chǎn)藥物中用作起始物。Beecham Group plc GB 1587058描述了單胞菌酸的化學(xué)制備方法，用化學(xué)方法制備存在一個(gè)提取產(chǎn)物的問題。
現(xiàn)在需要一種替代化學(xué)水解假單胞菌酸成單胞菌酸的方法。雖然已知道有很多水解酶，但我們意外地發(fā)現(xiàn)至今所試用的60種或如此通用的動(dòng)物、植物和微生物性水解酶(例如Sigma化學(xué)公司，Poole，Dorset)中沒有看到有適用的活性。例如，枯草桿菌蛋白酶E.C.3.4.21.14被發(fā)現(xiàn)不能水解假單胞菌酸A類似物中的9-羥基壬酸酯(Sime et al.1987，Tetlett 28(43)，pp 5169-72)。
Freer等(同位素標(biāo)記化合物的合成和應(yīng)用，Proceeding 3rdInternational Symposium，Elsevier)用哺乳動(dòng)物的酶(豬肝的酯酶)將麥吡羅素[2-14C]轉(zhuǎn)變成單胞菌酸[2-14C]。我們也發(fā)現(xiàn)這并不能提供所需要的活性水平。
現(xiàn)在我們已找到在本發(fā)明所說方法中適用的酶，它們能從某些放線菌(Actinomycetes)，特別是從北里孢菌屬(Kitasatosporia)、克勃特爾孢囊菌屬(Kibdelosporangium SP.)的菌種和一些鏈霉菌屬(Streptomyces SP.)的菌種中分離到。
因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)單胞菌酸的方法，它包含將相應(yīng)的假單胞菌酸或其酯與來自合適微生物的水解酶相接觸。
就假單胞菌酸的酯來說，我們包括的是那些由本發(fā)明的水解酶所裂解以產(chǎn)生相應(yīng)的單胞菌酸的酯。合適的酯包括(C1-C6)酯，特別是甲酯。
本發(fā)明也提供篩選能將假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸的微生物的方法，該方法包括將所說的微生物與假單胞菌酸一起培養(yǎng)并與假單胞菌酸標(biāo)準(zhǔn)相比較測(cè)定其抗細(xì)菌活性的喪失。
特別適用的微生物包括變青鏈霉菌(S.lividans)特別是變青鏈霉菌菌株NCIMB 11416、灰褐鏈霉菌(S.giseofuscsus)菌株ATCC23916和產(chǎn)二素鏈霉菌(S.ambofaciens)菌株ATCC 23873以及干裂克勃特爾孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)ATCC 39922。菌株北里孢菌(Kitasatosporia)NCIMB 40568是一種新的微生物并因此成為本發(fā)明的另一個(gè)方面。該菌株于1993年6月14日已在蘇格蘭Aberdeen國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌菌株保存中心保存，其登記號(hào)為NCIMB40568。
北里孢菌菌株NCIM4B 40568為灰色孢子并具有以下特征胞壁肽聚糖左旋二氨基庚二酸/內(nèi)消旋氨基庚二酸(LL-A2pm/meso-A2pm)[Buchanan R.E.和Gibbons，N.E.伯杰的細(xì)菌鑒定手冊(cè)]。
按照本發(fā)明培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)睾锌梢酝奶荚磁c氮源以及無機(jī)鹽。合適的氮源包括玉米漿、酵母提取物、大豆粉、肉膏、棉籽粉、面粉、麥芽、酒糟干燥可溶物、氨基酸、蛋白水解物以及銨和硝態(tài)氮。合適的碳源包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、甘油和糖漿例如福氏糖漿。
合適的培養(yǎng)基還要包括堿金屬離子(例如鈉)、鹵素離子(例如氯化物)和堿土金屬離子(例如鈣和鎂)以及痕量元素例如鐵和鈷。
適宜地，細(xì)胞通過離心或過濾進(jìn)行收集。
