專利名稱：：改進(jìn)的聚合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及聚合酶，更具體地涉及經(jīng)修飾的DNA聚合酶，其具有對(duì)DNA的親和力，從而所述聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中，并能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物。本發(fā)明的范圍中還包括使用所述經(jīng)修飾的聚合酶用于測(cè)序尤其是在聚簇陣列中的方法。
背景技術(shù)：
：某些DNA聚合酶的三維晶體結(jié)構(gòu)顯示為三個(gè)單獨(dú)的亞結(jié)構(gòu)域，稱為掌(palm)、指(finger)和拇指(thumb)(Joyce,C.M.和Steiz，T.A.(1994)FunctionandstructurerelationshipsinDNApolymerases,Annu.Rev.Biochem.,63，777-822)，每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域在DNA癥合期間均發(fā)揮關(guān)鍵作用。已發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶的C端拇指結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合和持續(xù)合成能力相關(guān)(Doublie等1998.Nature391,251;Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371)。DNA聚合酶這一區(qū)域中的殘基與"引物:模板"雙鏈體相互作用。通過(guò)引入定點(diǎn)突變或者通過(guò)缺失少量氨基酸的截短來(lái)破壞這一區(qū)域的結(jié)構(gòu)已證明變體的DNA親和力和持續(xù)合成能力降低，而其他物理特性如dNTP親和力和核苷酸插入保真度則沒(méi)有重大變化(Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371;Minnick等1996.J.Biol.Chem.,271,24954;Polesky等1990.J.Biol.Chem.，265,14579)。聚合酶可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的家族，稱為A家族和B家族。對(duì)B家族聚合酶C端亞結(jié)構(gòu)域的研究不多，但相信其參與DNA結(jié)合，這主要是基于對(duì)聚合酶RB69封閉形式(與DNA結(jié)合)X射線晶體結(jié)構(gòu)的觀察。已經(jīng)在兩個(gè)B家族類別實(shí)例(即Phi29和T4)的這一拇指結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行了誘變研究。然而，這些研究?jī)H限于該結(jié)構(gòu)域中大部分氨基酸的缺失。對(duì)Klenow(A家族的聚合酶)進(jìn)行了同樣類型的缺失。就其結(jié)合和摻入dNTP的能力、該缺失對(duì)保真度的影響、其對(duì)DNA的親和力及其與輔助蛋白的相互作用來(lái)評(píng)價(jià)這些研究中變體的性能。之前還未對(duì)來(lái)自嗜熱古細(xì)菌(thermophilicarchaeon)聚合酶的拇指結(jié)構(gòu)域進(jìn)行過(guò)研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于聚合酶與DNA模板的緊密結(jié)合并不總是有利特性這一認(rèn)識(shí)。在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中僅需要單個(gè)核苷酸摻入事件的測(cè)序反應(yīng)中尤其是這樣。因此，對(duì)于與DNA緊密結(jié)合的聚合酶，該聚合酶參與將核苷酸摻入多個(gè)DNA鏈的能力較^J"DNA親和力較低的聚合酶變體來(lái)說(shuō)受到限制。本發(fā)明:沒(méi)計(jì)了DNA測(cè)序方法，所述方法使用在3，糖羥基中具有修飾的核苷酸類似物，從而阻斷其它核苷酸的摻入(參閱WO03/048387的實(shí)施例及其所述引用文獻(xiàn))。使用帶有3，阻斷的核苷酸允許以受控方式將連續(xù)的核苷酸摻入多核苷酸鏈中。在加入每個(gè)核苷酸后，3，阻斷的存在阻止其它核苷酸摻入所述鏈中。一旦確定了所摻入核苷酸的性質(zhì)之后，可以去除該阻斷，留下游離的3，羥基基團(tuán)用于加入下一個(gè)核苷酸。另外，在諸如涉及經(jīng)修飾核苷酸的測(cè)序反應(yīng)(如上所述，并在下文中有更詳細(xì)討論)之類的反應(yīng)中，聚合酶的緊密結(jié)合實(shí)際上可能就反應(yīng)的完成而言表現(xiàn)為某些缺點(diǎn)。例如，如果具有緊密DNA結(jié)合親和力的無(wú)活性聚合酶分子與模板DNA分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體，則該特定模板DNA分子不可能得到延伸。有了這樣的認(rèn)識(shí)，本發(fā)明提供了與模板DNA具有較弱相互作用的改變的聚合酶。因此，本發(fā)明的所述聚合酶具有改進(jìn)的能力，在反應(yīng)循環(huán)中從一個(gè)模板DNA分子移動(dòng)到另一個(gè)上。這種形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物的能力優(yōu)點(diǎn)在于可以顯著改進(jìn)在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中加入單個(gè)核苷酸的反應(yīng)的水平或^Jl完成情況。未修飾的聚合酶傾向于以高親和力與DNA結(jié)合，從而方程、聚合S+DNA聚合嘛DNA強(qiáng)烈偏移而有利于形成[Pol:DNA復(fù)合物。相反，在本發(fā)明中，所述改變的聚合酶與DNA結(jié)合得較差，意味著平衡位置向左側(cè)移動(dòng)。因此，本發(fā)明提供了改變的聚合酶，其具有降低的DNA親和力，從而該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中。"DNA模板"指可以與所述聚合酶結(jié)合并用作核酸合成模板的任何DNA分子。本文定義的"核苷酸"包括核普酸和核苷。就核苷酸而言，核苷包含通過(guò)糖普鍵與核糖或脫氧核糖連接的噪呤或嘧啶，但是它們?nèi)狈κ蛊涑蔀楹塑账岬牧姿釟埢Ｔ摱x中包括合成的和天然存在的核苷酸。該定義中包括標(biāo)記的核苷酸。該聚合酶的有利特性是由于它們對(duì)DNA模板的親和力降低，同時(shí)保持了與所摻入核苷酸的親和力和保真度。在一個(gè)優(yōu)選的方面中提供了改變的聚合酶，其對(duì)DNA的親和力降低，從而所述聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將至少一個(gè)合成核苷酸摻入多個(gè)DNA模板中。在本發(fā)明之前，從未認(rèn)識(shí)或提出過(guò)修飾聚合S^f吏之適合摻入非天然核苷酸、在降低其DNA親和力而同時(shí)保持其有利特性的問(wèn)題。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸包含在熟知的Sanger測(cè)序反應(yīng)中使用的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。這些核普酸可以是標(biāo)記的，例如用任何質(zhì)量標(biāo)記、放射性標(biāo)^己或熒光標(biāo)記進(jìn)^f于標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸包含這樣的核苷酸其在3，糖羥基處進(jìn)行了修飾，從而與對(duì)照聚合酶比較，該取代基大于天然存在的3，羥基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸包含具有嘌呤或嘧咬堿基以及核糖或脫氧核糖糖部分的核苷酸，該糖部分具有與其共價(jià)連接的可去除的3'-OH阻斷基團(tuán)，從而3，碳原子連接在以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)上-O-Z其中Z為-C(R，)2-0-R"、-C(R，)2-N(R")2、-C(R，)2-N(H)R"、-C(R，)2-S-R"和-C(R，)2-F中的任何一種，其中每個(gè)R"為可去除的保護(hù)基團(tuán)或其部分；每個(gè)R，獨(dú)立地為氫原子、烷基、取代烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、統(tǒng)基、氰基、烷氧基、芳氡基、雜芳氡基或M，或通過(guò)連接基連接的檢測(cè)標(biāo)記；或者(R，)2代表式為二C(R，，，)2的亞烷基，其中每個(gè)R"，可以是相同的或不同的，并且選自氫、閨素原子和烷基；并且其中所述分子可以反應(yīng)生成中間體，其中每個(gè)R"替換為H，或者當(dāng)Z為-C(R，)2-F時(shí)，F(xiàn)替換為OH、SH或NH2，優(yōu)選OH,所述中間體在水性M下解離以提供帶有游離3'OH的分子；其滿足以下條件當(dāng)Z為-C(R，)2-S-R，，時(shí)，兩個(gè)R，基團(tuán)不全是H。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)本發(fā)明聚合酶摻入的核苷或核苷酸包含嘌呤或嘧咬堿基以及核糖或脫氧核糖糖部分，該糖部分具有與其共價(jià)連接(優(yōu)選在3，0位置)的阻斷基，所述阻斷基使所述分子可用于需要阻斷3'-OH基團(tuán)以阻止摻入其他核苷酸的技術(shù)中，例如在測(cè)序反應(yīng)、多核苷酸合成、核酸擴(kuò)增、核酸雜交分析、單核苷酸多態(tài)性研究及其它此類技術(shù)。一旦去除所述阻斷基，便可能將另一個(gè)核苷酸摻入到游離的3'-OH基團(tuán)上。優(yōu)選的經(jīng)修飾核苷酸在SolexaLimited名下的國(guó)際專利申請(qǐng)7>布號(hào)WO2004/018497中有舉例，所述參考文獻(xiàn)以其整體并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾核苷酸或核香的R，基團(tuán)是烷基或取代烷基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾核苷酸或核苷的-Z基團(tuán)的式為-C(R')2-N3。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾核苦酸或核苷包含Z基團(tuán)，所述Z基團(tuán)為疊氮基曱基基團(tuán)。如下所詳述的，本發(fā)明的優(yōu)選聚合酶特別優(yōu)選用于摻入其中Z為疊氮基甲基基團(tuán)的核苷酸類似物。所述經(jīng)修飾核苷酸可通it^由期望的接頭與檢測(cè)標(biāo)記連接，其中所述標(biāo)記可以是例如熒光團(tuán)。需要時(shí)，所述檢測(cè)標(biāo)記也可以摻入式"Z，，的阻斷基中。所述接頭可以是酸不穩(wěn)定的、光不穩(wěn)定的或者含有二硫鍵。本發(fā)明可使用其它連接，尤其是可被磷化氫切割的含有疊氮化物的接頭，如WO2004/018497中的詳細(xì)描述，其內(nèi)容以其整體并入本文。優(yōu)選的標(biāo)記和連接包括WO03/048387公開的標(biāo)記和連接。此參考文獻(xiàn)以其整體并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的核香酸或核苷具有通過(guò)可切割的接頭與檢測(cè)標(biāo)記連接的堿基，其特征在于所述可切割接頭含有選自以下的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(其中X選自包括以下的集合O、S、NH和NQ，其中Q為Cw。的取代或未取代的烷基，Y選自O(shè)、S、NH和N(烯丙基)，T為氫或Cwo的取代或未取代烷基，*表示該部分與核苷酸或核苷的其它部分相連的位置)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)標(biāo)記包含熒光標(biāo)記。合適的熒光團(tuán)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種不同的核苷酸類型帶有不同的熒光標(biāo)記。這有利于識(shí)別和摻入特定的核苷酸。因此，例如4務(wù)飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧咬都與各自的熒光團(tuán)結(jié)合，從而容易地將它們彼此進(jìn)行區(qū)分。令人驚奇地，已發(fā)現(xiàn)改變的聚合酶能夠摻入帶有多種不同熒光標(biāo)記的^務(wù)飾核苷酸類似物。而且，所述聚合酶能摻入所有四種威基。就本發(fā)明聚合酶在核酸測(cè)序方案中的用途而言，這些特性提供了重要的優(yōu)勢(shì)。如上所述，優(yōu)選的核苷酸類似物包括在3'位置包含O-疊氮曱基功能性的核苦酸類似物。應(yīng)該理解，對(duì)于其它核苷酸類似物來(lái)"^兌，顯著影響DNA結(jié)合的C端拇指亞結(jié)構(gòu)域區(qū)域中的優(yōu)選聚合酶M酸序列可以為了實(shí)現(xiàn)最佳摻入而有所改變。對(duì)于任何給定的核苷酸類似物，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定C末端拇指亞結(jié)構(gòu)區(qū)域(例如在RB69中的Lys7卯、800、844、874、878和Arg806殘基，以及在9°N聚合酶中的Arg743、Arg713和Lys705殘基，下文將有更詳細(xì)的討論)中最佳的序列偏好，例如構(gòu)建文庫(kù)或離散數(shù)(discretenumber)的突變體，之后在摻入測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)試各個(gè)變體。如上所提及的，本發(fā)明的改變聚合酶能夠改善所有核苷酸的摻入，包括多種具有不同尺寸和多種化學(xué)性質(zhì)的大3，取代基的修飾核苷酸。所述聚合酶的有利特性是由于其對(duì)DNA模板的親和力降低，導(dǎo)致該聚合酶與DNA的解離增加，而不對(duì)與摻入核苷酸的親和力和保真度產(chǎn)生不利影響。由于本發(fā)明聚合酶的DNA結(jié)合親和力降低，因此能夠在單個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將一個(gè)或多個(gè)核苷酸摻入若干不同的DNA分子中。因此提高了反應(yīng)的總體效率，引起完成水平的提高。"反應(yīng)循環(huán)"指允許核苷酸摻入模板中的適當(dāng)反應(yīng)時(shí)間段。單個(gè)反應(yīng)循環(huán)的示例性條件為一個(gè)30分鐘、45°C孵育的時(shí)間段。許多聚合反應(yīng)在過(guò)量于聚合酶的DNA存在下發(fā)生。本發(fā)明的聚合酶使這樣的聚合反應(yīng)更加有效地進(jìn)行，因?yàn)樵摼酆厦缚梢栽诜珠_的模板DNA分子上催化多輪核苦酸摻入。