專利名稱：經(jīng)擴(kuò)增zwf基因發(fā)酵制備L－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸，特別是L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-色氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中至少zwf基因是擴(kuò)增的。
現(xiàn)有技術(shù)L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸用于用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，人用藥物及制藥工業(yè)。
已知氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如蘇氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于改良生產(chǎn)L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株。
發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供新的用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的改良方法。
發(fā)明描述L-氨基酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。因此提供生產(chǎn)這些氨基酸的新改良方法總是令人感興趣的。
本發(fā)明提供了用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，和L-色氨酸的方法，在該棒狀細(xì)菌中編碼Zwf蛋白的核苷酸序列(zwf基因)是擴(kuò)增的，尤其是過表達(dá)的。
使用的菌株優(yōu)選在zwf基因擴(kuò)增之前已生產(chǎn)L-氨基酸。
優(yōu)選的實(shí)施方案見于權(quán)利要求。
文中術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或使用強(qiáng)啟動(dòng)子或編碼高活性相應(yīng)酶(蛋白質(zhì))的基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。所述微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變株，如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649黃色短桿菌BB69黃色短桿菌DSM5399乳發(fā)酵短桿菌FERM-BP 269乳發(fā)酵短桿菌TBB-10
以及如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871以及如生產(chǎn)L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21850谷氨酸棒桿菌KY9218(pKW9901)以及如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌ATCC13032谷氨酸棒桿菌DSM58-1谷氨酸棒桿菌DSM12866是棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌合適菌株的實(shí)例。
已發(fā)現(xiàn)在編碼Zwf蛋白的zwf基因過表達(dá)之后，棒狀細(xì)菌以改良方式生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，和L-色氨酸。
得自遺傳密碼簡(jiǎn)并或由于中性功能的有義突變所導(dǎo)致的zwf基因的等位基因也可使用。
JP-A-09224661揭示了黃色短桿菌MJ-223(FERM BP-1497)的葡糖-6-磷酸脫氫酶基因的核苷酸序列，稱為zwf基因。JP-A-09224661闡述了Zwf多肽的N末端氨基酸序列為Met Val Ile Phe GlyVal Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu。
然而，還不能證實(shí)這些序列，相反卻發(fā)現(xiàn)以下N末端氨基酸序列Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp。N位的纈氨?；诜g后修飾中可脫落，而后獲得Ser Thr Asn Thr Thr ProSer Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp作為N末端的氨基酸序列。
為獲得擴(kuò)增(如過表達(dá))，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式工作。通過可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增加表達(dá)也是可能的。延長(zhǎng)mRNA壽命的措施也可改善表達(dá)。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增?；蛘撸ㄟ^改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對(duì)此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國(guó)專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))，Reischeid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請(qǐng)WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58，191-195(1998))，及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，Zwf蛋白已借助于質(zhì)粒被過表達(dá)。為此使用

圖1所示的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。在將zwf基因摻入pEC-T18mob2的KpnI/SalI切割位點(diǎn)之后，形成圖2所示的質(zhì)粒pEC-T18mob2zwf。
能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的其它質(zhì)粒載體如pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同樣方式使用。
另外，除擴(kuò)增zwf基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，添補(bǔ)反應(yīng)，戊糖磷酸途徑或氨基酸輸出的一或多種酶的擴(kuò)增，對(duì)L-氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，例如選自以下一組的一或多個(gè)基因可被同時(shí)擴(kuò)增、尤其是過表達(dá)是以生產(chǎn)L-蘇氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學(xué)2，63-72(1988))，或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikamanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144915-927(1998))，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403)，·編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國(guó))的數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)AB023377)，·編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因(JP-A-09224661)，·編碼蘇氨酸輸出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)，·zwal基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)，·編碼烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
因此，例如選自以下一組的一或多個(gè)基因可被同時(shí)擴(kuò)增、尤其是過表達(dá)以生產(chǎn)L-賴氨酸·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學(xué)224317-324)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，
·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，·編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國(guó))的數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)AB023377)，·編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因(JP-A-09224661)，·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·zwal基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)，·編碼烯醇酶的eno基因(DE19947791.4)。
