專利名稱：：表達cry1ab的殺昆蟲轉基因棉ce43-67b的制作方法表達CRY1AB的殺昆蟲轉基因棉CE43-67B本發(fā)明涉及，尤其是，多核苷酸及其使用方法，尤其涉及含有所述多核苷酸的棉花植物。更具體地說，本發(fā)明涉及命名為CE43-67B的棉花事件(event),所述棉花事件含有CrylAb基因。本發(fā)明還涉及鑒定特定棉花事件的方法，所述棉花事件包含能夠賦予所述棉花植物以昆蟲抗性的基因。植物害蟲是導致世界重要農業(yè)作物損失的一個主要因素。美國每年由包括昆蟲在內的非哺乳動物害蟲侵襲導致的損失約為80億美元。除田地作物損失外，昆蟲害蟲也為果蔬種植者、觀賞花卉生產(chǎn)者和家庭園藝師造成負擔。昆蟲害蟲主要通過廣泛應用化學殺蟲劑來控制，所述化學殺蟲劑通過抑制昆蟲生長、防止昆蟲進食或繁育或導致昆蟲死亡來發(fā)揮活性。由此可以實現(xiàn)對昆蟲害蟲的良好控制，但是這些化學物質有時也會影響其它有益昆蟲。廣泛使用化學殺蟲劑所導致的另一個問題是抗性昆蟲種的出現(xiàn)。通過各種抗性管理實踐，已經(jīng)使這一問題得到了緩解，但是對于害蟲控制劑替代品的需要仍不斷增長。生物害蟲控制劑，比如表達象5-內毒素這樣的殺蟲毒素的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌林，也已被用于作物植物并取得了令人滿意的結果，這為化學殺蟲劑提供了一種替代品或者補充。編碼某些5-內毒素的基因已被分離，并且它們在異源宿主中的表達已經(jīng)顯示為控制經(jīng)濟重要昆蟲害蟲提供了另一工具。尤其是，來自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲毒素CrylAc在轉基因植物中的表達已經(jīng)為對抗所選擇昆蟲害蟲提供了有效保護，并且表達該毒素的轉基因植物已經(jīng)被商業(yè)化，這使得農民能夠減少化學昆蟲控制劑的使用。CrylAc是一個由不同的蘇云金芽孢桿菌菌林產(chǎn)生的殺昆蟲毒素大家族中的一員。該家族中的各毒素都具有獨特的殺昆蟲活性鐠。才帛類&物才帛屬(Gossypium)《4帛，#(Malvaceae)的一個成員，由39個種組成，其中陸地棉(Gossypiumhirsutum)是最常見的栽培種。三個其它的種也有種植樹棉(G.arboreum)、海島棉(G.barbadense)和草棉(G.herbaceum)。種植這些栽培種主要用于獲得制成紡織品的種子纖維。由于棉花的成熟干纖維以一種能夠由其紡成細而結實的線的方式捻在一起，因而棉花適于作為紡織纖維。其它產(chǎn)品，比如棉籽油、油餅和棉籽絨是纖維生產(chǎn)的副產(chǎn)品。每年全世界昆蟲害蟲對棉花作物的損害導致顯著的產(chǎn)量下降。對這些害蟲的有效控制從而使產(chǎn)量下降減少到最低程度具有重要的經(jīng)濟意義。棉花昆蟲害蟲的例子包括甜菜夜蛾(&^/o;^eraei/^;a)，棉鈴象U/^力o/7cwz/s^ra/7^/s^ra/7tf/s)，粉紋夜械(rr2'c力op/i/s/a/22.)，云纟丈盲棒(Afewroco7/7iAy/"6/7i/s")，才帛坊(J;7力/'sgossy;7//),谷實夜織(^e72.ocore,;a,"t刀才艮蟲(豐立膚地虎(尸e/〃asy6fei"rs/7ea/)，豆雜色夜蛾(尸er他o鵬sai/c/a)，小地老虎(^r"/、//7"7o")),歐洲玉米螟(<^r/"/a/7w627a//'s)，草地貪夜蛾(5^油/^era/Vw^7;e油)，Pinkbollworm(戶ec〃刀o/7力era)，花薊馬屬(尸/^/^///^//<3s卯.),大豆夜蛾(/^ei/c^7ys/a//7c/uf/e/251)，蝽象(稻綠蝽(yVezarar/Wc^/7a),喜綠蝽(Jcrc^ei77咖力2'/are),褐臭蝽(五i/sc/n'"wsser,))，牧草盲蝽U/^""eo/ar/力,煙蜂夜蛾07e/io^/sF2'resce/2S)和粉氛(結翅粉氛(rr7a7ewrof/esa6i/f2'/o/2ea),甘薯粉虱(to7/s/afa6sc/))。如今，棉花植物的轉化和再生已經(jīng)是一個建立得很完善的流程，主要基于根癌農桿菌介導的外源DNA向棉花植物部分的轉化以及所述棉花植物部分在組織培養(yǎng)中再生成完全能育性轉基因棉花植林。需要產(chǎn)生一種新的抗昆蟲棉花植物，由此減少由昆蟲害蟲對棉花作物的損害導致的產(chǎn)量下降?？估ハx棉植物可減少可能對其它有益昆蟲以及環(huán)境有害的化學殺蟲劑的應用需求。尤其是，想要提供一種替代含有來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAc基因的轉基因植物的抗昆蟲植物。本發(fā)明提供，尤其是，一種特定的棉花事件(下文中稱作"CE43-67B")及其鑒定方法。該特定的事件是主要是基于其農藝表現(xiàn)、功效和分子特征選擇出的。據(jù)信，主要根據(jù)轉化過程中的轉基因整合位點，該事件的特征遠遠優(yōu)于類似的轉化體。本申請上下文中的"CE43-67B事件"指本文所述的原始殺昆蟲轉基因棉花植物以及任何由其衍生的植物材料，包括種子。