另一方面，未改變的聚合酶特別是與DNA結(jié)合更為緊密的聚合酶不具備這種能力，因?yàn)樗诿總€(gè)反應(yīng)循環(huán)中更可能只在單個(gè)模板上參與核苷酸摻入。本發(fā)明的聚合酶允許在就DNA濃度而言，聚合酶濃度為限制性的條件下實(shí)現(xiàn)高水平的反應(yīng)完成。具體地，所述聚合酶在DNA:聚合酶比為至少約2:1、3:1或5:1的條件下表現(xiàn)出提高的將一個(gè)或多個(gè)核苷酸摻入分開的DNA分子的能力。然而，在高聚合酶濃度下，該提高可能被掩蓋。因此，改變的聚合酶具有對(duì)DNA的親和力，從而該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物。本發(fā)明聚合酶的改進(jìn)特性可以與適當(dāng)?shù)膶?duì)照進(jìn)行比較。本文定義的"對(duì)照聚合酶"定義為改變聚合酶的活性與其進(jìn)行比較的聚合酶。對(duì)照聚合酶與改變聚合酶為同樣的類型，但是不帶有降低聚合酶對(duì)DNA的親和力的改變。因此，在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶為9°N聚合酶，所述修飾聚合酶為同一9°N聚合酶，只是存在降低9°N聚合酶與DNA的親和力的一種或多種4務(wù)飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶為野生型聚合酶，對(duì)其進(jìn)行改變以提供改變的聚合酶，所述改變聚合酶可以直接與未改變的聚合酶進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶在與9。NDNA聚合酶M酸序列中Leu408、Tyr409和Pro410功能等價(jià)的位置上包含替換突變。因此，在該實(shí)施方案中，該對(duì)照聚合酶具有以下替換突變第408位從亮氨酸替換為不同的氨基酸，第409位從酪氨酸替換為不同的氨基酸以及第410位從脯氨酸替換為不同的氨基酸；或者，如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時(shí)則在功能等價(jià)的位置上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶在9°NDNA聚合酶JL^酸序列中包含與Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val功能等價(jià)的替換突變。因此，在該實(shí)施方案中，該對(duì)照聚合酶帶有以下替換突變第408位從亮氨酸替換為酪氨酸，第409位從酪氨酸替換為丙氨酸以及第410位從脯氨酸替換為纈氨酸；或者，如果該聚合酶不是9。NDNA聚合酶時(shí)則在功能等價(jià)的位置上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶為包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。所述對(duì)照聚合酶還可以在與9°NDNA聚合酶M酸序列中Cys223功能等價(jià)的位置上包含替換突變。因此，在該實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶帶有第223位從半胱氨酸替換為不同的氨基酸的替換突變，或者如果該聚合酶不是9。NDNA聚合酶時(shí)則在功能等價(jià)的位置上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該對(duì)照聚合酶是包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該對(duì)照聚合酶包含與9°NDNA聚合酶^J^酸序列中Cys223Ser功能等價(jià)的替換突變。因此，在該實(shí)施方案中，所述對(duì)照聚合酶具有第223位從半胱氨酸替換為絲氨酸的替換突變，或者如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時(shí)則在功能上等同的位置上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該對(duì)照聚合酶是包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。優(yōu)選地，所述對(duì)照聚合酶是包含上述突變的組合的9°NDNA聚合酶。所述聚合酶一般具有降低的DNA親和力。這可以通過(guò)解離常數(shù)來(lái)定義。因此，野生型聚合酶傾向于具有納摩爾-皮摩爾范圍內(nèi)的解離常數(shù)。就本發(fā)明目的而言，與對(duì)照未改造聚合酶相比具有降低的DNA親和力的聚合酶是適合的。優(yōu)選的，由于所述改變，該聚合酶的解離常數(shù)與對(duì)照未改造聚合酶相比提高至少或大約2倍、3倍、4倍或5倍。"功能等價(jià)，，指氨基酸替換認(rèn)為在另一聚合酶中與所述酶功能相同的氨基酸位置上發(fā)生。例如，VentDNA聚合酶中第412位從酪氨酸替換為纈氨酸的突變(Y412V)與9。N聚合酶中第409位從酪氨酸替換為纈氨酸的替換(Y409V)功能等價(jià)。認(rèn)為該氨基酸殘基的體積是作為阻斷核苷酸糖的2，-鞋基iiA結(jié)合位點(diǎn)的"立體閘門(stericgate)"。同樣地，認(rèn)為Vent聚合酶中的488位殘基與9°N聚合酶中485位氨基酸等價(jià)，從而認(rèn)為Vent中488位從丙氨酸變?yōu)榱涟彼岬耐蛔?A488L)與9°N聚合酶中A485L突變等價(jià)。通常地，兩個(gè)或多個(gè)不同聚合酶中功能等價(jià)的替換突變發(fā)生在這些聚合酶的AJ^酸序列中同源的M酸位置上。因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)"功能等價(jià)"也包括與給定的突變"位置等價(jià)"或"同源"的突變，而不管該突變氨基酸的具體功能是否已知?；谛蛄斜葘?duì)和/或分子建模有可能鑒定兩個(gè)或多個(gè)不同聚合酶的M酸序列中位置等價(jià)或同源的氛基酸殘基。所述改變聚合酶一般是"分離的"或"純化的"多肽。"分離的多肽"指基本上與污染細(xì)胞組分分離的多肽，所述污染細(xì)胞組分為例如可與所述多肽天然相關(guān)的碳7jC化合物類、脂類、核酸類或其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)。一般地，分離聚合酶的制備物包含高度純化形式的所述聚合酶，即至少約80%的純度，優(yōu)選至少約90%的純度，更優(yōu)選至少約95%的純度，更優(yōu)選至少約98%的純度并且最優(yōu)選至少約99%的純度。所述酶制備物的純度可通過(guò)例如在標(biāo)準(zhǔn)SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠上出現(xiàn)單一條帶來(lái)評(píng)估。所述改變聚合酶可以是"重組，，多肽。本發(fā)明的改變聚合酶可以是任何DNA聚合酶。更具體地，所述改變的聚合酶可以是B家族類型的DNA聚合酶，或者其突變體或變體。B家族DNA聚合酶包括許多古細(xì)菌DNA聚合酶，人DNA聚合酶a以及T4、RB69和(J)29噬菌體DNA聚合酶。對(duì)這些聚合酶的研究弱于包含諸如7i^和T7DNA聚合酶之類聚合酶的A家族聚合酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶選自任何B家族古細(xì)菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶a或T4、RB69和小29噬菌體DNA聚合酶。所述古細(xì)菌DNA聚合酶在許多情況中來(lái)自超嗜熱古細(xì)菌(hyperthermophilicarchea)，這意味著該聚合酶常常是熱穩(wěn)定性的。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶是嗜熱古細(xì)菌聚合酶，并優(yōu)選地選自Vent、DeepVent、9°N和Pfu聚合酶。Vent和DeepVent分別是分離自超嗜熱古細(xì)菌TT^nnococcws//似rafc和激烈熱球菌(i^racoccMS/im'os"s)的B家族DNA聚合酶的商品名。9°N聚合酶也鑒定自TT^twococcmsw。Pfu聚合酶分離自激烈熱球菌。如上所述，在本發(fā)明之前尚未研究過(guò)嗜熱聚合酶的拇指結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明中最優(yōu)選的聚合酶是9°N聚合酶，包括其突變體和變體。9°N聚合酶不需要輔助蛋白。這與先前研究過(guò)的聚合酶相反，在所述聚合酶中拇指結(jié)構(gòu)域的缺失顯示出對(duì)與輔助蛋白之間相互作用的不利影響，而不改變?cè)摼酆厦傅钠渌匦?。相反地，如下文?shí)驗(yàn)章節(jié)中所示，9°N中大量殘基的缺失對(duì)于9°N的重要特性具有顯著的不利影響，從而使催化活性嚴(yán)重受損。應(yīng)該理解，本發(fā)明并不旨在限于B家族聚合酶的突變體或變體。所述改變的聚合酶也可以是a家族聚合酶或其突變體或變體，例如r"《或T7DNA聚合酶的突變體或變體，或既不屬于A家族也不屬于B家族的聚合酶，例如逆轉(zhuǎn)錄酶。然而，如本文所述的原因，B家族聚合酶是特別優(yōu)選的。本發(fā)明考慮使聚合酶由于DNA親和力降低而表現(xiàn)出所需的特性的多種不同類型的改變。雖然添加和缺失突變也可以產(chǎn)生有用的聚合酶，但是特別優(yōu)選在所述聚合酶的原始M酸序列中進(jìn)行替換突變。適當(dāng)?shù)母淖兗夹g(shù)如定點(diǎn)誘變是本領(lǐng)域公知的。因此，"改變的聚合酶"指與對(duì)照聚合酶相比具有至少一個(gè)氨基酸改變的聚合酶。通常，這種改變包括至少將一個(gè)^酸替換成其他氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些改變是非保守性改變，盡管本發(fā)明也考慮可以維持蛋白質(zhì)的總體電荷分布的保守性改變。而且，本發(fā)明的預(yù)期中包括所述聚合酶序列中的修飾可以是蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氛基酸的缺失或添加，只要得到的聚合酶與對(duì)照聚合酶相比具有降低的DNA親和力以及在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成本發(fā)明聚合酶的改變包含所述聚合酶殘基中的至少一種突變，優(yōu)選至少一種替換突變，所述突變使該聚合酶與DNA的相互作用不穩(wěn)定。因此，得到的聚合酶以較不穩(wěn)定的方式與DNA相互作用。如上所述，該聚合酶對(duì)DNA親和力的降低使其在單個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將一個(gè)或多個(gè)核苷酸摻入若干不同DNA分子中。因此，反應(yīng)的總體效率得到提高，引^^應(yīng)完成水平的提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改變包括所述聚合酶中與DNA結(jié)合的殘基處至少一種突變，優(yōu)選至少一種替換突變?？梢愿鶕?jù)適當(dāng)聚合酶的可用晶體結(jié)構(gòu)選捧用于突變的適當(dāng)靶殘基，特別是在以封閉狀態(tài)(與DNA結(jié)合)結(jié)晶時(shí)。通過(guò)減少與DNA結(jié)合接觸的數(shù)目，可以實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合親和力的總體降低。因此，所得的聚合酶在核香酸摻7^應(yīng)中表現(xiàn)出的改進(jìn)的特征，在所述核苷酸摻入反應(yīng)中與DNA的緊密結(jié)合是不利的。以相似的方式，所述聚合酶也可以帶有包含這樣的改變其包含所述聚合酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的戎基處的至少一種突變，優(yōu)選至少一種替換突變。同樣，預(yù)計(jì)這樣的突變降低所述改變聚合酶的DNA結(jié)合親和力，以j吏其能夠在反應(yīng)期間更容易地與分開的模板DNA分子結(jié)合和解離。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聚合酶包含這樣的改變其包含所述聚合酶中堿性氛基酸處的至少一種突變，優(yōu)選至少一種替換突變。如本領(lǐng)域所公知，聚合酶中許多帶正電荷的氨基酸殘基與整體帶負(fù)電荷的DNA雙螺旋相互作用，尤其與DNA中核苷酸的特定磷g團(tuán)相互作用。如上所述，得到本發(fā)明聚合酶的優(yōu)選改變類型包含至少一種替換突變。如以下實(shí)驗(yàn)章節(jié)所示，在所述聚合酶^J^酸序列中缺失殘基可導(dǎo)致DNA親和力降低同時(shí)由于催化活性被破壞而不具有總體有利特性的聚合酶。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶包含兩個(gè)替換突變，也可以包含四、五、六或七個(gè)等突變，只要得到的聚合酶具有所需特性。優(yōu)選地，所述聚合酶與核苷酸的親和力基本不受所述改變的影響。如實(shí)驗(yàn)章節(jié)(尤其是實(shí)施例6)所示，有可能突變聚合酶以使其DNA親和力降低，而該聚合酶與核苷酸的親和力不受負(fù)影響，所述核苷酸可以是例如dNTP或ddNTP或其修飾形式(參見上文對(duì)核苦酸的定義)。在該上下文中，"基本不受影響"指與核普酸的親和力維持在與未改變聚合酶相同的數(shù)量級(jí)。優(yōu)選地，與核苷酸的親和力不受改變的影響。優(yōu)選地，所述聚合酶的保真復(fù)基本不受改變的影響。如實(shí)驗(yàn)章節(jié)(尤其是實(shí)施例6)所示，可以突變聚合酶以使其DNA親和力降低，同時(shí)該聚合酶的保真度基本不受該改變的影響。在該上下文中，"基本不受影響，，指每個(gè)核苷酸的誤摻入率的數(shù)量級(jí)與未改變聚合酶相同。優(yōu)選地，對(duì)核苦酸的保真度不受所述改變的影響。就具體的和優(yōu)選的結(jié)構(gòu)突變體而言，它們可以基于最優(yōu)選的聚合酶，即9°NDNA聚合酶。如下文實(shí)施例1中所述，使用對(duì)9。N-7DNA聚合酶開放形式的晶體結(jié)構(gòu)(PDB=lqht)、密切相關(guān)的DNA聚合酶RB69的開放結(jié)構(gòu)(PDB=lih7)以及RB69的封閉形式(PDB=lig9)進(jìn)行的能量最小化重疊比對(duì)(通過(guò)Cresset實(shí)現(xiàn))作為鑒定參與DNA結(jié)合的關(guān)鍵殘基的結(jié)構(gòu)才莫型。因此，改變的聚合酶在9°NDNA聚合酶M酸序列中Lys705、Arg713和/或Arg743位置或與其功能等價(jià)的位置上包含或摻入了一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)替換成不同氨基酸的M酸替換突變。優(yōu)選地，所述聚合酶為包含這些突變的9。NDNA聚合酶。所有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)突變的組合和排列均考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。