除擴(kuò)增zwf基因之外，同時(shí)弱化以下基因?qū)-氨基酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除過表達(dá)Zwf蛋白之外，消除非所需的副反應(yīng)對(duì)L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國(guó)，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或非連續(xù)地通過分批法，補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料發(fā)批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術(shù)學(xué)1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合特定菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)”(華盛頓D.C..USA，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿?，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶伎捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍內(nèi)達(dá)到。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)過如Spackman等(分析化學(xué)30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用進(jìn)行，或通過如Lindroth等(分析化學(xué)(1979)511167-1174)所述反相HPLC進(jìn)行。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國(guó))大腸桿菌K-12DH5α/pEC-T18mob2，保藏號(hào)DSM13244。
本發(fā)明包括以下附圖圖1質(zhì)粒pEC-T18mob2圖。
圖2質(zhì)粒pEC-T18mob2zwf圖。
圖3質(zhì)粒pAMC1圖。
圖4質(zhì)粒pMC1圖。
圖5質(zhì)粒pCR2.1poxBint圖。
所述堿基對(duì)數(shù)目是根據(jù)再現(xiàn)性所得的大約值。
圖中所采用的縮寫和符號(hào)有如下含義圖1和圖2所用縮寫有如下含義Tet四環(huán)素抗性基因oriV大腸桿菌的質(zhì)粒編碼的復(fù)制源點(diǎn)RP4mob轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的mob區(qū)域rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復(fù)制源點(diǎn)perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZ α基因片段(N末端)lacZ-alpha′lacZα基因片段的5’末端′lacZ-alphalacZα基因片段的3’末端圖3和圖4所用縮寫有如下含義Neor新霉素/卡那霉素抗性ColE1 ori質(zhì)粒ColE1的復(fù)制源點(diǎn)CMV巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子lacP乳糖啟動(dòng)子pgi磷酸葡糖異構(gòu)酶基因lacZβ-半乳糖苷酶基因的一部分SV403’剪接猴病毒40的3’剪接位點(diǎn)SV40polyA猴病毒40的聚腺苷酸化位點(diǎn)f1(-)ori絲狀噬菌體f1的復(fù)制源點(diǎn)SV40ori猴病毒40的復(fù)制源點(diǎn)Kan r卡那霉素抗性基因pgi插入pgi基因的內(nèi)部片段ori質(zhì)粒pBGS8的復(fù)制源點(diǎn)圖5所用縮寫有如下含義
ColE1 ori質(zhì)粒ColE1的復(fù)制源點(diǎn)lacZlacZ α基因片段的克隆殘存片段f1 ori噬菌體f1的復(fù)制源點(diǎn)KmR卡那霉素抗性ApR氨芐青霉素抗性poxBintpoxB基因的內(nèi)部片段本領(lǐng)域已知各種限制酶縮寫(如BamHI，EcoRI等)的含義，并例如Kessler和Holtke(基因47，1-153(1986))或Poberts等(核酸研究27，312-313(1999))所綜述。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明了本發(fā)明。所使用的分子生物學(xué)技術(shù)如質(zhì)粒DNA分離，限制酶處理，連接，大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化等方法，除非特別說明，均如Sambrook等所述進(jìn)行(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))。
實(shí)施例1Zwf蛋白的表達(dá)1.1制備質(zhì)粒pEC-T18mob2根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。此載體含有質(zhì)粒pGA1的包括復(fù)制效應(yīng)子per的復(fù)制區(qū)rep(US-A-5，175，108；Nesvera等，細(xì)菌學(xué)雜志179，1525-1532(1997))，質(zhì)粒pAG1的四環(huán)素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文庫(kù)，登記號(hào)AF121000)，質(zhì)粒pMB1(Sutcliffe，關(guān)于定量生物學(xué)的冷泉港討論會(huì)43，77-90(1979))的復(fù)制起點(diǎn)oriV，包括lac啟動(dòng)子及多克隆位點(diǎn)(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和質(zhì)粒RP4(Simon等，(1983)生物/技術(shù)1784-791)的mob區(qū)域。將此構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α中(Brown編輯，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，生物科學(xué)出版社，英國(guó)牛津，1991)。通過將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補(bǔ)加5mg/l四環(huán)素的LB平板(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測(cè)。
此質(zhì)粒稱為pEC-T18mob2并示于圖1。其以大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM 13244。
1.2制備質(zhì)粒pEC-T18mob2zwf谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因，首先利用以下寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增zwf正向引物5’-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3’zwf反向引物5’-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3’PCR反應(yīng)在存在200μM脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)的情況下進(jìn)行30次循環(huán)，用1μM相應(yīng)的寡核苷酸，100ng谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，1/10體積的10倍反應(yīng)緩沖液和2.6單位的熱穩(wěn)定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(RocheDiagnostics的膨脹高保真PCR系統(tǒng)，德國(guó)曼海姆)，在熱循環(huán)儀(PTC-100，MJ研究公司，美國(guó)Watertown)中，在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)94℃30秒，64℃1分鐘，68℃3分鐘。
接著將大約1.8kb的擴(kuò)增的片段，借助于SureClone連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，根據(jù)說明書連接于載體pUC18的SmaI切割位點(diǎn)中。用全部連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αmcr(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1990)874645-4649)。在含有50μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板上，借助于其羧芐青霉素抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從7個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過限制分析檢測(cè)作為插入體的1.8kb的PCR片段的存在情況。以此方式形成的重組質(zhì)粒在下文稱為pUC18zwf。
為構(gòu)建pEC-T18mob2zwf，將pUC18zwf用KpnI和SalI消化，并借助于Macherey-Nagel(Duren，德國(guó))的NucleoSpin提取試劑盒，根據(jù)說明書分離產(chǎn)物，然后與已用KpnI和SalI酶切并去磷酸化的載體pEC-T18mob連接。用全部連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αmcr(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1990)874645-4649)。在含有5μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂平板上，借助于其四環(huán)素抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從12個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過限制分析檢測(cè)作為插入體的1.8kb的PCR片段的存在情況。以此方式分離的重組質(zhì)粒之一稱為pEC-T18mob2zwf(圖2)。