本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化/方法能用整個(gè)細(xì)胞、滲透過的細(xì)胞的無細(xì)胞提取物或從微生物中分離的酶或其中的任一固定化形式去實(shí)現(xiàn)。
在用整個(gè)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化時(shí)，微生物的形式可以是正生長(zhǎng)著的培養(yǎng)物、休眠的培養(yǎng)物、洗過的菌絲體、固定化細(xì)胞或原生質(zhì)體。
當(dāng)用無細(xì)胞提取物時(shí)，生產(chǎn)這些無細(xì)胞提取物可適當(dāng)?shù)赜们兴楹?或化學(xué)或酶溶解或其他破壞細(xì)胞的方法，最好用超聲波處理，任選一種處理以后除去細(xì)胞碎片，而把酶活性留在溶液中。
按照下述實(shí)施例合適地進(jìn)行酶的制備。酶可通過用常規(guī)方式特別是在好氣條件下，在合適的液體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物進(jìn)行制備。
培養(yǎng)條件中溫度范圍為5-50℃，pH范圍為3-9，優(yōu)選的為6-8，最優(yōu)選的是7.2。
可以純化形式、部分純化形式，作為不純狀態(tài)得到的、破碎細(xì)胞的濾液、粗制細(xì)胞勻漿液來分離和應(yīng)用所說的酶。合適的是，例如最低要求地純化酶，以除去那些可能會(huì)催化破壞起始物或所述酶的其它酶。
本發(fā)明另一方面是提供了一種能夠?qū)⒓賳伟崴獬蓡伟岬拿?，該酶的獲得是通過按照下列實(shí)施例5和/或7(和實(shí)施例6)所述處理鏈霉菌/北里孢菌/克勃特爾孢囊菌的菌絲體，離心和破碎細(xì)胞(超聲波處理)，接著進(jìn)行分部分離和色譜法。
最合適的酶是固定化酶，例如用Powell(1990)在MicrobialEnzymes and Biotechnology，p369-394(由Fogarty和Kelly編著)中所討論的方法把酶固定在不溶的載體材料上，這就提供了增加產(chǎn)量和生產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。
起始材料假單胞菌酸可以用英國(guó)專利1395907中所敘述的方法制備。
用整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，保溫培養(yǎng)基包括休眠細(xì)胞培養(yǎng)基在一升pH 6.5的去離子水或pH調(diào)節(jié)過的水系統(tǒng)中含有KH2PO42克、K2HPO41.5克、KCl 0.2克、MgCl2·6H2O 0.2克、Na2SO4·10H2O 0.22克和葡萄糖1.0克。
當(dāng)用無細(xì)胞提取物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，保溫培養(yǎng)基含有適用的緩沖液。
除底物外，酶反應(yīng)混合物可以含有一個(gè)或多個(gè)其它輔助因子，例如金屬離子或穩(wěn)定劑，如硫醇。
本發(fā)明的方法可在水性介質(zhì)中合適地進(jìn)行，反應(yīng)混合物pH要合適地維持在4-9的范圍，較好的維持pH6-8，最好的維持在大約pH7.2例如7.4pH。用緩沖液或優(yōu)選加酸或堿滴定，以適當(dāng)?shù)乜刂苝H。反應(yīng)的溫度通常應(yīng)在5-50℃，優(yōu)選在22-45℃，最優(yōu)選在32-37℃的范圍。
可以選擇地是，反應(yīng)也能在有機(jī)溶劑中或存在有機(jī)溶劑例如丙酮、甲基異丁基酮(MIBK)時(shí)進(jìn)行。
反應(yīng)時(shí)間取決于反應(yīng)物的濃度及輔助因子、溫度和pH等因素。
反應(yīng)完成后，產(chǎn)物可用下文實(shí)施例所示的常規(guī)方法分離出來。最初的純化可以方便地涉及色譜法步驟。