基于"開放式"(即不與DNA結(jié)合)9°NDNA聚合酶結(jié)構(gòu)和與DNA結(jié)合的RB69聚合酶已知晶體結(jié)構(gòu)的比對(duì)，也可以在其它特定殘基處產(chǎn)生突變。因此，改變的聚合酶在9°NDNA聚合酶M酸序列中Arg606和/或His679位置或與其功能等價(jià)的位置上包含或摻入了一個(gè)或兩個(gè)替換成不同氨基酸的M酸替換突變。優(yōu)選地，所述聚合酶為包含這些突變的9°NDNA聚合酶。所有不同的突變的組合和排列均考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，這些突變可以與上述其它突變組合產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶在9°NDNA聚合酶M^列中Arg713或Arg743位置或與其功能等價(jià)的位置包含至少一個(gè)替換為不同氨基酸的替換突變。如下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)中更詳細(xì)的描述，這兩個(gè)位置代表了特別優(yōu)選的突變位點(diǎn)?？梢詫⑼粋€(gè)聚合酶中的這兩個(gè)殘基都突變?yōu)椴煌姆栈?。就所述不同氨基酸的性質(zhì)而言，所述替換突變或突變優(yōu)選地將4皮替換氨基酸轉(zhuǎn)換為非堿性氨基酸(即，不是賴氨酸或精氨酸)。可以選擇任何非堿性氬基酸。優(yōu)選的替換突變或突變將被替換氨基酸轉(zhuǎn)換為以下的氨基酸①酸性氬基酸，(ii)芳香氨基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性氨基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱硫氨酸(M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述替換突變或突變將替換M酸轉(zhuǎn)換為丙氨酸。在更具體的實(shí)施方案中，改變的聚合酶包含與9。NDNA聚合酶M酸序列中Lys705Ala和/或Arg713Ala和/或Arg743Ala功能等價(jià)的替換突變或突變。因此，在該實(shí)施方案中，所述聚合酶具有以下替換突變705位從賴氨酸替換為丙氨酸和/或713位^Mt氨酸替換為丙氨酸和/或743位從精氨酸替換為丙氨酸，或者如果該聚合酶不是9°NDNA聚合酶時(shí)則在功能等價(jià)的位置上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶是包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改變的聚合酶包含與Arg713Ala功能等價(jià)的氨基酸替換，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改變的聚合酶包含與Arg743Ala功能等價(jià)的M酸替換。優(yōu)選地，改變的聚合酶為9°NDNA聚合酵。特定的結(jié)構(gòu)突變體也可以基于其它類型的聚合酶，如"開放式"和"封閉式"結(jié)構(gòu)已知的RB69聚合酶。因此，改變的聚合酶在RB69DNA聚合酶^J^財(cái)列中Lys790、Lys800、Arg806、Lys844、Lys874和/或Lys878位置或與其功能等價(jià)的位置上包含或摻入了一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)替換為不同氨基酸的JL&酸替換突變。優(yōu)選地，所述聚合酶為包含這些類似的或功能等價(jià)的突變的9°NDNA聚合酶。所有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)突變的組合和排列均考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。就所述不同氨基酸的性質(zhì)而言，所述替換突變或突變優(yōu)選地將4皮替換氨基酸轉(zhuǎn)換為非堿性氨基酸(即，不是賴氨酸或精氨酸)?？梢赃x擇任何非堿性氨基酸。優(yōu)選的替換突變或突變將被替換氨基酸轉(zhuǎn)換為以下的氨基酸(i)酸性氨基酸，(ii)芳香氨基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性氨基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱硫氨酸(M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述替換突變或突變將被替換氨基酸轉(zhuǎn)換為丙氨酸。應(yīng)該注意，本發(fā)明不限于只以上述方式進(jìn)行改變的聚合酶。本發(fā)明的聚合酶可以包括^午多其他突變，例如詳細(xì)v^開于WO2005/024010的優(yōu)選的突變體聚合酶。具體地，考慮在與9°NDNA聚合酶M酸序列中Leu408和Tyr409和Pro410功能等價(jià)位置上包含替換突變的聚合酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該聚合酶為包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。在具體的實(shí)施方案中，所述聚合酶包含與9°NDNA聚合酶M^列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val中至少一種或兩種但優(yōu)選全部功能等價(jià)的替換突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶為包含所有所述替換突變的9°NDNA聚合酶。所述聚合酶還可以包含與9°NDNA聚合酶^&,列中Cys223功能等價(jià)的位置上的替換突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶為包含所述替換突變的9。NDNA聚合酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶包含與9°NDNA聚合酶M酸序列中Cys223Ser功能等價(jià)的替換突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶為包含所述替換突變的9°NDNA聚合酶。優(yōu)選地，所述聚合酶為包含上述突變組合的9°NDNA聚合酶。本發(fā)明還涉及包含SEQIDNO:1、3、5或21任一項(xiàng)所示^^酸序列、基本由上述序列組成或由上述序列組成的9。N聚合酶分子。本發(fā)明還包括僅有在物質(zhì)程度上不影響該聚合酶功能的氨基酸改變中不同于SEQIDNO:l、3、5和21所示M酸序列的聚合酶。在這種情況下，所述聚合酶的相關(guān)功能定義為DNA親和力的降低，從而該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板(與對(duì)照聚合酶比較)和/或該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物(與對(duì)照聚合酶比較)。因此，對(duì)DNA親和力降低的聚合酶變體的這種活性不重要的殘基進(jìn)行保守性替換包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以容易地測(cè)試其他突變對(duì)所述酶功能的影響，例如使用眾所周知的核苷酸摻入測(cè)定(如描述于WO2005/024010實(shí)施例中以及下文實(shí)施例3和實(shí)施例4中的測(cè)定)。本發(fā)明的改變聚合酶也可以直接用其DNA親和力的降低來(lái)定義，這與基本不改變的對(duì)核苷酸的保真度和親和力一起產(chǎn)生了與本發(fā)明聚合酶相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。因此，改變的聚合酶與DNA的解離常數(shù)(Kd)至少比未改變的對(duì)照聚合酶約高2倍、高3倍、高4倍或高5倍，或在上述范圍之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變的聚合酶在鹽溶液存在時(shí)從DNA上解離，所述鹽溶液優(yōu)選NaCl溶液，濃度低于或等于約500mM,優(yōu)選低于500mM。所述鹽溶液可以為適當(dāng)?shù)臐舛?，從而可以區(qū)分本發(fā)明親和力降低的聚合酶以及與DNA結(jié)合更為緊密的未改變聚合酶。適當(dāng)?shù)柠}溶液濃度(優(yōu)選NaCl)在約150mM、200mM、250mM、300mM或350mM、優(yōu)選200mM的范圍內(nèi)。任何適當(dāng)?shù)碾p鏈DNA分子均可用于檢測(cè)所述改變是否具有降低DNA親和力的理想效果。優(yōu)選地，與所述聚合酶解離的DNA分子包含SEQIDNo.:18公開的序列。優(yōu)選地，至少約40%、50%、60%、70。/。等的所述聚合酶將在洗滌溶液中相關(guān)的NaCl濃度下從DNA解離?？梢酝ㄟ^(guò)任何已知的方法進(jìn)行解離實(shí)驗(yàn)，例如使用詳細(xì)描述于下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)的實(shí)施例5中的洗滌測(cè)定(還可參見圖6和7)。如上所述，(優(yōu)選)實(shí)現(xiàn)DNA親和力的降低而不顯著或嚴(yán)重降低該聚合酶與核苷酸的親和力。令人驚訝的是，盡管DNA結(jié)合親和力已降低，但本發(fā)明的改變的聚合酶還可表現(xiàn)出與未修飾的聚合酶相當(dāng)?shù)幕钚裕缇蚔max而言。本發(fā)明聚合酶所表現(xiàn)出的這一令人驚訝的特性顯示在本發(fā)明某些酶的動(dòng)力學(xué)分析中，尤其是在下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)的實(shí)施例6及作為參考的圖8中。本發(fā)明的改變的聚合酶也可以直接就其M達(dá)所述聚合酶的宿主細(xì)胞純化的能力上的改善來(lái)定義。因此，由于所述改變的聚合酶的DNA親和力降低(這與基本不改變的對(duì)核苷酸的親和力和保真度一起形成了與本發(fā)明聚合酶相關(guān)的優(yōu)勢(shì))，所以該聚合酶可以更容易地進(jìn)行純化。在所述酶的純化中遺留的宿主細(xì)胞內(nèi)源DNA較少。因此，由于純化方法之后仍與所述聚合酶結(jié)合的內(nèi)源DNA較少，所以得到了更純的產(chǎn)物。該改變的聚合酶與DNA的親和力降低的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，需要較不苛刻的純化方案以提供基本上純凈的聚合酶制備物。因此，受到純化方法本身不利影響的聚合酶較少，導(dǎo)致聚合酶制備物具有較高水平的總體活性。另外，更均一的純化應(yīng)該成為可能，導(dǎo)致聚合酶各批次之間的差異降低。在純化方案中內(nèi)源DNA遺留的改善的代表性數(shù)據(jù)示于下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)的實(shí)施例7中。優(yōu)選地，在對(duì)所述聚合酶進(jìn)^f亍純化后遺留的宿主DNA為低于約60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml，更優(yōu)選低于約5ng/ml?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)純化方案，參閱如Colley等，所o/.C&附.264:17619-17622(1989);(7w/feto/V幽Viftmy贈(zèng)Vm,inM^orfs￡rt^"w/o^v，vol.182(Deutscher編輯，19卯)。因此，本發(fā)明提供了改變的聚合酶，其與DNA的親和力使得(i)該聚合酶與DNA的解離常數(shù)高出未改變的/對(duì)照聚合酶至少約為或近似為2倍、3倍、4倍或5倍；和/或(ii)當(dāng)對(duì)其應(yīng)用濃度為約200nM至500nM之間、優(yōu)選約200nM至300nM之間的氯化鈉溶液時(shí)，至少50%、60%、70%或80%的聚合酶從與其結(jié)合的DNA上解離；和/或(iii)在M達(dá)所述聚合酶的細(xì)胞中進(jìn)行純化后，低于約60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、3、1或0.5ng/ml的內(nèi)源DNA保持與聚合酶結(jié)合；所述改變不對(duì)核苷酸結(jié)合親和力或保真度產(chǎn)生顯著的不利影響，從而該聚合酶能夠(a)在一個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物(提高了反應(yīng)完成的水平)，和/或(b)催化總體水平改善(提高/升高)的核普酸摻入；尤其是在聚合酶濃度就DNA濃度而言是限制性的條件下。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的改變聚合酶的核酸分子。對(duì)于任何給定的改變聚合酶，其為氨基酸序列已知、優(yōu)選編碼該聚合酶的野生型核苷酸序列已知的聚合酶的突變體形式，可以根據(jù)分子生物學(xué)的基本原理獲得編碼該突變體的核苷酸序列。例如，假設(shè)編碼9。N聚合酶的野生型核苷酸序列已知，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼推導(dǎo)出編碼具有一個(gè)或多個(gè)M酸替換的任何9°N突變體形式的核苷酸序列。類似地，可以容易地得出來(lái)自A家族和B家族聚合酶的其它聚合酶突變體形式的核苷酸序列，所述其它聚合酶為例如VentTM、Pfu、TspJDF-3、Taq等。之后，可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建具有所需核香酸序列的核酸分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼9°N聚合酶突變體形式的核酸分子。因此，本發(fā)明提供編碼改變的9。N聚合酶的核酸分子，該核酸分子包含SEQIDNO:2、4、6、19或20中任何核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。根據(jù)本發(fā)明，確定的核酸不僅包括相同的核酸，也包括任何孩i小的堿基變化，具體地，包括在保守性U酸替換中由于簡(jiǎn)并密碼而產(chǎn)生同義密碼子(不同的密碼子代表相同的氨基酸殘基)的替換。關(guān)于堿基變化，術(shù)語(yǔ)"核酸序列"也包括任何給定單鏈序列的互補(bǔ)序列。有利地，本文所述的核酸分子也可以包括在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，以在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)其編碼的聚合酶蛋白。因此，表達(dá)載體包含SEQIDNO:2、4、6、19或20中的4壬何核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。