實(shí)施例2制備具有擴(kuò)增的zwf基因的氨基酸生產(chǎn)菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌DSM5715見于EP-B-0435132所述，生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株黃色短桿菌DSM5399見于EP-B-0385940所述。這兩個(gè)菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約均保藏在德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)中心(Braunschweig，德國(guó))。
2.1制備菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf通過Lieb1等所述的電穿孔方法(FEMS微生物通信，53299-303(1989))用質(zhì)粒pEC-T18mob2zwf轉(zhuǎn)化菌株DSM5715和DSM5399。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-tryptone，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-瓊脂，并已補(bǔ)加5mg/l四環(huán)素的LBHIS瓊脂上，選擇轉(zhuǎn)化體。在33℃溫育2天。
用常規(guī)方法(Peters-Wendish等，1998，微生物學(xué)144，915-927)從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI酶切，并隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查質(zhì)粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf。
2.2制備L-蘇氨酸將實(shí)施例2.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399/pEC-T18mob2zwf，在適于生產(chǎn)蘇氨酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中蘇氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/lBacto-肽胨10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/l
MnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測(cè)定在660nm波長(zhǎng)的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定蘇氨酸生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表1。
表1
2.3制備L-賴氨酸將實(shí)施例2.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIII
NaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測(cè)定在660nm波長(zhǎng)的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表2。
實(shí)施例3谷氨酸棒桿菌菌株AS019基因文庫(kù)的構(gòu)建用λZap ExpressTM系統(tǒng)(Short等，(1988)核酸研究，167583-7600)構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌菌株AS019(Yoshihama等，細(xì)菌生物學(xué)雜志162，591-597(1985))的DNA文庫(kù)，如O′Donohue所述(O′Donohue，M.(1997)，谷氨酸棒桿菌四種常見芳香族氨基酸生物合成基因的克隆與分子分析，博士論文，國(guó)立愛爾蘭大學(xué)，Galway)。λZap ExpressTM系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，LaJolla，California 92037)并按說明書使用。AS019-DNA用限制性內(nèi)切酶Sau3A消化后連接到用BamHI消化并去磷酸化的λZap ExpressTM臂上。
實(shí)施例4pgi基因的克隆和測(cè)序1.克隆將攜帶如Kupor和Fraenkel所述的pgi和pgl基因中的突變的大腸桿菌菌株DF1311(細(xì)菌學(xué)雜志1001296-1301(1969))，用實(shí)施例3所述的大約500ng的AS019λZap ExpressTM質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化。在含有50mg/l卡那霉素的M9基本培養(yǎng)基(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))上，在37℃溫育48小時(shí)選擇轉(zhuǎn)化體。根據(jù)Birnboim和Doly所述(核酸研究71513-1523(1979))從一個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并稱為pAMC1(圖3)。
2.測(cè)序通過Sanger等的方法(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)74，5463-5467(1977))，用經(jīng)有色熒光標(biāo)記而差示標(biāo)記的引物，對(duì)pAMCl中克隆的插入體進(jìn)行序列分析，使用的是Perkin Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng)的ABI prism 310遺傳分析儀(Perkin Elmer公司，Norwalk，Connecticut，美國(guó))，和也是Perkin Elmer的ABI prism Big DyeTM終止循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒。
用得自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，AL1 3AW，英國(guó))的通用正向和M13反向引物，進(jìn)行初始序列分析通用正向引物GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CM13反向引物GGA AAC AGC TAT GAC CAT G接著從所得序列中設(shè)計(jì)內(nèi)部引物，以推導(dǎo)完整pgi基因。內(nèi)部引物的序列如下內(nèi)部引物1GGA AAC AGG GGA GCC GTC內(nèi)部引物2TGC TGA GAT ACC AGC GGT所得的序列在蘋果麥金托什計(jì)算機(jī)上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究161829-1836)進(jìn)行分析。這一程序可以進(jìn)行限制性位點(diǎn)使用、開放讀框分析和密碼子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，253389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之間進(jìn)行查詢。DNA和蛋白質(zhì)序列比較使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1988基因73237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO1所示。對(duì)所得核苷酸序列分析揭示-1650個(gè)堿基對(duì)的開放讀框，命名為pgi基因，其編碼一個(gè)550個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例5制備整合載體以整合誘變pgi基因用分離自谷氨酸棒桿菌AS019(Heery和Dunican，(1993)，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)59791-799)的基因組DNA作模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增pgi基因的內(nèi)部區(qū)段。使用的pgi引物是正向引物ATG GAR WCC AAY GGH AA反向引物YTC CAC GCC CCA YTG RTC其中R＝A+G；Y＝C+T；W＝A+T；H＝A+T+C。
PCR參數(shù)如下35次循環(huán)94℃1分鐘47℃1分鐘72℃30秒1.5mM MgCl2大約150-200ng DNA模板將所得PCR產(chǎn)物克隆入商購(gòu)自Promega公司(Promega UK，Southampton)的pGEM-T載體中，用大腸桿菌菌株JM 109(Yanisch-Perron等，1985，基因33103-119)作宿主。PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ ID NO3。然后將克隆的插入體用EcoRI酶切為片段，并連接于用EcoRI預(yù)處理的質(zhì)粒pBGS8(Spratt等，基因41337-342(1986))。所用限制酶得自英國(guó)Boehringer Mannheim公司(Bell Lane，Lews East Sussex BN7 1LG，英國(guó))并根據(jù)說明書使用。然后用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在補(bǔ)加1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，0.02％XGAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷)和50mg/l卡那霉素的Luria瓊脂上選擇電轉(zhuǎn)化體。將瓊脂板在37℃溫育12小時(shí)。從一個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過用EcoRI，BamHI和SalI進(jìn)行限制酶分析鑒定，稱為pMC1(圖4)。