本文中所指的"殺昆蟲"指對昆蟲的任何抑制效果，包括但不限于降低攝食、生長遲緩、生殖力下降、麻痹或死亡。"生殖力"包括涉及繁殖的所有方面，比如繁殖能力、繁殖頻率和后代數(shù)量。本發(fā)明中還包括衍生自CE43-67B事件的任何植物材料，包括種子。CE43_67B事件表現(xiàn)出包含至少一個表達盒的新基因型。該表達盒包含與編碼CrylAb殺昆蟲毒素的基因可操作性相連的用于在植物中表達的適當啟動子(所述毒素可用于控制廣譜鱗翅類昆蟲害蟲)以及適宜的多腺苷酸化信號。適宜的啟動子可分離自，尤其是，植物。許多植物啟動子已被分離并分析特征，包括組成型的、可轉換的和/或組織特異性的啟動子。適宜的啟動子可選擇下述，但不限于此CaMV35S、FMV35S、UbiquiUn(遍在蛋白)、Act2、N0S、0CS、夜香樹屬黃葉巻曲病毒(Cestrumyellowleafcurlvirus)啟動子、Patatin、E9、alcA/alcR開關、GST開關、RMS開關、油質蛋白、Gelvin、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基、肌動蛋白7、MR7啟動子(玉米)、Gos9(水稻)、G0S2啟動子、Mas0cs(或超啟動子)、RolD啟動子(毛根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes))、SuperMAS啟動子和Suc2啟動子(擬南芥屬(Arabidopsis))。在本發(fā)明的一種實施方案中，該啟動子是來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的肌動蛋白啟動子，ACT2。為提高基因表達水平，該表達盒中還可以整合進比如增強子序列這樣的其它元件，例如轉錄或翻譯增強子，比如煙草蝕刻病毒(TEV)翻譯激活子，CaMV35S增強子和FMV35S增強子?；蛘撸部赡芟Ｍò邢蛐蛄?，例如，以指導CrylAb毒素轉運至特定細胞區(qū)室。例如，想要提供提供胞外蛋白的話，則可將胞外靶向序列與編碼CrylAb蛋白的多核苷酸連接。粑向的另一個例子包括，靶向特定的胞內細胞器或區(qū)室，例如用"KDEL"保持序列靶向內質網(wǎng)。許多多腺苷酸化信號已被分離并分析特征。在植物中發(fā)揮功能的適當多腺苷酸化信號的例子包括來自根癌農桿菌胭脂堿合酶基因(nos)的、來自蛋白酶抑制劑II基因和來自oc-微管蛋白基因的那些(EP-A652,286)。在本發(fā)明的一種實施方案中，多腺苷酸化信號是來自根癌農桿菌的NO基因的多腺苷酸化信號。編碼CrylAb蛋白的多核苷酸可以是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的或者在其它方面經(jīng)過改變的從而一旦引入植物材料中后增強例如翻譯。這樣的密碼子優(yōu)化也可用于改變在任何轉化細胞中產(chǎn)生的RM轉錄體預計的二級結構，或者破壞存在于未改變轉錄體中的隱秘的RNA不穩(wěn)定性元件，由此提高轉化細胞中轉錄體的穩(wěn)定性和/或可利用性(AblerandGreen(1996)PlantMolecularBiology(32)第63—78頁)。密碼子優(yōu)化還可用于改變異源DM編碼序列，由此更接近地類似于宿主基因的編碼序列。例如，可以對細菌基因做密碼子優(yōu)化以提高胞嗜咬和鳥嘌呤堿基對腺噤呤和胸腺嘧咬堿基的比例，由此它更接近地類似于植物(例如棉花或玉米)基因，但仍然編碼相同的蛋白。這樣的密碼子優(yōu)化可根據(jù)標準密碼子使用表來完成。在CE43-67B事件的一個前體中，存在包含在表達時可用作選擇標記的基因的第二盒。許多選擇標記已被表征，包括一些賦予抗生素耐受性的以及其它一些賦予除草劑耐受性的。適宜的選擇標記基因的例子包括那些賦予潮霉素、卡那霉素和慶大霉素耐受性的基因。其它適宜的選擇標記包括賦予除草劑(比如基于草甘膦的除草劑)抗性的基因或者賦予毒素(比如eutypine)抗性的基因。還可得到其它選擇形式，比如基于激素的選擇系統(tǒng)，比如HiroyrasuEbinuma等人(1997)PNASVol.94pp.2117-2121的MultiAutoTransformation(MAT)系統(tǒng)；^使用已知綠色熒光蛋白，Pglucoronidase的可視化選擇系統(tǒng)；以及任何其它選擇系統(tǒng)，比如甘露糖異構酶(Positech)、木糖異構酶和2-脫氧葡萄糖(2-DOG)。在本發(fā)明的一種實施方案中，選擇標記基因是一種賦予潮霉素耐性的基因。這第二個表達盒可用于在植物轉化過程中或之后選擇轉化體?？蛇x地，可以在轉化后將其從CE43-67B事件前體中分離出來而僅保留CE43-67B事件本身。CE43-67B事件本身不含選擇標記盒。其它的表達盒可選地包括在CE43-67B事件中。例如，這些表達盒可以提供編碼不同殺昆蟲毒素比如VIP3A的基因。作為替代方案，這些表達盒可提供其它令人滿意的效果，比如除草劑抗性。這些表達盒可以在相同或不同的質粒上被導入植物。如果表達盒存在于同一質粒上并經(jīng)農桿菌介導的轉化方法被導入植物中，則它們可以存在于相同或不同的T-DNA區(qū)域內。在本發(fā)明的一種實施方案中，兩個表達盒存在于不同質粒內的不同T-DNA區(qū)域上。