將克隆的DNA整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中隨后用于其后轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞以及隨后選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，如Sambrook等(1989)，Molecularcloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory申所提供。這樣的表達(dá)載體包括與調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子有效連接的本發(fā)明核酸，所述調(diào)節(jié)序列能夠影響所述DNA片段的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"有效連接，，指使所述組分以其預(yù)期方式發(fā)揮作用的排列。這樣的載體可以轉(zhuǎn)化進(jìn)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，從而用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。所述核酸分子可以編碼成熟的蛋白質(zhì)或具有前體序列(prosequence)的蛋白質(zhì)，包括編碼前蛋白上前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)，所述前導(dǎo)序列其后#_宿主細(xì)胞切割以形成成熟蛋白。所述載體可以是，例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體栽體，其具有復(fù)制起點(diǎn)和任選的用于表達(dá)所述核苷酸的啟動(dòng)子以及任選的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)子。載體可以包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性基因。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括結(jié)合RNA聚合酶并且指導(dǎo)正確的轉(zhuǎn)錄起始水平的啟動(dòng)子序列，還包括用于核糖體結(jié)合的翻譯起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體可以包括啟動(dòng)子(如lac啟動(dòng)子)和用于翻譯起始的Shine-Delgarno序列以;M^始密碼子AUG。類似地，真核表達(dá)載體可以包括用于RNA聚合酶II的異源或同源啟動(dòng)子、下游聚腺苷酸化信號(hào)、起始密碼子AUG以及用于核糖體分離的終止密碼子。這樣的載體可以從商業(yè)途徑獲得，或者通過(guò)本領(lǐng)域所7>知的方法由所述序列裝配而成。通過(guò)高等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明聚合酶的DNA可以通過(guò)在載體中包括增強(qiáng)子序列進(jìn)行優(yōu)化。增強(qiáng)子是DNA順式作用元件，其作用于啟動(dòng)子從而提高轉(zhuǎn)錄水平。除了選擇標(biāo)記以外，栽體也通常包括復(fù)制起點(diǎn)。所述改變聚合酶的優(yōu)選用途在另一方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明與DNA親和力降低的改變聚合酶在將核苷酸摻入多核苦酸中的用途。如上所述，所述核苷酸的性質(zhì)無(wú)限制性，因?yàn)楸景l(fā)明的改變聚合除床持對(duì)相關(guān)核苷酸的親和力。如上所述，本發(fā)明基于如下的認(rèn)識(shí)聚合酶與DNA模板的緊密結(jié)合不總是有利的特性。在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中針對(duì)每個(gè)模板DNA分子只發(fā)生一次核苷酸摻入事件的測(cè)序反應(yīng)中尤其是這樣。在許多這樣的測(cè)序反應(yīng)中使用標(biāo)記的核苦酸。因此，本發(fā)明提供聚合酶的用途，所述聚合酶已經(jīng)改變，使其表現(xiàn)出降低的DNA親和力，以及為了將標(biāo)記核苷酸摻入多核香酸而在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將標(biāo)記核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中的能力，其中所述標(biāo)記用于確定所添加核苷酸的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸包含ddNTP。因此，本發(fā)明的聚合酶可以用于常規(guī)的Sanger測(cè)序反應(yīng)，其詳細(xì)內(nèi)容是本領(lǐng)域公知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核香i^l:經(jīng)修飾的核苷酸，其已在3，糖羥基處進(jìn)行修飾，從而該取代物的大小比天然存在的3，羥基更大。本發(fā)明的所述聚合酶可以用于任何需要/期望能將核苷酸摻入多核苷酸鏈的任何
技術(shù)領(lǐng)域：
，所述核苷酸為例如在3，糖羥基位置具有比天然存在的羥基更大的取代基的修飾核苷酸。它們可以用于需要所述酶的任何期望的特性的任何
技術(shù)領(lǐng)域：
，所述特性為例如甚至在DNA過(guò)量存在條件下提高核普酸摻入率，以及在上述條件下提高反應(yīng)的完成水平。這可以是實(shí)踐上、技術(shù)上或經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢(shì)。雖然所述改變的聚合酶由于其與DNA親和力降低而表現(xiàn)出可以摻入具有大3，取代基的修飾核苷酸的期望特性，但是該酶的用途不僅限于摻入這樣的核苷酸類似物。與本領(lǐng)域已知的酶相比，所述改變的聚合酶由于其與DNA的親和力降低而具有的期望特性可以為摻入任何其它核苷酸提供優(yōu)勢(shì)，包括未修飾的核苷酸。實(shí)際上，本發(fā)明的改變的聚合酶可用于摻入其有能力摻入的任何類型核苷酸。本發(fā)明所述的聚合酶可用于多種需要將核苷酸摻入多核苷酸的技術(shù)，所述技術(shù)包括測(cè)序反應(yīng)、多核苷酸合成、核酸擴(kuò)增、核酸雜交實(shí)驗(yàn)、單核苷酸多態(tài)性研究以及其它這樣的技術(shù)。在測(cè)序反應(yīng)中的用途代表了非常優(yōu)選的實(shí)施方案。所有使用本發(fā)明的修飾聚合酶的這些用途和方法都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及將核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)本發(fā)明的聚合酶；DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。如上所述，本發(fā)明所述的聚合酶在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中僅需摻入單個(gè)或相對(duì)少量核普酸的反應(yīng)中尤其有用。在這些反應(yīng)中常常標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)核苷酸。因此，本發(fā)明提供將標(biāo)記核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)聚合酶，經(jīng)改變以使其表現(xiàn)出降低的DNA親和力以及在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將標(biāo)記核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板的能力；DNA模板；以及(m)核苷酸溶液。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將核苷酸摻入DNA的方法，所述核苷酸在3，糖羥基處進(jìn)行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大，所述方法包括使以下組分相互作用(i)本發(fā)明的聚合酶(如上所述)；"i)DNA模板；以及(iii)含有核苷酸的核香酸溶液，所述核苷酸在3'糖羥基處進(jìn)行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大。特別優(yōu)選在聚簇陣列(clusteredarray)上進(jìn)行的用途和方法。核酸分子的聚簇陣列可以使用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)生產(chǎn)。例如，WO98/44151和WO00/18957(均作為參考并入本文)都描述了核酸擴(kuò)增的方法，該方法使擴(kuò)增產(chǎn)物固定在固體支持物上，以形成了包含固定核酸分子的簇或"集落"的陣列。還參考WO2005/078130，包括其中的引用文獻(xiàn)，上述所有內(nèi)容作為參考并入本文。在聚簇上摻入尤其是在聚蔟陣列上測(cè)序提供了特有的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼍酆厦改軌驅(qū)⒑塑账釗饺胛恢檬纸咏亩鄠€(gè)DNA模板中，因而提供高反應(yīng)效率。使以上組分在允許核苷酸的5，磷脧基與DNA模板上3，游離羥基之間形成磷酸二酯鍵的條件下相互作用，由此將該核苷酸摻入多核苷酸中。優(yōu)選的核苦酸包括修飾核苷酸在上文有詳細(xì)描述。所述摻入反應(yīng)可以在游離溶液中進(jìn)行，或者所述DNA模板可以固定在固體支持物上。突變體酶表現(xiàn)的核苷酸摻入率可以與未改變酶表現(xiàn)的核苷酸摻入率類似。由于所述^"飾酶的改進(jìn)活性，由于其與DNA的親和力降低，同樣的摻入率與單個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)模板中能力的組合提高了總體完成率。然而，突變體酶的核苷酸摻入率不需與未改變酶的核苷酸摻入率完全相同就可以有實(shí)際用途。只要就反應(yīng)完成而言總體反應(yīng)效率提高，核苷酸摻入率可以低于、等于或高于未改變酶的核苷酸摻入率。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合酶可以在合成測(cè)序方案中用于將修飾核苷酸摻入多核苷酸鏈中。在所述方法的這一具體方面中，在3，糖羥基處進(jìn)行修飾，從而該取代基的大小比天然存在的3，羥基更大。檢測(cè)這些核苦酸以確定DNA模板的序列。因此，另一方面中本發(fā)明提供一種DNA測(cè)序方法，該方法包括使以下組分相互作用-根據(jù)本發(fā)明的聚合酶(如上所述)；-DNA模板；以及-含有核苷酸的核苷酸溶液，所述核苷酸在3，糖羥基處進(jìn)行修飾，從而該取化基的大小比天然存在的3，羥基更大，這樣其后檢測(cè)摻入的修飾核苷酸使得可以對(duì)DNA模板進(jìn)行測(cè)序。用于測(cè)序反應(yīng)的DNA模板一般包含具有3，游離羥基的雙鏈區(qū)域，其在測(cè)序反應(yīng)中作為添加其他核苷酸的引物或起始點(diǎn)。待測(cè)序的DNA模板區(qū)懸掛在互補(bǔ)鏈的這種3，游離羥基上。具有3，游離羥基的引物可以作為與待測(cè)序模板區(qū)雜交的單獨(dú)組分加入(例如短的寡核苷酸)。或者，引物與待測(cè)模板鏈可各自形成能夠形成分子內(nèi)雙鏈體的自身互補(bǔ)核酸鏈的一部分，例如發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。核苷酸連續(xù)添加到3，游離羥基上，使多核苷酸鏈以5，至3，的方向合成。每添加一個(gè)核苷酸之后，所添加威基的性質(zhì)即被確定，由此提供了DNA模板的序列信息。如果修飾核苷酸可以作為鏈終止子的話，就可以實(shí)現(xiàn)這樣的DNA測(cè)序。一旦該修飾核苷酸摻入與被測(cè)序模板區(qū)的正在延長(zhǎng)的多核香酸鏈中，將沒(méi)有可用的游離3，-OH基團(tuán)用于指導(dǎo)進(jìn)一步的序列延伸，該聚合酶因此不能再添加核苷酸。一旦確定了摻入逐漸延長(zhǎng)的鏈中的堿基性質(zhì)，可以去除3，阻斷從而使得可以添加下一個(gè)連續(xù)的核苷酸。通過(guò)使用這些修飾核苷酸對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行排序，有可能推導(dǎo)出DNA模板的DNA序列。如果每種修飾核苷酸連接已知對(duì)應(yīng)于特定威基的不同標(biāo)記，以便于區(qū)分每個(gè)摻入步驟中添加的堿基，則該反應(yīng)可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中完成?；蛘?，可以進(jìn)行分別包含每種修飾核苷酸的分開的反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾核苷酸帶有標(biāo)記以便于其檢測(cè)。優(yōu)選地，所述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。每種核普酸類型可以帶有不同的熒光標(biāo)記。然而，該檢測(cè)標(biāo)記不需要為熒光標(biāo)記?？梢允褂迷试S檢測(cè)核苷酸摻入DNA序列中的任何標(biāo)記。適用于本發(fā)明的一種檢測(cè)熒光標(biāo)記核苷酸的方法包括使用波長(zhǎng)特異針對(duì)所述標(biāo)記核苷酸的激光，或使用其它適當(dāng)?shù)墓庠?。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸上的標(biāo)記熒光可以通過(guò)CCD相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。如果將所述DNA模板固定在表面上，它們可以優(yōu)選地固定于表面上以形成高密度陣列，優(yōu)選地為如上所述的聚蔟或"集落，，陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)該申請(qǐng)人為本發(fā)明開發(fā)的技術(shù)，所述高密度陣列包含單分子陣列，其中在陣列上每個(gè)可檢測(cè)離散位點(diǎn)上有單個(gè)DNA分子。由通過(guò)光學(xué)手段可各個(gè)分辨的(individuallyresolvable)的核酸分子組成的單分子陣列以及這些陣列在測(cè)序中的用途描述于例如WO00/06770，其內(nèi)容作為參考并入本文。由包括發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的可各個(gè)分辨的核酸分子組成的單分子陣列描述于WO01/57248，其內(nèi)容也作為參考并入本文中。本發(fā)明的聚合酶適于與根據(jù)WO00/06770或WO01/57248的公開內(nèi)容制備的單分子陣列一起^f吏用。然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明的范圍并非意在限制于所述聚合酶與單分子陣列一起的用途。