質(zhì)粒pMC1以大腸桿菌菌株DH5α/pMC1形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM12969。
實(shí)施例6在生產(chǎn)賴氨酸的DSM5715中整合誘變pgi基因?qū)?shí)施例5中所述的載體pMC1，通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，123343-347(1994))，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715是一種AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌。載體pMC1在DSM5715中不能獨(dú)立復(fù)制，并只有已整合入DSM5715的染色體中時(shí)，才在細(xì)胞中保留。通過將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇具有整合入染色體的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB瓊脂已補(bǔ)加15mg/l卡那霉素。為檢測(cè)整合情況，將內(nèi)部pgi片段(實(shí)施例5)用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒，通過Boehringer Mannheim GmbH的“進(jìn)行濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導(dǎo)”(Mannheim，德國(guó)，1993)進(jìn)行標(biāo)記。轉(zhuǎn)化體的染色體DNA是通過Eikmanns等的方法(微生物學(xué)1401817-1828(1994))分離的，并分別用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并在68℃用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒雜交。以此方式發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pMC1插入菌株DSM5715的染色體pgi基因中。此菌株稱為DSM5715∷pMC1。
實(shí)施例7過表達(dá)zwf基因同時(shí)消除pgi基因?qū)嚢彼嶂苽涞淖饔?.1制備菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf將實(shí)施例1.2所述載體pEC-T18mob2zwf，通過Tauch等的電穿孔方法(1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信123343-347)，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715∷pMC1中。將電穿孔混合物鋪板于已補(bǔ)加15mg/l卡那霉素和5mg/l四環(huán)素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，并通過限制酶KpnI和SalI處理及隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。此菌株稱為DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf。
7.2制備賴氨酸將實(shí)施例7.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l
生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測(cè)定在660nm波長(zhǎng)的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表3。
表3
實(shí)施例8制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒文庫(kù)如Tauch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國(guó)曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體Super Cosl(Wahl等，(1987)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)842160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述XbaI編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進(jìn)噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細(xì)菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫(kù)的感染和滴定，細(xì)胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實(shí)施例9poxB基因的分離與測(cè)序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號(hào)27106，Qiagen，Hilden，德國(guó))根據(jù)廠商指導(dǎo)分離單個(gè)菌落的粘粒DNA(實(shí)施例7)，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述Sau3AJ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學(xué)，德國(guó)曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號(hào)20021，Qiagen，Hilden，德國(guó))分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號(hào)K2500-01)的測(cè)序載體pZero-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號(hào)27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測(cè)序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號(hào)900200，Qiagen，Hilden，德國(guó))進(jìn)行。測(cè)序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測(cè)序試劑盒”(產(chǎn)品號(hào)403044，Weiterstadt，德國(guó))，在帶有購(gòu)自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國(guó))的“ABI Prism377”測(cè)序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(29∶1)(產(chǎn)品號(hào)A124.1，Roth，Karlsruhe，德國(guó))中，進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對(duì)“國(guó)家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，對(duì)該核苷酸序列的分析顯示一1737堿基對(duì)的開放讀框，其被稱為poxB基因，poxB基因編碼579個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。
實(shí)施例10制備整合載體以整合誘變poxB基因從菌株ATCC13032中，通過Eikmanns等所述方法(微生物學(xué)1401817-1828(1994))分離染色體DNA?；趶膶?shí)施例8中已知的谷氨酸棒桿菌的poxB基因序列，選擇以下寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)poxBint15’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’poxBint25’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’所示引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國(guó))合成的，通過Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方案，方法指導(dǎo)和應(yīng)用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，分離大約0.9kb的DNA片段，其攜帶poxB基因的內(nèi)部片段，并如SEQ ID NO6所示。
將擴(kuò)增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，美國(guó)；Catalogue Number K4500-01)，連接在載體pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技術(shù)9657-663)中。然后將連接混合物電穿孔入大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓DC，美國(guó)，1985)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，所用LB瓊脂已補(bǔ)加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制酶EcoRI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測(cè)。此質(zhì)粒稱為pCR2.1poxBint(圖5)。