用下述實(shí)施例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1.篩選和測(cè)定方法1.1.初篩生物轉(zhuǎn)化的發(fā)生伴隨有抗細(xì)菌活性的喪失，因此這點(diǎn)可以用作測(cè)定的基礎(chǔ)以鑒定能將假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸的微生物。取G1培養(yǎng)基(實(shí)施例2)3×1ml體積分布到24孔微滴定板中并接種(例如用瓊脂平板上生長(zhǎng)的放線菌菌絲體)，在28℃振動(dòng)培養(yǎng)四天。沒有接種的對(duì)照板也同時(shí)培養(yǎng)(只含有G1培養(yǎng)基)。把假單胞菌酸0.05mg/ml加到微滴定板上并將此板再培養(yǎng)24小時(shí)。然后取50微升培養(yǎng)物(兩份)加到含有適宜對(duì)假單胞菌酸敏感的菌株例如金黃色葡萄球菌(例如V573)或大腸桿菌(例如ESS菌株)的生物測(cè)定平板上。經(jīng)在37℃培養(yǎng)過夜后測(cè)定其抑制圈。
1.2.第二次篩選用增加的底物濃度進(jìn)行接種以發(fā)現(xiàn)在較高底物濃度下能夠進(jìn)行所需轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物。取含有100ml G1培養(yǎng)基(實(shí)施例2)的三角瓶(500ml)，每瓶用在含0.02％吐溫80的水中的培養(yǎng)物/菌絲體的接種物1.5ml進(jìn)行接種。三角瓶在28℃進(jìn)行搖動(dòng)(240rpm)培養(yǎng)4天，然后把瓶中液體離心并再懸浮于休眠細(xì)胞培養(yǎng)基(實(shí)施例2)中。為補(bǔ)償可變的生長(zhǎng)密度又把培養(yǎng)物懸浮在2X和6X肉湯密度之間(生長(zhǎng)后得到的起始細(xì)胞密度相當(dāng)于1X肉湯細(xì)胞密度)。把0.05MNaH2PO4pH7.0中的假單胞菌酸(10mg/ml)經(jīng)過濾除菌后加到每個(gè)三角瓶中，使其終濃度為0.5mg/ml。在28℃振搖培養(yǎng)24小時(shí)后，把三角瓶中的液體離心，測(cè)量上清液體積并用高壓液相色譜法對(duì)一個(gè)等分試樣進(jìn)行分析(實(shí)施例2)。
特別好的結(jié)果得自二種培養(yǎng)物；北里孢菌NCIMB 40568(87％轉(zhuǎn)化成單胞菌酸，肉湯細(xì)胞密度為2)和干裂克勃特爾孢囊菌ATCC39922(76.9％轉(zhuǎn)化率，肉湯細(xì)胞密度為2)。用變青鏈霉菌NCIMB11461也得到了可比的結(jié)果。用小量的陽性培養(yǎng)物在2和5.5mg/ml底物濃度下還進(jìn)行了進(jìn)一步培養(yǎng)。
1.3.提取和分析通過加入NaCl以飽和已冷卻(0-5℃)的上清液并用5MHCl調(diào)pH到3.0進(jìn)行提取。以乙酸乙酯為提取溶劑(3×1/3體積)，然后用MgSO4干燥，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以前過濾。保留小體積(0.5ml)在冷卻狀態(tài)過夜使產(chǎn)生結(jié)晶，然后使結(jié)晶干燥。用高壓液相色譜法進(jìn)行純度測(cè)定(實(shí)施例2)，并用氫譜核磁共振(1HNMR)確定其結(jié)構(gòu)是單胞菌酸。
為進(jìn)行氫譜核磁共振(250兆赫茲)分析，樣品放在氘化的二甲基亞砜中并與單胞菌酸標(biāo)準(zhǔn)相比較。實(shí)施例2.用北里孢菌的整個(gè)細(xì)胞反應(yīng)用含有0.02％吐溫80的1.5ml水中懸浮的北里孢菌NCIMB 40568的菌絲懸浮液接種到含100ml G1培養(yǎng)基的500毫升錐形三角瓶中。G1培養(yǎng)基在1升去離子水中含有糊精30克，福氏糖漿20克、細(xì)菌學(xué)用的蛋白胨7克、調(diào)pH到6.8。接種后的三角瓶在28℃振搖培養(yǎng)4天，以后把肉湯離心并把沉淀重懸于250ml三角瓶中的25ml靜止細(xì)胞培養(yǎng)基(KH2PO40.5克，K2HPO41.5克、KCl 0.2克、MgCl2·6H2O 0.2克、Na2SO4·10H2O 0.22克和葡萄糖1.0克，去離子水1升并把pH調(diào)到6.5)。把溶在0.05M NaH2PO4(pH7.0)中的假單胞菌酸(10mg/ml)加到懸浮液中使其最終濃度為500μg/ml。