的修飾i苷酸以及改變的聚合酶來(lái);現(xiàn):互;核普酸與每個(gè)"苷酸片段的第一個(gè)堿基配對(duì)，并隨后在所述改進(jìn)的聚合酶所催化的反應(yīng)中加入到引物上。去除剩余的游離核苷酸。然后，波長(zhǎng)特異性針對(duì)每種修飾核苷酸的激光激發(fā)摻入的修飾核苷酸上適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，引起該標(biāo)記發(fā)出熒光。焚光可以通過(guò)合適的CCD相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，該相機(jī)可以掃描整個(gè)陣列從而鑒定每個(gè)片段上摻入的修飾核苷酸。因此，有可能平行地檢測(cè)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的位點(diǎn)。然后可以去除焚光。摻入的修飾核苷酸的身份表明了樣品序列中與其配對(duì)的堿基的身份。然后可以將摻入、檢測(cè)和鑒定的循環(huán)重復(fù)約25次，從而確定附著在陣列上的每個(gè)可檢測(cè)寡核苷酸片段中的前25個(gè)威基。因此，通過(guò)對(duì)所述陣列上的所有可檢測(cè)分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，可以確定數(shù)以億計(jì)以單拷貝附著在所述陣列的寡核苷酸片段的前25個(gè)#。本發(fā)明顯然不僅限于測(cè)序25個(gè)^。取決于所需序列信息的詳細(xì)程度以及陣列的復(fù)雜性，可以對(duì)多得多的威基或更少的g進(jìn)行測(cè)序。使用適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)程序，可以將產(chǎn)生的序列與特定參照序列進(jìn)行比對(duì)和比較。這允許確定任意數(shù)目的已知或未知遺傳變異，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明的改變聚合酶的功用不限制于使用單分子陣列進(jìn)行的測(cè)序應(yīng)用。該聚合酶可以與需要使用聚合酶將核普酸摻入多核苷酸鏈的任何類型基于陣列(特別是任何基于高密度陣列)的測(cè)序技術(shù)一起使用，特別是依賴摻入具有大3，取代基(比天然羥基更大)如3，阻斷基的修飾核苷酸的任何基于陣列的測(cè)序技術(shù)。本發(fā)明所述的聚合酶可以用于在基本上任何類型的陣列上進(jìn)行核酸測(cè)序，所述陣列通過(guò)將核酸分子固定在固體支持物上而形成。除了單分子陣列以外，合適的陣列也包括例如多重多核苷酸(multi-polynucleotide)或聚蔟陣列，其中所述陣列上的不同區(qū)域包含一種多核苷酸分子的多個(gè)拷貝或者甚至是少量不同多核苷酸分子(例如兩條互補(bǔ)核酸鏈的多個(gè)拷貝)的多個(gè)拷貝。具體地，本發(fā)明聚合酶可以用于WO98/44152描述的核酸測(cè)序方法，其內(nèi)容作為參考并入本文中。該國(guó)際申請(qǐng)描述了一種對(duì)位于固體支持物上不同位置的多個(gè)模板進(jìn)行平行測(cè)序的方法。該方法依賴于將標(biāo)記核苷酸摻入多核苷酸鏈。本發(fā)明的聚合酶可以用于國(guó)際申請(qǐng)WO00/18957描述的方法，其內(nèi)容作為參考并入本文中。該申請(qǐng)描述了固相核酸擴(kuò)增和測(cè)序的方法，其中將大量不同的核酸分子排成陣列并通過(guò)形成核酸集落以高密度同時(shí)擴(kuò)增，隨后對(duì)核酸集落進(jìn)^f亍測(cè)序。本發(fā)明的改變聚合酶可以用于該方法的測(cè)序步驟中。核酸分子的多重多核苷酸或聚簇陣列可以使用本領(lǐng)域中一般已知的技術(shù)進(jìn)行合成。例如，WO98/44151和WO00/18957均描述了核酸擴(kuò)增的方法，該方法4吏得擴(kuò)增產(chǎn)物固定于固體支持物上，從而形成由固定核酸分子的簇或"集落"組成的陣列。涉及制備聚蔟陣列的以及使用該陣列作為核酸測(cè)序的模板的WO98/44151和WO00/18957內(nèi)容作為參考并入本文中。根據(jù)所述方法制備的聚蔟陣列上的核酸分子為使用本發(fā)明聚合酶進(jìn)行測(cè)序的合適模板。然而，本發(fā)明并非意在限于所述聚合酶在測(cè)序反應(yīng)中的用途，該測(cè)序反應(yīng)在根據(jù)這些特定方法制備的聚蔟陣列上進(jìn)行。本發(fā)明的聚合酶還可以用于熒光原位測(cè)序方法中，如描述于Mitra等AnalyticalBiochemistry320,55-65,2003中的方法。本發(fā)明還考慮包含本發(fā)明聚合酶的試劑盒，所述聚合酶可能與適當(dāng)?shù)膉吏用說(shuō)明書包^fr—起。所述聚合酶將以適于使用的形式提供，例如在適當(dāng)?shù)木彌_液中提供或以能夠重建使用的形式(例如以凍干的形式)提供。因此，提供了用于核苷酸摻入反應(yīng)或測(cè)定的試劑盒，其包含本發(fā)明的聚合酶以及核苷酸溶液，所述核苷酸使得聚合酶能夠?qū)⑵鋼饺胝谘娱L(zhǎng)的DNA鏈中。優(yōu)選的核苷酸包括適當(dāng)標(biāo)記的核苷酸，例如可由此用于測(cè)序反應(yīng)的核苷酸。標(biāo)記可包括本領(lǐng)域中公知的熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記和/或質(zhì)量標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸溶液包舍者如ddNTP之類的合成(即非天然)的核苷酸，或基本由其組成或者由其組成。該試劑盒因此可以用于例如Sanger測(cè)序反應(yīng)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸溶液包含修飾核苷酸，或基本由其組成或者由其組成。優(yōu)選的修飾核苷酸已在上文就本發(fā)明的聚合酶進(jìn)行了定義，并且該描述在加以必要的^"正后也可應(yīng)用于此處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒也可以摻入使得核苷酸摻入反應(yīng)得以進(jìn)行的適當(dāng)引物和/或DNA模板分子。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于合成本發(fā)明聚合酶的方法，包括(i)選擇聚合酶中用于誘變的殘基；(ii)根據(jù)(i)的選擇產(chǎn)生突變體聚合酶；(m)測(cè)定該突變體聚合酶與DNA的親和力；和(iv)如果與DNA的親和力有所降低，則測(cè)試該聚合酶在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成更多生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物的能力。優(yōu)選地，與核苷酸的親和力不受影響，但是如果其保持與未經(jīng)4務(wù)飾聚合酶的親和力相同的數(shù)量級(jí)也可以認(rèn)為是滿足條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括在誘變后確保所述聚合S^持相同數(shù)量級(jí)的保真度。優(yōu)選地，保真度不受影響，但是如果其保持與未經(jīng)修飾聚合酶的保真度相同的數(shù)量級(jí)也可以認(rèn)為是可接受的。反應(yīng)循環(huán)在上文有所描述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶的測(cè)試包括使用合成核苷酸來(lái)確定是否形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物?？梢詼y(cè)試聚合酶的適當(dāng)?shù)暮塑账釗饺霚y(cè)定是本領(lǐng)域已知的(參閱如WO2005/024010)，并且在下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)有更詳細(xì)的描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于9。N的一級(jí)^J^酸序列選擇殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)預(yù)測(cè)哪些M酸會(huì)與DNA接觸來(lái)進(jìn)行選擇?；蛘?，可以選擇下述殘基預(yù)計(jì)其穩(wěn)定聚合酶與DNA的相互作用，和/或可見于聚合酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，和/或其為堿性的。如上文和實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述，預(yù)測(cè)可基于適當(dāng)聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)(實(shí)施例1)。誘變尤其是定點(diǎn)誘變的方法在本領(lǐng)域有完善的表征，并有市售試劑盒。因此，這些技術(shù)不再詳細(xì)討論。任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)均可以用于本發(fā)明的方法中?？梢酝ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量與DNA親和力的降低。優(yōu)選地，與原始的未改變聚合酶相比，親和力至少降低或約降低1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍等。親和力可以利用例如解離常數(shù)來(lái)衡量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶是B家族聚合酶，優(yōu)選來(lái)自嗜熱古細(xì)菌，最優(yōu)選為9。N聚合酶。參照以下的實(shí)驗(yàn)章節(jié)和附圖可進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖1顯示本發(fā)明突變體酶的過(guò)表達(dá)。圖2顯示使用所述突變體酶的粗制備物進(jìn)行NUNC管測(cè)定的結(jié)果。圖3顯示使用所述突變體酶進(jìn)行單^摻入測(cè)定的結(jié)果。圖4進(jìn)一步表現(xiàn)出所述突變體酶的活性。圖5顯示[DNA>[聚合酶(比例為5:1)時(shí)，對(duì)對(duì)照聚合酶(YAV)以及三種突變體酶(K705A、R713A和R743A)中的每一種進(jìn)行單>5^摻入測(cè)定的時(shí)間過(guò)^E結(jié)果。圖6用所示NUNC孔的熒光影〗象顯示洗滌測(cè)定的結(jié)果。圖7也展示洗滌測(cè)定的結(jié)果，顯示各種聚合酶與DNA模板的親和力(為清^見省略了K705A的數(shù)據(jù))。圖8展示了顯示聚合酶的動(dòng)力學(xué)特征的Michaelis曲線，其為重疊顯示。圖9展示由已修飾密碼子的克隆9基因編碼的核苷酸和^^酸序列。圖IO展示SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將未誘導(dǎo)的(凝膠I)和經(jīng)誘導(dǎo)的(凝膠I、II)培養(yǎng)粗裂解物中Po152(在pETll-a表達(dá)載體中表達(dá)時(shí)已修飾密碼子的克隆9基因)的3個(gè)克隆(1、2和4)與Po119(在pNEB917表達(dá)載體中表達(dá)的克隆9基因)和Po143(從pETll-a表達(dá)載體中表達(dá)的克隆9基因)的表達(dá)進(jìn)行比較?？s寫MW-分子量；PM-蛋白標(biāo)記；cl9-克隆9。發(fā)明詳述實(shí)驗(yàn)章節(jié)實(shí)施例1-制備改變的聚合酶原理在9°N-7YAVC223S聚合酶的C端區(qū)域中引入定點(diǎn)突變，從而降低該酶與DNA的親和力(野生型9°N-7聚合酶具有非常高的DNA親和力，Kd=50pM;Southworth等1996.PNAS.93，5281)。使用9°N-7DNA聚合酶開放形式的晶體結(jié)構(gòu)(PDB=lqht)、密切相關(guān)的DNA聚合酶RB69開放結(jié)構(gòu)(PDB=lih7)以及RB69封閉形式(PDB=lig9)的能量最小化重疊比對(duì)(通過(guò)Cresset進(jìn)行)作為鑒定參與DNA結(jié)合的關(guān)鍵殘基的結(jié)構(gòu)模型。RB69聚合酶封閉形式的晶體結(jié)構(gòu)(Franklin等2001.Cell105,657)鑒定了許多與復(fù)合的DNA形成氬鍵或靜電相互作用的殘基，直接與核苷酸堿基或者與磷酸骨架起作用。這些殘基中很大一部分是堿性的(Lys790、800、844、874、878和Arg806)，這與它們可能與酸性磷^J^目互作用一致。對(duì)封閉RB69結(jié)構(gòu)的觀察顯示這些殘基中大多數(shù)采取朝向結(jié)合雙鏈體的取向。不存在與9。N-7聚合酶封閉形式類似的結(jié)構(gòu)，所以我們使用我們的結(jié)構(gòu)比對(duì)來(lái)鑒定9。N-7聚合酶開放形式中采取與RB69開放結(jié)構(gòu)中堿性殘基(上述的殘基)類似的構(gòu)象的堿性殘基。在來(lái)自RB69的6個(gè)堿性殘基中，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)在9°N-7中具有相應(yīng)堿性殘基，它們是Arg743(RB69Lys878)、Arg713(Lys800)和Lys705(Lys844)。決定改造4個(gè)突變體酶所示殘基的丙氨酸變體(R743A、R713A和K705A)以及71位氨基酸的缺失(A71)，所述缺失去除了拇指亞結(jié)構(gòu)域的a-螺旋(在9。N-7聚合酶結(jié)構(gòu)中發(fā)生異常的殘基)，上述三個(gè)殘基就位于其中。i秀變和克隆使用StratageneQuikchangeXL試劑盒及其操作方案，通過(guò)PCR方法將突變引入pSV19(編碼9°N-7YAVC223Sexo-聚合酶的載體)(還參閱WO2005/024010)。使用的誘變引物R743A(SEQIDNO:9)(SEQ工DNO:10)(SEQ工DN〇11)(SEQIDNO:12)(SEQ工DNO:13)(SEQIDNO:14)(SEQIDNO:15)(SEQ工DNO:16)選擇潛在的克隆并對(duì)基因的PCR片段進(jìn)行測(cè)序從而證實(shí)突變的存在。產(chǎn)生所有突變體的陽(yáng)性克隆。過(guò)表達(dá)和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌林NovagenRosettaBlueDE3pLysS如WO2005/024010的實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)。如WO2005/024010的實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述進(jìn)行收獲和裂解。如WO2005/024010的實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述進(jìn)行純化。