質(zhì)粒pCR2.1poxBint以大腸桿菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ；Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM13114。
實(shí)施例11在賴氨酸生產(chǎn)菌DSM5715中整合誘變poxB基因?qū)?shí)施例10中所述的載體pCR2.1poxBint，通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，123343-347(1994))，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715是一種AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌。載體pCR2.1poxBint在DSM5715中不能獨(dú)立復(fù)制，并只有已整合入DSM5715的染色體中時(shí)，才在細(xì)胞中保留。通過將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇具有整合入染色體的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB瓊脂已補(bǔ)加15mg/l卡那霉素。為檢測(cè)整合情況，將poxBint片段用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒，通過Boehringer Mannheim GmbH的“進(jìn)行濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導(dǎo)”(Mannheim，德國(guó)，1993)進(jìn)行標(biāo)記。潛在整合子的染色體DNA是通過Eikmanns等的方法(微生物學(xué)1401817-1828(1994))分離的，并分別用限制酶SalI，SacI和HindlII酶切。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并在68℃用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒雜交。實(shí)施例9中所述的質(zhì)粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715染色體的染色體poxB基因內(nèi)。此菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint。
實(shí)施例12過表達(dá)zwf基因同時(shí)消除poxB基因?qū)嚢彼嶂苽涞淖饔?2.1制備菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf通過Libel等所述電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，53299-303(1989))，將菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用質(zhì)粒pEC-T18mob2zwf轉(zhuǎn)化。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-瓊脂，并補(bǔ)加5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上，選擇轉(zhuǎn)化體。在33℃溫育2天。
通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物學(xué)144，915-927)從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI酶切，并通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)此質(zhì)粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf。
12.2制備L-賴氨酸將實(shí)施例12.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33C在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿)5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l
生物素(過濾滅菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測(cè)定在660nm波長(zhǎng)的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表4。
表4
序列表<110>德古薩-于樂斯股份公司國(guó)立愛爾蘭大學(xué)戈?duì)栱f分校于利希研究中心有限公司<120>用zwf基因發(fā)酵制備L-氨基酸的方法<130>990239BT<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2811<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(373)..(2022)<223>Pgi<400>1aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp15 10att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac459Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn15 20 25ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc507Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala30 35 40 45gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag555Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys50 55 60aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa603
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ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt 2042Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa 2102tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg 2162ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc 2222tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc 2282catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat 2342ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc 2402tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt 2462ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca 2522tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc 2582ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc 2642gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg 2702gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc 2762aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc 2811<210>2<211>550<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr1 5 10 15Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala20 25 30Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr35 40 45Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu50 55 60Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly65 70 75 80Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn85 90 95Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu100 105 110
Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu115 120 125Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn130 135 140Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly145 150 155 160Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg165 170 175Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp180 185 190Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr195 200 205Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser210 215 220Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu225 230 235 240Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val245 250 255Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp260 265 270Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met275 280 285Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His290 295 300Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro305 310 315 320Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala325 330 335Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala340 345 350Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His355 360 365Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly370 375 380Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln385 390 395 400Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys405 410 415Gln Asn Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser420 425 430
Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu435 440 445Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val450 455 460Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr465 470 475 480Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met485 490 495Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val500 505 510Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly515 520 525Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys530 535 540Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550<210>3<211>462<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<400>3atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt 360accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc 420gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa462<210>4<211>2160<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(327)..(2063)<223>poxB<400>4ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180
gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu1 5att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg401Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val10 15 20 25ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att449Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile30 35 40gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt497Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly45 50 55gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt545Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys60 65 70ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga593Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg75 80 85aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag641Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln90 95 100 105att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag689Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys110 115 120gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa737Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu125 130 135cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg785Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val140 145 150tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac833Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp155 160 165ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc881Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe170 175 180 185ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct929Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala190 195 200aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg977Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala
205 210 215cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg1025Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala220 225 230ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc1073Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly235 240 245atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag1121Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu250 255 260 265gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc1169Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe270 275 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile285 290 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala300 305 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser315 320 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330 335 340 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro350 355 360gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg1457Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val365 370 375ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc1505Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile380 385 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly395 400 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410 415 420 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met430 435 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag1697
Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys445 450 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met460 465 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn475 480 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490 495 500 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro510 515 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile525 530 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala540 545 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala555 560 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct 2160<210>5<211>579<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>5Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln1 5 10 15Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile20 25 30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn35 40 45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly50 55 60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu
65 70 75 80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala85 90 95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln100 105 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu115 120 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile130 135 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr165 170 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala180 185 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys195 200 205Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu210 215 220Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile225 230 235 240Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr245 250 255Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu260 265 270Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala275 280 285Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys290 295 300Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro305 310 315 320His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys325 330 335Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn340 345 350Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu355 360 365Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met370 375 380
Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg385 390 395 400Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro405 410 415His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala420 425 430Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr435 440 445Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser450 455 460Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu465 470 475 480Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala485 490 495Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu500 505 510Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile515 520 525Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu530 535 540Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly545 550 555 560Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile565 570 575Pro Thr Pro<210>6<211>875<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<400>6tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720
attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840cgccacggca cgatggetaa tgcgttgcet catgc87權(quán)利要求
1.棒狀細(xì)菌的zwf基因，其中所述zwf基因編碼一種具有葡糖-6-磷酸脫氫酶活性的多肽，其中所述多肽包括如下N-末端氨基酸序列Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp。
2.權(quán)利要求1的zwf基因，所述zwf基因通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增由谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032獲得，所述聚合酶鏈反應(yīng)使用如下寡核苷酸作為引物zwf正向引物5’-TCG ACG CGG TTC TGG AGC-3’zwf反向引物5’-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3’。
3.棒狀細(xì)菌，其中zwf基因被擴(kuò)增，所述zwf基因編碼一種具有葡糖-6-磷酸脫氫酶活性的多肽，其中所述多肽包括如下N-末端氨基酸序列Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu ArgAsp。
4.權(quán)利要求3的棒狀細(xì)菌，其中所述zwf基因通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增由谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032獲得，所述聚合酶鏈反應(yīng)使用如下寡核苷酸作為引物zwf正向引物5’-TCG ACG CGG TTC TGG ACG AG-3’zwf反向引物5’-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵棒狀細(xì)菌制備L－氨基酸的方法，其包括進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L－氨基酸的細(xì)菌，該細(xì)菌中至少zwf基因是擴(kuò)增的，b)濃縮培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L－氨基酸，及c)分離產(chǎn)生的L－氨基酸。
文檔編號(hào)C12P13/08GK101029310SQ20061016247
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2000年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者凱文·伯克, 赫爾曼·扎姆, 洛塔爾·埃格林, 貝恩德·莫里茨, L·K·杜尼肯(死亡), 阿什令·麥科麥克, 克里奧娜·斯特普爾頓, 貝蒂娜·默克爾, 格奧爾格·蒂爾巴赫 申請(qǐng)人:德古薩股份公司, 于利希研究中心有限公司, 國(guó)立愛爾蘭大學(xué)