在28℃振搖24小時(shí)后，離心三角瓶中的液體并用高壓液相色譜法(高壓液相色譜法分析C18柱4.6×250mm，30％MeOH/0.05M NaH2PO4pH4.8，230nm，1.5ml/min，單胞菌酸Rf＝4.9分)對(duì)一個(gè)等分試樣進(jìn)行分析。分析結(jié)果確定87％的底物轉(zhuǎn)化成單胞菌酸。用氫譜核磁共振分析儀(250兆赫茲)進(jìn)行分析，確定該結(jié)構(gòu)是單胞菌酸。實(shí)施例3.用北里孢菌的無細(xì)胞提取物反應(yīng)把北里孢菌NCIMB 40568接種到含有如上述實(shí)施例2所述的G1培養(yǎng)基的三角瓶中，并把三角瓶在28℃振搖48小時(shí)。從這種子瓶中取2ml肉湯為一份接種到另6個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶含有100mlG1培養(yǎng)基。把三角瓶在28℃振搖72小時(shí)后，離心肉湯，棄去上清液，并把細(xì)胞再懸浮于60毫升pH7.4的0.2M Tris/HCl緩沖液中。細(xì)胞以10ml為一批用超聲波處理(MSE Soniprep，20秒中5個(gè)循環(huán)間隔40秒)進(jìn)行破碎，并把該破碎細(xì)胞的懸液離心，留取上清液。把250μl假單胞菌酸溶液(在pH7.4 0.3M Tris/HCl緩沖液中濃度8mg/ml)加到250μl破碎細(xì)胞的上清液中。反應(yīng)物在37℃振動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入甲醇(500μl)并把混合物在冰中冷卻10分鐘。用離心除去所沉淀的蛋白質(zhì)，并如實(shí)施例2所述測(cè)定上清液的單胞菌酸。鑒定了單胞菌酸，底物轉(zhuǎn)化率為92％。實(shí)施例4.用變青鏈霉菌的無細(xì)胞提取物反應(yīng)如實(shí)施例3所述培養(yǎng)變青鏈霉菌NCIMB 11416，用種子三角瓶對(duì)每個(gè)含100ml G1培養(yǎng)基的5個(gè)生產(chǎn)三角瓶進(jìn)行接種。如實(shí)施例3所述首先把從肉湯中得到的細(xì)胞重新懸浮在38ml 0.2M Tris/HCl(pH7.4)緩沖液中進(jìn)行細(xì)胞破碎。把250μl假單胞菌酸(2mg/ml，在0.2M Tris/HCl pH7.4的緩沖液中)加入250μl細(xì)胞上清液中。反應(yīng)物在2 ℃振動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。如實(shí)施例2所述終止反應(yīng)，并用高壓液相色譜法測(cè)定單胞菌酸。59％的底物轉(zhuǎn)化，鑒定為單胞菌酸產(chǎn)品。實(shí)施例5.用從北里孢菌NCIMB 40568菌株得到的半純化酶制品水解如實(shí)施例3所述培養(yǎng)北里孢菌NCIMB 40568，如上所述，在超聲波處理破碎細(xì)胞之前將從500毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中所得的菌絲塊重新懸浮于50ml 0.2M Tris/HCl(pH 7.4)緩沖液中。回收的上清液用5mM二硫蘇糖醇和1％w/v硫酸鏈霉素處理，然后在0℃保存30分鐘。離心后移出41ml上清液，并在上清液中在0℃于5分鐘內(nèi)加完硫酸銨(9.16克)，邊加工邊輕輕攪拌。再攪拌15分鐘后把樣品離心，并保留上清液。在該上清液(43ml)中以同樣的方式再加入硫酸銨(5.3克)。
從所得懸液中取9ml離心，保留的沉淀片狀物在含有0.1M NaCl、10％w/v甘油和1mM二硫蘇糖醇的2.5ml混合液中再溶解。通過凝膠過濾脫鹽把所得制品在-20℃貯存。
聚1ml這種蛋白制品樣本凍融并用0.2M氯化鈉溶液(1.0ml)稀釋，并加入0.01氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)所得溶液的pH到7.01。把假單胞菌酸溶液(2mg溶于pH7.4去離子水0.78ml中)在30℃加到這個(gè)攪拌的溶液中，并隨著0.01M氫氧化鈉溶液的加入所得混合液的pH維持在7.4。