正向反向正向反向正向反向正向反向5'-CCCGGCGGTGGAGGCGiVTTCTAAAAGCC-3'3'-GGGCCGCCACCTCCGCTAAGATTTTCGG-5'R713A5'-GAAGGATAGGCGACGCGGCGATTCCAGCTG-3'3'-CTTCCTATCCGCTGCGCCGCTAAGGTCGAC-5K705A5'-GCTACATCGTCCTAGCGGGCTCTGGAAGG-3'3'-CGATGTAGCAGGATCGCCCGAGACCTTCC-5'A71(C端704)5'-GCTACATCGTCCTATGAGGCTCTGGAAGG-3'3'-CGATGTAGCAGGATACTCCGAGACCTTCC-5'結(jié)果實(shí)現(xiàn)了突變體酶成功的過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)了所有突變體酶。對(duì)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳以檢查所述構(gòu)建體的過(guò)表達(dá)(--未謙導(dǎo)的；+-IPTG誘導(dǎo)的)。得到的^示于圖1。實(shí)施例2-使用粗蛋白制備物進(jìn)行NUNC管測(cè)定。如WO2005/024010中所述，對(duì)突變體酶的5ml小培養(yǎng)物(同時(shí)使用YAVC223Sexo-培養(yǎng)物用作直接比較)進(jìn)行快速純化直至熱處理步驟。此時(shí)，認(rèn)為該樣品足夠純凈可以測(cè)試其活性。使用S300凝膠過(guò)濾離心柱將每種粗制備物的緩沖液更換為酶學(xué)緩沖液(50mMTrispH8.0、6mMMgS04、1mMEDTA、0.05%Tween20)。該樣品M濃度進(jìn)行歸一化。所使用的測(cè)試為簡(jiǎn)單地將ffTTP摻入表面偶聯(lián)A模板發(fā)夾。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，將2皮摩的5，-氨基寡聚物815(L"■CGA'rCACGATCACGA:'CACG'A'丄'CACGATCACGU,CACGCTGA丁'GTGCA7GCG'rGTTTTTTTAG，HCATGCACATCAGCG、'V)工i;NO:/"與NUNC-nucleolink膠條偶聯(lián)。洗滌后，將每個(gè)孔與20^等分試樣的粗酶制備物(以下列出酶的性質(zhì))以及5ffT-N3-647—起孵育。接著將膠條在45。C醉育30分鐘。該實(shí)驗(yàn)以一式兩份進(jìn)行。孵育30分鐘完成后，用3x100pl高鹽洗滌緩沖液(10mMTrispH8.0,、1MNaCl、10mMEDTA)以及其后3x100pl的MiiliQ水洗滌小孔。在typhoon焚光成像儀(CY5濾光器，PMT=450V)上對(duì)膠條進(jìn)行掃描。該結(jié)果示于圖2，其中孔如下所示1=僅為20nl酶學(xué)緩沖液+1nl100|LiMf汀-N3-6472=20pl粗YAVC223Sexo-+1pl100ffT-N3-6473=20nl粗YAVC223SR743Aexo國(guó)(克隆12)+1pl100ffT-N3誦6474=20jil粗YAVC223SK705Aexo-(克隆15)+1pl100pMf汀-N3-6475=20nl粗YAVC223SR743Aexo-(克隆16)+1pl100pMffT-N3誦6476=20pi粗YAVC223SR713Aexo-(克隆24)+1pl100ffT-N3-6477=20nl粗YAVC223SA71exo-(克隆38)+1nl100pMffT-N3-6478=20nl粗YAVC223SR713Aexo-(克隆39)+1pl100,ffT-N3-647結(jié)果除了背景孔(只有MilliQ)和孔1(不含酶的對(duì)照)以外，在所有的孔中均觀察到酶學(xué)反應(yīng)。熒光強(qiáng)度與摻入f汀TP的量成正比——孔越暗，摻入水平越高。相對(duì)于YAV(克隆9)(YAVC223Sexo-)描述突變體酶的作用。缺失拇指亞結(jié)構(gòu)域的尖部(A71突變體)得到催化作用嚴(yán)重受損的酶，并且僅摻入克隆935%的水平。突變體K705A與克隆9等價(jià)。兩種精氨酸突變體R743A和R713A顯示摻入水平的提高，表現(xiàn)出對(duì)克隆9約45%的提高。結(jié)論突變體酶K705A、R713A和R743A表現(xiàn)出摻入水平的提高以及酶與DNA親和力的降低。去除所有這三個(gè)堿性殘基與缺失其他殘基的組合破壞其活性U71突變體)。可能在不存在其他突變/缺失時(shí)，全部替換這三個(gè)殘基不會(huì)導(dǎo)致活性的降低。實(shí)施例3-單g摻入測(cè)定使用描述于WO2005/024010的單4^&摻入測(cè)定對(duì)粗酶制備物(歸一化的濃度)的活性進(jìn)行測(cè)量。在2nMf汀-N3-cy3和20nM10A發(fā)夾DNA("P-標(biāo)記的)存在下，用30或3pg/ml粗酶制備物孵育10分鐘，在0、30、60、180和600秒取出反應(yīng)混合物的等分試樣并在12%丙烯酰胺皿上電泳。結(jié)果凝膠圖象顯示于圖3。使用Imagequant對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，熒光強(qiáng)度對(duì)孵育時(shí)間作圖產(chǎn)生示于圖4的時(shí)間過(guò)程。這些數(shù)據(jù)給出了對(duì)突變體酶相對(duì)于YAV的ffTTP第一個(gè)g摻入性能的估計(jì)。由于濃度的歸一化，所述活性可直接比較。A71突變體基本無(wú)活性(kobs為YAV所觀察到的21%)，R743A和K705A具有與YAV相當(dāng)?shù)幕钚?，但R713A顯示出kobs(2倍于YAV所觀察到的)和循環(huán)完成水平的顯著提高。實(shí)施例4-在DNAl高于f聚合酶l的條件下用于純化的聚合酶的單堿基摻入測(cè)定。使用描述于WO2005/024010的單>5^摻入測(cè)定對(duì)克隆9聚合酶(YAVC223Sexo-)以及拇指亞結(jié)構(gòu)域突變體K705A、R713A和R743A的純化酶制備物的活性進(jìn)行測(cè)量。該實(shí)驗(yàn)在DNA和聚合酶各自的濃度比約為5:1時(shí)進(jìn)行。因此，研究了所述酶在單個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苦酸摻入多個(gè)DNA模板分子的能力。在20nM10A發(fā)夾DNA("P-標(biāo)記的)和2nMf汀-N3-cy3存在下用4nM純化的酶孵育30分鐘，在0、15、30、60、180、480、卯0和1800秒間隔時(shí)取出該反應(yīng)混合物的等分試樣并在12%丙烯酰胺凝膠上電泳。結(jié)杲使用Imagequant對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，轉(zhuǎn)換為完成百分比(基于凝膠上起始材料和終產(chǎn)物條帶的相對(duì)強(qiáng)度)的熒光強(qiáng)度對(duì)孵育時(shí)間作圖得到的時(shí)間過(guò)程示于圖5?？寺?和K705A的時(shí)間過(guò)程曲線的性質(zhì)是二相性的，顯示為最初的指數(shù)"激增"期(黑線)和之后產(chǎn)物隨時(shí)間轉(zhuǎn)換的線性依賴性(灰線)。K705A激增期的幅度比克隆9更高(分別為~28%和19%)，并且K705A的線性期的梯度比克隆9的更陡(因此更快)。這一觀察的重要性將在下文討論。與此相反，R713A和R743A突變體酶并不顯示這種二相性性質(zhì)，取而代之地，只觀察到快速指數(shù)期。在這兩種情況中指數(shù)期的幅度均為90%，表明指數(shù)期中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)換程度比克隆9或K705A更高。激增期等同于反應(yīng)起始前聚合酶相關(guān)DNA分子群的f汀TP摻入率，即聚合酶:DNA:ffTTP三元復(fù)合物可以轉(zhuǎn)換的最高速率。任何隨后的時(shí)期都?xì)w因于較慢的解離/再結(jié)合過(guò)程，該過(guò)程是所述聚合酶分離新底物分子(DNA和ffTTP)所需要的。所》見察到的克隆9和K705A的二相性性質(zhì)提示，較慢的激增后期是由酶與DNA解離和再結(jié)合的困難程度造成的，很可能是由于其較低的Kd(DNA)。突變?cè)谂c聚合酶結(jié)合時(shí)可以接觸雙鏈體DNA的堿性殘基(即R713和R743)以消除該功能性產(chǎn)生僅顯示突發(fā)動(dòng)力學(xué)的突變體酶(R713A和R743A)。我們用兩種方法中的一種來(lái)解釋這一點(diǎn)i)通過(guò)降低與DNA的親和力(提高Kd(DNA))來(lái)提高酶與DNA解離和再結(jié)合的能力，和/或ii)在這些突變體中DNA親和力的降低導(dǎo)致聚合酶制備物中出現(xiàn)大的"活性酶"級(jí)分。已顯示不純的DNA聚合酶(由裂解中保留的大腸桿菌基因組DNA污染)通過(guò)減少制備物中的活性酶級(jí)分而抑制酶。所述時(shí)間過(guò)程的粗?jǐn)M合提示，所觀察到的克隆9和K705A的激增期的速率常數(shù)相當(dāng)(kobs0.06s-l)，而R713A(kobs~0.01s-l)和R743A(kobs~0.004s-l)的速率常數(shù)較小。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，克隆9和K705A的激增比R713A或R743A的激增更快，但是由于缺乏克隆9和K705A固有的較慢并且線性的解離/再結(jié)合期，所以后兩種酶在較短的時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)。實(shí)施例5-洗滌測(cè)定使用洗滌測(cè)定定性評(píng)估純化的酶制備物與DNA的親和力。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，用2皮摩的5，-氨基A-模板發(fā)夾寡聚物815(5'H2Nf-TTTACAACAGCATGCACATCAGCG-3')(SEQIDNO:18)對(duì)<4(1x8)個(gè)NUNCnucleolink膠條進(jìn)行功能化。洗滌后，將每個(gè)孔與20nl等分試樣的500nM酶(克隆9、K705A、R713A或R743A突變體)在45。C孵育30分鐘。孵育后，用包括不同濃度NaCl(O、0.05、0.1、0.3、0.4、0.75、1.0、2.0M)的3x100ml10mMTrispH8.0，10mMEDTA對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行洗滌，然后用3x100mlMilliQ水進(jìn)行洗滌。隨后，用酶學(xué)緩沖液將孔預(yù)平衡，之后再次與20jil的2nMf汀-N3-647在45。C孵育30分鐘。用3x100ml的高鹽洗滌緩斗液(10mMTrispH8.0，1MNaCl,10mMEDTA)對(duì)孔進(jìn)行洗滌，然后用3x100mlMilliQ水進(jìn)行洗滌。在Typhoon熒光成像儀上掃描膠條(y5濾光器，PMT=500V)。結(jié)果NUNC孔的熒光圖像顯示于圖6?？字械娜魏螣晒舛际怯捎谙礈旌笈c表面偶聯(lián)DNA結(jié)合的殘余酶。提高孵育之間洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度會(huì)通過(guò)遮蔽靜電相互作用而使聚合酶和DNA之間的相互作用不穩(wěn)定。在更高的離子強(qiáng)度下，酶會(huì)更加高效地從DNA上洗脫。當(dāng)在孵育之間使用低離子強(qiáng)度洗滌時(shí)，所有測(cè)試酶都顯示出高水平的摻入，因此酶從DNA解離的效率較低。隨著洗滌緩沖液中NaCl濃度的提高，酶的表現(xiàn)相對(duì)于彼此來(lái)說(shuō)有所變化。[NaCl<200mM時(shí)，突變體酶R713A和R743A更有效地從DNA上移除，而K705A和克隆9表現(xiàn)出彼此相似的反應(yīng)，需要較高的[NaCl]使它們從DNA上移除。即使在用2MNaCl洗滌后，克隆9仍觀察到相對(duì)于0MNaCl洗滌來(lái)說(shuō)顯著水平(約75%)的摻入。這在圖7所示曲線中有清楚的展示(為了清M見，K705A的數(shù)據(jù)已被省略)。有趣的是，測(cè)試酶在經(jīng)歷了2MNaCl洗滌后似乎無(wú)一從DNA上完全移除。從該實(shí)驗(yàn)很明顯看出，對(duì)殘基R713和R743進(jìn)行突變得到顯示低于克隆9的DNA親和力的酶，證據(jù)為它們被較低離子強(qiáng)度的洗滌從DNA洗脫的能力。實(shí)施例6-克隆9、R713A和R743A的f汀-N3-cv3摻入動(dòng)力學(xué)使用NUNC管測(cè)定對(duì)所述酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)表征，包括在各種[ffNTP下測(cè)量[DNA<<[聚合酶l或[ffNTP時(shí)f汀N3cy3的一階(firstorder)摻入率常數(shù)。以下描述測(cè)試這三種聚合酶所使用的方法。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，用2皮摩的5，-氨基A模板發(fā)夾寡聚物815<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>個(gè)(1x8)NUNCnucleolink膠條進(jìn)行功能化。在特定的[f汀-N3-cy3下，使用每個(gè)膠條進(jìn)行時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)。在45。C下在每個(gè)NUNC孑L中將20jil的酶學(xué)緩沖液(50mMTrispH8.0,6mMMgS04，1mMEDTA,0.05%Tween20)孵育2分鐘。使用8-通道多道移液器通過(guò)加入在45。C預(yù)平衡2分鐘的20jil等分試樣2x酶學(xué)混合物(XnMf汀-N3-cy3,酶學(xué)緩沖液中1.1jiM聚合酶)來(lái)起始時(shí)間過(guò)程，從而各個(gè)孔在相同的時(shí)間點(diǎn)開始反應(yīng)。向孔中的緩沖液加入2x酶學(xué)混合物足以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)幕旌?。通it^p入125jil250mMEDTA4吏反應(yīng)終止在所需的時(shí)間點(diǎn)。在所有8個(gè)孔中的反應(yīng)均終止后，用3xl00ml高鹽洗滌液(10mMTrispH8.0，1MNaCl,10mMEDTA)對(duì)膠條進(jìn)行洗滌，之后用3xl00mlMilliQ水進(jìn)行洗滌，然后在Typhoon熒光成4象儀(Cy3濾光器，PMT=500V)上進(jìn)行掃描。使用Imagequant對(duì)每個(gè)孔中的焚光強(qiáng)度進(jìn)行定量。將Cy3熒光強(qiáng)度的變化對(duì)時(shí)間作圖得到時(shí)間過(guò)程圖。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，這些時(shí)間過(guò)程圖將孔評(píng)價(jià)為單指數(shù)式衰減過(guò)程(擬合于方程y=yo+Aexp(x/t))，由此可以確定反應(yīng)的半衰期t，其倒數(shù)稱為，見察速率常數(shù)knobs(kobs=1/t)。觀察速率常數(shù)的大小取決于f汀-N3-cy3的濃度，因此通過(guò)在不同f汀-N3-cy3濃度下重復(fù)該實(shí)驗(yàn)可以確定特定酶的knobs值范圍。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)分4斤，knobs隨f汀-N3-cy3濃度的變化為雙曲線形，并與Michealis-Menten方程Vmax=(kpolx[Sl)/(Kd+[Sl)擬合良好，這里S=f汀N3-cy3。從Michaelis曲線可以獲得特定酶催化特定反應(yīng)的特征性關(guān)鍵值，即kpol(定義為底物濃度無(wú)限大時(shí)該過(guò)程的速率常數(shù))和Kd(定義為底物濃度為kpo1/2時(shí)的解離常數(shù))。對(duì)克隆9、R713A和R743A突變體重復(fù)該過(guò)程。所有酶的Michaelis曲線在圖8中重疊顯示。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>從該結(jié)果看來(lái)，似乎聚合酶DNA結(jié)合區(qū)的突變不會(huì)對(duì)酶的活性(在高底物濃度時(shí)，kpol接近Vmax)或酶對(duì)完整功能核苷酸(在該情況中為f汀-N3-cy3,但是認(rèn)為趨勢(shì)是適用于所有威基)的親和力產(chǎn)生不利影響。這是理想的情形，因?yàn)樵撏蛔兙哂小絼?wù)飾酶的DNA結(jié)合親和力而不影響其它關(guān)鍵催化特性的理想效果。實(shí)施例7-純化聚合酶和測(cè)量遺留DNA的水平。DNA污染Pico綠測(cè)定(MolecularProbes試劑盒，目錄號(hào)P11496)所需溶液TE緩沖液lOmMTris.HClpH7.5lmMEDTA需要40mL，將2mL20xTE緩沖液加入38mLH20中入DNA溶液1(2ng/mLXDNA)用735pL的1xTE緩沖液稀釋15jiLXDNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>將2x500nL每個(gè)樣品放入2個(gè)eppendorf管中。制備picogreen溶液；將85的picogreen原^p入17mL1xTE緩沖液中。將500nL該溶液加入每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶樣品中，并使用移液器充分混合，然后將所有的樣品轉(zhuǎn)移到1.5mL焚光計(jì)比色杯中。使用熒光計(jì)使用CaryEclipse文件的高級(jí)讀取程序。將Xfci光設(shè)置為480nm，并且X發(fā)射光設(shè)置為520nm，并使用1000伏特。分析將標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)輸入GraphpadPrism，與方程式y(tǒng)=ax+c的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。之后測(cè)定濃度值x。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>從該實(shí)驗(yàn)可見，很明顯所述聚合酶中的改變?cè)鰪?qiáng)了酶的純化，因?yàn)樵诩兓羞z留了較少的內(nèi)源DNA。如上所述，內(nèi)源DNA的遺留可對(duì)酶的活性產(chǎn)生負(fù)影像，因此該突變很明顯是有利的。實(shí)施例8—制備編碼克隆9聚合酶的經(jīng)修飾優(yōu)化了密碼子使用的核酸序列。使用每個(gè)密碼子上編碼所需的/理想的氨基酸的最佳核酸序列將SEQIDNO1中顯示的^J^,列翻譯成核,列。推導(dǎo)出的核*列示于SEQIDN0.19。在類似的情況中，基于SEQIDNO:21所示的聚合酶序列推導(dǎo)出SEQIDNO:20所示的核酸序列。具有SEQIDNO:21所示^J^酸序列的聚合酶包含R743A突變，并且還帶有141位和143位殘基均替換為絲氨酸的突變。包含各個(gè)核苷酸和M酸序列的核酸分子和蛋白質(zhì)組成了本發(fā)明的一部分。利用Ndel-NheI位點(diǎn)(以保留內(nèi)部的BamHI位點(diǎn))將克隆9的已修飾密碼子基因克隆進(jìn)表達(dá)載體PETll-a合成克隆9的密碼子優(yōu)化基因由GENEART合成SEQIDNO19的核酸序列并以pPCR—Script提供。確認(rèn)DNA和蛋白質(zhì)的序列(結(jié)果未顯示)。將pSV57(pPCRScript載體中克隆9的已修飾密碼子基因)克隆進(jìn)pETll-a(下文稱為pSV52)制備pETll-a載體用NdeI和NheI消化pETll-a載體(Novagen目錄號(hào)69436-3),去磷酸化，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接任何未消化的載體。使用Qiagen⑧的MinElute⑧凝膠提取試劑盒在0.8y。瓊脂糖凝膠上純化經(jīng)消化的載體。使用聚丙烯酰胺TB4-20%凝膠對(duì)經(jīng)消化和純化的pETll-a載體進(jìn)行定量。制備插入片段(克隆9的已修飾密碼子基因)用NdeI和Nhe消化pPCRSCript載體中GENEART合成的克隆9的已修飾密碼子基因(下文稱為pSV57)。使用來(lái)自Qiagen的MinElute⑧凝膠提取試劑盒在0.8%瓊脂糖凝膠上純化經(jīng)消化的插入片段。使用聚丙烯酰胺TB4-20%凝膠對(duì)經(jīng)消化和純化的插入片段進(jìn)行定量。連接使用Quick連接試劑盒(NEB,M2200S)在NdeI和NheI限制性位點(diǎn)處將pETll-a載體和插入片段進(jìn)行連接(比例1:3)。轉(zhuǎn)化使用2nl連接混合物轉(zhuǎn)化XL10-gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene目錄號(hào)200315)。PCR篩選含有所述插入片段的克隆。挑取轉(zhuǎn)化林，并制備3個(gè)用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的XL10-gold陽(yáng)性克隆的DNA微量制備物。在克隆位點(diǎn)處對(duì)這三種經(jīng)純化的質(zhì)粒(下文稱為pSV52，克隆l、2和4)進(jìn)行測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)所有這三個(gè)克隆在克隆位點(diǎn)處都具有正確的序列。所述微量制備物還用于轉(zhuǎn)化如下所述的表達(dá)大腸桿菌宿主BL21畫CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene目錄號(hào)230245)。Southern印跡對(duì)pVent(pNEB917來(lái)源的載體)、pSV43(pETlla中的克隆9)、pSV54(pETll-a中的密碼子優(yōu)化克隆)和pSV57(GENEART提供的pPCR-Script中的已修飾密碼子基因)進(jìn)行限制性酶切和Southern印跡以檢查基因間的交叉雜交(結(jié)果未顯示)。Pol52的表達(dá)研究將pSV52(克隆1、2和4)轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene目錄號(hào)230245)中。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書，使用21-25ng純化的pSV52質(zhì)粒DNA(克隆1、2和4)轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)ML(下文稱為RIL)的感受態(tài)細(xì)胞。將50nl每種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪在含有100fig/ml羧千青霉素和34ng/ml氯霉素的新鮮Luria-Bertani(LB)瓊脂培^基(LBCC瓊脂培養(yǎng)基)上，并在37。C下孵育過(guò)夜。將以下的甘油儲(chǔ)液也鋪在LBCC瓊脂板上用作表達(dá)研究的對(duì)照，并于37r:孵育過(guò)夜。SOL10204:RIL-pSV19(pNEB917載體中的克隆9)SOL10354:RIL-pSV43(pETll-a載體中的克隆9)。生產(chǎn)表達(dá)Po152和克隆9陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞沉淀使用單個(gè)轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆接種培養(yǎng)管中的3mlLBCC起始培養(yǎng)基，并在37°C下?lián)u動(dòng)(225rpm)孵育過(guò)夜。將起始培養(yǎng)物1/100稀釋到無(wú)菌開口錐形瓶中的50mlLBCC培養(yǎng)基中，并在37。C下劇烈搖動(dòng)(300rpm)孵育約4小時(shí)，直至OD,肌約為1.0。取出10ml未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物并收集細(xì)胞(如下所述)。加入IPTG至終濃度為lmM，并于37。C劇烈搖動(dòng)(300rpm)誘導(dǎo)培養(yǎng)物2小時(shí)取出10ml經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物并如下收集細(xì)胞通過(guò)在4。C下以5000xg離心30分鐘來(lái)收集經(jīng)i秀導(dǎo)的和未^秀導(dǎo)的細(xì)胞。洗滌細(xì)胞沉淀并重懸于1/10培養(yǎng)物體積的1x砩酸緩沖鹽水(PBS)中，并按上文進(jìn)行離心。輕輕倒出上清液，并將沉淀保存在-20。C直至其需要用于細(xì)胞裂解以及純化步驟。Pol52和克隆9的細(xì)胞裂解和粗純化將所述沉淀解凍并重懸于1/50培養(yǎng)物體積的lx洗滌緩沖液(50mMTris-HClpH7.9，50mM葡萄糖，lmMEDTA)中并在室溫下孵育15分鐘，所示洗滌緩沖液含有新加入1x緩沖液中的4mg/ml溶菌酶。在細(xì)胞中加入含有0.5%(重量/體積)TergitolNP-40和1x"完全不含EDTA的，，蛋白酶抑制劑混合物(二者均新加進(jìn)1x裂解緩沖液中)的等體積1x裂解緩沖液(10mMTris-HClpH7.9，50mMKC1，lmMEDTA，0.5%(w/v)Tween20),輕柔混合細(xì)胞并在室溫下孵育30分鐘。將細(xì)胞在水浴中以80。C加熱1小時(shí)，然后在4'C下以38,800xg離心30分鐘以去除細(xì)胞碎片和變性蛋白質(zhì)。制備本積歸一化的樣品和SDS-PAGE分析通過(guò)在考馬斯藍(lán)染色后分析SDS-PAGE上未誘導(dǎo)和"i秀導(dǎo)對(duì)照樣品的粗裂解物來(lái)評(píng)估Pol52和克隆9DNA聚合酶的表達(dá)。^f子細(xì)地移出上清液，通過(guò)加入50:50(體積/體積)的1x洗滌緩沖液和1x裂解緩沖液來(lái)對(duì)樣品體積進(jìn)行歸一化，終體積為370nl。制備用于凝膠I的樣品將10^歸一化粗裂解物(來(lái)自未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的樣品)與10jil含有143mMDTT的加樣緩沖液混合。制備用于凝膠II的樣品來(lái)自經(jīng)誘導(dǎo)樣品的歸一化粗裂解物僅用蒸餾7K稀釋1/10至終體積為10pl，并將其與10nl含有143mMDTT的加樣緩沖液混合。將所有的樣品在70。C加熱10分鐘。SDS-PAGE根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明制備NuPage4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen目錄號(hào)NP0321BOX)。將10jilSeeBluePlus2預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen目錄號(hào)LC5925)和jil每種樣品進(jìn)行加樣，凝膠以恒定的200V電泳50分鐘。用考馬斯藍(lán)(SimplyBlueTMSafestain,Invitrogen,目錄號(hào)LC6060)將皿染色。結(jié)果SDS-PAGE的結(jié)果顯示于圖10。該實(shí)驗(yàn)中估計(jì)的表達(dá)水平為20mg/L培養(yǎng)物。與相同細(xì)胞中使用pNEB917(Po119)或pETll(Pol43)表達(dá)載體的克隆9未修飾基因相比，使用表達(dá)載體pETll-a獲得了大腸桿菌宿主BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Po152)中克隆9已修飾密碼子的基因相似的表達(dá)水平。Po152的3個(gè)不同克隆的表達(dá)7JC平^^見察到顯著差異。參考文獻(xiàn)CrystalstructureofabacteriophageT7DNAreplicationcomplexat2.2Aresolution,Doublie等1998.Nature391，251.FunctionoftheC-terminusofPhi29DNApolymeraseinDNAandterminalproteinbinding.Truniger等2004.NucleicAcidsResearch32,371.A姆指subdomainmutantofthelargefragmentofEscherichiacoliDNApolymeraseIwithreducedDNAbindingaffinity,processivityandframeshiftfidelity.Minnick等1996.J.Biol.Chem.,271.24954.IdentificationofresiduescriticalforthepolymeraseactivityoftheKlenowfragmentofDNApolymeraseIfromEscherichiacoli.Polesky等1990.J.Biol.Chem.,265,14579.CloningofthermostableDNApolymerasesfromhyperthermophilicmarinearchaeawithemphasisonThermococcussp.9°N-7andmutationsaffecting3，-5'exonucleaseactivity.Southworth等1996.PNAS.93，5281StructureofthereplicatingcomplexofapolalphafamilyDNApolymerase.Franklin等2001.Cell105，657.CrystalstructureofapolalphafamilyDNApolymerasefromthehyperthermophilicarchaeonThermococcussp.9QN-7.Rodriguez等2000.J.Mol.Biol"299,471.權(quán)利要求1.改變的聚合酶，其與DNA的親和力降低，從而使所述聚合酶與對(duì)照聚合酶相比能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中。2.