5小時(shí)以后對(duì)堿加入的監(jiān)測(cè)說明了82％假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸而這階段高壓液相色譜法說明轉(zhuǎn)化率為88％。10小時(shí)以后加入到反應(yīng)液中的堿達(dá)一個(gè)克分子當(dāng)量而pH穩(wěn)定說明反應(yīng)已終止。在反應(yīng)未進(jìn)行的高壓液相色譜法檢測(cè)說明96％假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸。實(shí)施例6用從變青鏈霉菌NCIMB 11416得到的固定化制品將假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸把于-70℃貯存于20％蔗糖中的變青鏈霉菌NCIMB 11461的孢子接種到五個(gè)一升三角瓶，每個(gè)三角瓶裝400ml培養(yǎng)基。所說培養(yǎng)基含有25克酵母膏、2克NaH2PO4·2H2O、1克MgSO4·7H2O、0.01克MnSO4·4H2O、0.01克FeSO4·7H2O、0.08克CaCl2·2H2O和15克甘油(pH6.8)。這些三角瓶在往復(fù)搖床上于30℃振搖培養(yǎng)24小時(shí)后，先把它們合并再將其接種到容量1000升標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)型附盤狀渦輪式攪拌發(fā)酵罐中的800升DFO3A培養(yǎng)基(每升含有27.5克酵母膏，33克甘油，2.2克NaH2PO4·2H2O，5克MgSO4·7H2O，0.01克MnSO4·4H2O和1克消泡劑TDB1(Henkel)開始運(yùn)行條件是攪拌250rpm，30℃，排出壓力15psi，氣體流量為40m3/小時(shí)，pH用氨水控制在6.8。在運(yùn)行中通過增加攪拌速度到300rpm，空氣流量到80m3/小時(shí)和排出壓力增加到20psi，溶解的氧量水平保持在飽和值5％以上。38小時(shí)以后罐溫冷卻到大約5℃同時(shí)降低空氣流量和攪拌速度。
肉湯通過流過除污(desuldging)離心機(jī)(Westphalia型SAMR5036流速10-20/分)體積減少到約120升。取40升這種濃縮菌絲塊通過勻漿器(APV Manton-Gaulin LAB60型，1升/分10,000psi)在溫度保持30℃以下進(jìn)行勻漿。通過加入40升0.1MNaH2PO4(pH7.0)溶液并再通過除污離心機(jī)部分澄清勻漿物。用DDS M38超過濾儀把上清液(80升)減少到約25升體積。取90克聚乙烯亞胺放到1升水中在加入變鏈霉菌提取物之前先用2MH3PO4把pH調(diào)到7.8，然后用這種溶液與8升上清液配成含聚乙烯亞胺0.5％。在室溫中攪拌15分鐘后，混合液4600rpm離心(Mistral6000離心機(jī)，1升的離心瓶)20分鐘，棄去沉淀塊。用硫酸銨加到上清液中使其達(dá)到65％的飽和度。15分鐘后用離心(條件與上述相同)回收沉淀并重新懸浮在3升0.1M的磷酸緩沖液(0.039MNaH2PO4，0.061M Na2HPO4，pH7.0)中。
酶溶液用0.5升0.1 M磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋，加入200克(NH4)2SO4使導(dǎo)電性增加到40mS。加入400克交換樹脂A568樹脂(Rohm和Haas，Chauny，法國(guó))(31毫克蛋白/克樹酯)，攪拌此混合物過夜，用1M NaOH控制pH在7.0，以使水解酶吸附。用過濾法回收酶-樹脂，并在濾器上用200ml蒸餾水清洗，后把它加到3.5升含0.2％戊二醛的0.1M磷酸鹽液(pH7.0)中。把混合物攪拌1小時(shí)后用過濾法回收酶-樹脂并把它加到3.5升0.1升磷酸緩沖液(pH7.0)中。把混合物再攪拌1小時(shí)后，用過濾法回收酶-樹脂并在4℃用濕法貯存。
取250克酶-樹脂加到1升0.25％假單胞菌酸液中，并使該混合物在32℃攪拌同時(shí)加1M NaOH維持pH在7.4。24小時(shí)后用過濾法回收酶-樹脂。采用高壓液相色譜法分析濾液的單胞菌酸(高壓液相色譜法分析10μC18柱(3.9×300mm，Bondapak)，30％甲醇，0.05M NaH2PO4，pH3.8，1.5ml/min，Rf＝4.5分)和假單胞菌酸(高壓液相色譜法分析10μC18柱(3.9×300mm，Bondapak)，67％甲醇，0.06M醋酸銨，pH6.3，1.5ml/min，Rf＝5.5min)。分析結(jié)果顯示溶液中沒有假單胞菌酸，單胞菌酸的克分子產(chǎn)率是63％。酶-樹脂可重復(fù)使用3次以上，雖然認(rèn)為，假單胞菌酸消失的時(shí)間隨著每次重復(fù)反應(yīng)而增加，到第四次酶重復(fù)反應(yīng)，假單胞菌酸消失的時(shí)間增加到96小時(shí)。單胞菌酸四次酶作用的平均產(chǎn)率是80％。
將首次酶作用的單胞菌酸溶液在2℃冷卻并用300克氯化鈉飽和。取5MHCl以滴加方式調(diào)節(jié)pH到3.0。加入乙酸乙酯(350ml)在分層以前劇烈攪拌混合物5小時(shí)。水相層用350ml乙酸乙酯提取二次以上。合并乙酸乙酯提取物，在MgSO4上干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到150ml(保持溫度在30℃以下)，在冰浴中攪拌直至沉淀產(chǎn)物，然后在2℃存于過夜。
把產(chǎn)物進(jìn)行過濾，用乙酸乙酯清洗，在真空中干燥并用高壓液相色譜法和氫譜核磁共振進(jìn)行分析。分析結(jié)果確定產(chǎn)物是單胞菌酸?；厥盏?.6克單胞菌酸(55％提取率)。實(shí)施例7變青鏈霉素NCIMB 11416的水解酶的純化把8升超濾濃縮液(實(shí)施例6)用脫氧核糖核酸酶(Sigma DN-25，320mg)處理，在4℃維持1小時(shí)后離心(6,000xg，30分鐘，4℃)。在攪拌時(shí)逐加固體硫酸銨(Sigma III級(jí))到分開的上清液中使其達(dá)到30％的硫酸銨飽和度。把懸液靜止15分鐘然后離心(6,000xg，30min，4℃)。用真空過濾(Whatman GF/D濾紙)除去沉淀。把硫酸銨加到濾液中使其達(dá)到80％的硫酸銨飽和度。過15分鐘后，把懸液離心(17,700xg，25min，5℃)，傾去上清液保留沉淀。
通過加入在50mM磷酸氫二鈉pH7.0緩沖液中的1M硫酸銨液使體積達(dá)到2.5升后使沉淀大量地被溶解，然后加蒸餾水到最終體積5.0升。這樣就得到相當(dāng)于50mM磷酸氫二鈉pH7.0緩沖液中1M硫酸銨達(dá)到的導(dǎo)電度。把這種制品上樣至疏水性相互作用的樹脂柱(丁基瓊脂糖6XL，親和色譜法Ltd)，柱大小為8.0cm×9.0cm，上柱前，柱先用上述緩沖液平衡，在室溫中過柱。
柱用同樣緩沖液沖洗后，用逐步減低50mM磷酸緩沖液中硫酸銨的濃度梯度直到0.1M硫酸銨濃度進(jìn)行洗脫。用50ml試樣加到450μl假單胞菌酸A(2mg/ml，在0.2M Tris/HCl緩沖液中，pH7.4)對(duì)柱的分級(jí)部份進(jìn)行酯酶活性測(cè)定。反應(yīng)物在37℃溫育1小時(shí)后加入甲醇(500μl)。混合物在冰上冷卻10分鐘然后通過離心除去沉淀的蛋白質(zhì)。如實(shí)施例2所述測(cè)定上清液中的單胞菌酸。用Bradford方法(Anal.Biochem，1974，72，248-254)確定蛋白質(zhì)濃度。
把大量收集得到的活性級(jí)分1500ml用超濾器(Amico YM30)濃縮到800ml。把該濃縮液對(duì)5升50mM磷酸氫二鈉組成的內(nèi)含0.5M氯化鈉和10％v/v甘油pH7.0的緩沖液在4℃透析(Spectro-pore4)過夜。將該透析液上樣至金屬離子螯合的親和樹脂柱(螯合的快流速瓊脂糖，填充有銅離子，Pharmacia)柱大小為19.0cm×2.6cm，上柱前用后緩沖液平衡柱。柱上裝載物用緩沖液沖洗，然后用含有硫酸銨濃度從0-1M增高的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫。柱的級(jí)分如前述同樣條件進(jìn)行酯酶活性測(cè)定。收集有活性的洗脫級(jí)分(110ml)并經(jīng)超濾器(YM30)濃縮成15ml。在超濾中，另一緩沖液(25mM Bis Tris丙烷pH7.0在10％v/v甘油中)引用作交換的緩沖液。