改變的聚合酶，其與DNA的親和力降低，從而使所述聚合酶與對(duì)照聚合酶相比能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的聚合酶，其中對(duì)照聚合酶與所述聚合酶的類型相同。4.權(quán)利要求l至3中任一項(xiàng)的聚合酶，其中所述對(duì)照聚合酶包含功能等價(jià)于9°NDNA聚合酶^^酸序列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val的替換突變。5.權(quán)利要求4的聚合酶，其中所述對(duì)照聚合酶還包含功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶M酸序列中Cys223Ser的替換突變。6.權(quán)利要求4或5的聚合酶，其中所^f照聚合酶為9。NDNA聚合酵。7.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中殘基的至少一個(gè)突變，所述殘J^I定該聚合酶與DNA的相互作用。8.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中殘基的至少一個(gè)突變，所述殘基與DNA結(jié)合。9.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中殘基的至少一個(gè)突變。10.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述改變包含所述聚合酶中堿性氨基酸殘基的至少一個(gè)突變。11.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述改變包含至少一個(gè)替換突變。12.權(quán)利要求ll的聚合酶，其包含兩個(gè)替換突變。13.前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述聚合酶為DNA聚合酶。14.根據(jù)權(quán)利要求13的聚合酶，其中所述DNA聚合酶為B家族類型DNA聚合酶。15.根據(jù)權(quán)利要求14的聚合酶，所述聚合酶選自任何B家族古細(xì)菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶a或T4、RB69和(j)29噬菌體DNA聚合酶。16.根據(jù)權(quán)利要求15的B家族古細(xì)菌DNA聚合酶，其選自Vent、DeepVent、9°N和Pfu聚合酶。17.根據(jù)權(quán)利要求16的聚合酶，其中所述B家族古細(xì)菌DNA聚合酶為9°N聚合酶。18.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其中所述聚合酶與核苦酸的親和力和/或該聚合酶的保真復(fù)基本不受所述改變的影響。19.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的聚合酶，其在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Lys705、Arg713和/或Arg743的位置上包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)替換為不同氨基酸的M酸替換突變。20.改變的聚合酶，其在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶M紗列中Lys705、Arg713和/或Arg743的位置上包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)替換為不同氨基酸的M酸替換突變。21.根據(jù)權(quán)利要求20的聚合酶，其在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶氨基酸序列中Arg713或Arg743的位置上包含至少一個(gè)替換為不同氨基酸的氨基酸替換突變。22.前述任一權(quán)利要求的改變聚合酶，其在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶^JJ^f列中Arg606和/或His679的位置上包含一個(gè)或兩個(gè)替換為不同氣基酸的氛基酸替換突變。23.改變的聚合酶，其在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶M酸序列中Arg606和/或His679的位置上包含一個(gè)或兩個(gè)替換為不同氨基酸的氨基酸替換突變。24.改變的聚合酶，其在功能等價(jià)于RB69DNA聚合酶^酸序列中Lys790、Lys800、Arg806、Lys844、Lys874和/或Lys878的位置上包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)替換為不同氨基酸的^酸替換突變。25.根據(jù)權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)的聚合酶，其中所述替換突變將被替換的氨基酸轉(zhuǎn)換為非堿性氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25的聚合酶，其中所述替換突變將被替換氨基酸轉(zhuǎn)換為選自以下的氨基酸W酸性氨基酸，(ii)芳族氨基酸，尤其是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F);和(iii)非極性氨基酸，尤其是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或曱石危氨酸(M)。27.根據(jù)權(quán)利要求26的聚合酶，其中所述替換突變將被替換氨基酸轉(zhuǎn)換為丙氨酸。28.改變的聚合酶，其包含功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶M酸序列中Lys705Ala和/或Arg713Ala和/或Arg743Ala的替換突變。29.權(quán)利要求28所述改變的聚合酶，其包含功能等價(jià)于Arg713Ala的絲酸替換。30.權(quán)利要求28或29所述改變的聚合酶，其包含功能等價(jià)于Arg743Ala的^J^酸替換。31.前述任一權(quán)利要求所述改變的聚合酶，還在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置上包含一個(gè)或多個(gè)氛基酸替換突變。32.權(quán)利要求31所述改變的聚合酶，其包含功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶^J^酸序列中Leu408Tyr、Tyr409Ala和Pro410Val的替換突變。33.先前任一權(quán)利要求所述改變的聚合酶，還在功能等價(jià)于9。NDNA聚合酶Jl&^列中Cys223的位置上包含替換為不同M酸的替換突變。34.權(quán)利要求33所述改變的聚合酶，其中所述聚合酶包含功能等價(jià)于9°N聚合酶M酸序列中Cys223Ser的替換突變。35.改變的9。N聚合酶，其包含SEQIDNO:1、3、5或21中任一氨基酸序列。36.核酸分子，其編碼前a利要求中任一項(xiàng)所述改變的聚合酶。37.根據(jù)權(quán)利要求36的核酸分子，其編碼改變的9。N聚合酶，所述核酸分子包含SEQIDNO:2、4或6的核苷酸序列。38.包含SEQIDNO.19或20的核苦酸序列的核酸分子。39.表達(dá)栽體，其包含權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)的核酸分子。40.包含權(quán)利要求39所述栽體的宿主細(xì)胞。41.聚合酶用于將標(biāo)記核苷酸摻入多核苷酸的用途，所述聚合酶已被改變以顯示降低的DNA親和力，從而使該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將標(biāo)記核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中，所述標(biāo)記用于確定加入的核苷酸的性質(zhì)。42.權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)的聚合酶用于將核苷酸摻入多核苦酸的用途。43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的用途，其中所述摻入發(fā)生在聚蔟陣列上。44.將標(biāo)記核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)聚合酶，其已被改變以顯示降低的DNA親和力，從而使該聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將標(biāo)記核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中；(ii)DNA模板；和(m)核苷酸溶液。45.將核苷酸摻入DNA的方法，包括使以下組分相互作用(i)根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)的聚合酶；(ii)DNA模板；和(iii)核苷酸溶液。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的方法，其中所述DNA模板包含聚蔟陣列。47.用于進(jìn)行核苷酸摻入反應(yīng)的試劑盒，其包含權(quán)利要求1至36任一項(xiàng)中所述聚合酶和核苷酸溶液。48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述核苷酸溶液包含標(biāo)記核苷酸。49.權(quán)利要求47或48的試劑盒，其中所述核苷酸包含合成核苷酸。50.權(quán)利要求47至49中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述核苷酸包含修飾的核苷酸。51.權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中所述核苷酸已在3，糖羥基處進(jìn)行了修飾，以使取代基在大小上大于天然存在的3，羥基。52.根據(jù)權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述已在3'糖羥基處進(jìn)行修飾以使取4^在大小上大于天然存在3，羥基的核苷酸包^^飾的核苷酸或核苷分子，所述修飾的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧咬威基以及具有與其共價(jià)連接的可去除3'-OH阻斷基的核糖或脫氧核糖糖部分，從而使3，碳原子與以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)連接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中Z代表C(R，)2誦OR"、-C(R，)2-N(R，，)2、-C(R，)2-N(H)R"、-C(R，)2-S-R"和-C(R，)2-F中的任何一種，其中每個(gè)R"為可去除保護(hù)基團(tuán)或其一部分；每個(gè)R，獨(dú)立地為氫原子、烷基、取代烷基、芳基垸基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、?；⑶杌?、烷氣基、芳氧基、雜芳氡基或M，或者通過(guò)連接基團(tuán)連接的檢測(cè)標(biāo)記；或者(R，)2代表式為^C(R，，，)2的亞烷基，其中每個(gè)R"，可以是相同或不同的，并選自氫、鹵素原子和烷基；以及其中所述分子可以反應(yīng)生成中間體，其中每個(gè)R"交換為H,或者當(dāng)Z為-C(R，)2-F時(shí)F交換為OH、SH或NH2，優(yōu)選OH，所述中間體在水性M下發(fā)生解離，從而提供帶有游離3，OH的分子；其條件為當(dāng)Z為-C(R，)2-S-R"時(shí)，兩個(gè)R，基團(tuán)不全是H。53.根據(jù)權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述修飾的核普酸或核苦的R，為烷基或取代烷基。54.根據(jù)權(quán)利要求53的試劑盒，其中所述修飾的核苷酸或核苷的-Z為式-C(R，)2-N3。55.根據(jù)權(quán)利要求54的試劑盒，其中Z為疊氮曱基。56.根據(jù)權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述已在3，糖羥基處進(jìn)行修飾以使取代基在大小上大于天然存在3，羥基的核香酸已被標(biāo)記，以允許進(jìn)行檢測(cè)。57.根據(jù)權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述已在3，糖羥基處進(jìn)行修飾以使取代基在大小上大于天然存在3，羥基的核苷酸包含^通過(guò)可切割連接子與檢測(cè)標(biāo)記連接的核苦酸或核苷，其特征在于所述可切割連接子含有選自以下的部分(其中X選自包括以下的集合O、S、NH和NQ，其中Q為Cw。的取代或未取代烷基，Y選自O(shè)、S、NH和N(烯丙基)，T為氫或d.1{)的取代或未取代烷基，*表示所述部分與核苷酸或核苷的其它部分相連的位置)。58.根據(jù)權(quán)利要求57的試劑盒，其中所述檢測(cè)標(biāo)記包括熒光標(biāo)記。59.才艮據(jù)權(quán)利要求47至58中任一項(xiàng)的試劑盒，其還包含一種或多種DNA模板分子和/或引物。60.權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)所述聚合酶的生產(chǎn)方法，包括(i)選擇聚合酶中用于誘變的適當(dāng)殘基；(ii)根據(jù)(i)的選擇產(chǎn)生突變體聚合酶；(iii)檢測(cè)所述突變體聚合酶與DNA的親和力；和(iv)如果與DNA的親和力降低，則檢測(cè)所述聚合酶在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物的能力。61.上文參考附圖描述的改變的聚合酶。62.上文參考附圖描述的用途。63.上文參考附圖描述的摻入核苷酸的方法。64.上文參考附圖描述的試劑盒。65.上文參考附圖描述的聚合酶的生產(chǎn)方法。全文摘要經(jīng)修飾的DNA聚合酶對(duì)DNA具有親和力，使得所述聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中將一個(gè)或多個(gè)核苷酸摻入多個(gè)分開的DNA模板中。所述聚合酶能夠在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中形成數(shù)目增加的生產(chǎn)性聚合酶-DNA復(fù)合物。所述經(jīng)修飾的聚合酶可以用于許多DNA測(cè)序應(yīng)用中，尤其是在聚簇陣列中。文檔編號(hào)C12N9/12GK101180390SQ200680016045公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年5月10日優(yōu)先權(quán)日2005年5月10日發(fā)明者尚卡爾·巴拉蘇布拉馬尼亞姆,托拜厄斯·威廉·巴爾·奧斯特,拉克爾·馬里亞·桑切斯,杰弗里·保羅·史密斯,羅伯托·里加蒂申請(qǐng)人:索萊克薩有限公司