把濃縮液上樣至陰離子交換柱(Resource Q，1ml Pharmacia)，上柱前用上述緩沖液平衡。沖洗后用含氯化鈉濃度從0-1M增加的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，在洗脫液中含有三個(gè)活性級(jí)分。
通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Phast凝膠，Pharmacia，10-15％梯度)，用考馬斯蘭染色進(jìn)行活性級(jí)分分析，結(jié)果顯示在中間級(jí)分有其峰濃度的均質(zhì)蛋白且與最高酶活性相互關(guān)連。這些數(shù)據(jù)也為反相高壓液相色譜法(洗脫液＝在0.08％三氟乙酸中甲醇濃度梯度為0-80％λ＝215nm)分析所認(rèn)可。
活性級(jí)分的蛋白測(cè)定表明總蛋白量有0.5mg(標(biāo)準(zhǔn)為牛血清蛋白)。實(shí)施例8確定變青鏈霉菌NCIMB 11416水解酶的分子量最后離子交換純化中活性最高級(jí)分(實(shí)施例7)在反相高壓液相色譜法上(RP-HPLC)產(chǎn)生一個(gè)峰。取這個(gè)峰物質(zhì)在FinniganLasermatt儀上用激光一解吸質(zhì)譜儀(LD-MS)進(jìn)行分析，總分子量(用LD-MS)為54048(±200)道爾頓。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)單胞菌酸(Monic acids)的方法，它包括使相應(yīng)的假單胞菌酸(pseudomonic acid)或其酯與來自合適微生物的水解酶相接觸。
2.如權(quán)利要求1所要求的方法，其中假單胞菌酸是假單胞菌酸A(I) 或假單胞菌酸C(III)或其甲酯
3.如權(quán)利要求1或2中所要求的方法，其中微生物屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、北里孢菌屬(Kitasatosporia)或克勃特爾孢囊菌屬(Kibdelosporangium)的菌種。
4.如權(quán)利要求3中所要求的方法，其中使用微生物的無細(xì)胞提取物。
5.如任一在前權(quán)利要求中所要求的方法，其中的酶是被固定化的。
6.北里孢菌NCIMB 40568菌株(Kitasatosporia SP.NCIMB40568)。
7.一種能夠?qū)⒓賳伟崴獬蓡伟岬拿?，通過用實(shí)施例5、6或7的方法處理如權(quán)利要求6中所限定的微生物或變青鏈霉菌(S.lividans)NCIMB 11416的菌絲體，通過離心、破碎細(xì)胞和分級(jí)分離及色譜法可以得到。
8.如權(quán)利要求7中所要求的酶，其分子量接近54,000道爾頓。
9.篩選能將假單胞菌酸轉(zhuǎn)化成單胞菌酸的微生物的方法，包括把所說的微生物與假單胞菌酸一起培養(yǎng)和與標(biāo)準(zhǔn)假單胞菌酸相比較測(cè)定假單胞菌酸抗菌活性的喪失。
全文摘要
生產(chǎn)單胞菌酸(Monic acids)的方法，包含將相應(yīng)的假單胞菌酸(pseudomonic acid)或其酯與來自適宜微生物特別是鏈霉菌屬(Streptomyces SP.)菌種的水解酶相接觸。
文檔編號(hào)C12P17/06GK1126493SQ94192658
公開日1996年7月10日 申請(qǐng)日期1994年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月3日
發(fā)明者E·F·海斯, J·T·賽米, S·R·沃朗尼基, D·A·伊安多爾 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司