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種含有含如SEQIDN0:l所示序列的笫一區(qū)和含如SEQIDNO:2所示序列的第二區(qū)的多核普酸。在又一種實施方案中，所述多核苷酸含有可以通過擴增反應擴增出來的區(qū)域，所述擴增反應使用如SEQIDNO:5和6或SEQIDNO:ll和U所示的引物。在又一種實施方案中，所迷多核苷酸還含有編碼來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAb基因的區(qū)域。在又一種實施方案中，所述多核苷酸含有提供與所述CrylAb基因可操作性相連的擬南芥屬肌動蛋白啟動子。在本發(fā)明的又一個方面提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少20個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少25個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少35個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少40個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少50個連續(xù)核苦酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列。還提供了一種多核苷酸，其含有SEQIDNO:1的至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核苷酸，所述多核苦酸包含SEQIDNO:1第275和276位核苷酸之間的核苷酸連接點(junction)。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:l所示序列。還提供了與上述序列互補的序列。在本發(fā)明的又一個方面提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少20個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少25個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少35個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少40個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDN0:2第104~163位核苷酸所示序列中至少50個連續(xù)核苷酸。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列。還提供了一種多核苷酸，其含有SEQIDNO:2的至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:2第133和134位核苷酸之間的核苷酸連接點。還提供了一種多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2所示序列。還提供了與上述序列互補的序列。在又一種實施方案中，提供了含有上述多核苷酸的棉花植物。在又一種實施方案中，提供了含有上述多核苷酸的棉花種子。在又一種實施方案中，所述植物是作為CE43-67B事件前體的殺昆蟲棉花植物，CE43-67B事件本身，或者是從其衍生的仍然包含上述多核普酸的植物。在又一種實施方案中，所述植物含有第二表達盒。在一種實施方案中，所述第二表達盒編碼VIP3A殺昆蟲毒素。在另一種實施方案中，所述第二表達盒編碼提供除草劑抗性的蛋白質，所述除草劑包括草甘膦酸或其農業(yè)可接受鹽。本領域技術人員熟悉植物轉化方法。尤其是，已在廣泛植物種中表征過兩種主要技術農桿菌轉化和通過直接DM轉移的轉化。農桿菌介導的轉化是一種雙子葉植物常用轉化方法。將欲導入植物的外源DNA克隆進二元載體的左右邊界共有序列之間。此為T-DNA區(qū)。將二元載體轉移進農桿菌細胞，其隨后用于感染植物組織。含有外源DM的載體T-DNA區(qū)被插入植物基因組。標記基因盒和性狀基因盒可存在于相同載體的同一T-DM區(qū)、不同T-DNA區(qū)，或者甚至是不同載體的不同T-DNA區(qū)。在本發(fā)明的一種實施方案中，該盒存在于不同載體的不同T-DNA區(qū)。作為替代方案，直接DNA轉移可用于將DNA直接導入植物細胞。一種適宜的直接轉移方法可以是借助粒子槍用含有待插入DNA的載體對植物細胞進行轟擊(粒子介導的生物射彈轉化)；另一種已經(jīng)建立的方法，"whiskers"，涉及將DM包被到將刺入細胞的碳化硅纖維上。其它轉化植物細胞的方法包括原生質體轉化(可選地在聚乙二醇存在下)；在含有多核苷酸或載體的介質中對植物組織、細胞或原生質體進行超聲波；多核苷酸或栽體顯微插入植物材料(可選地使用已知的碳化硅"whiskers"技術)、電穿孔法等。轉化后，從轉化植物組織再生出轉基因植物，利用比如潮霉素抗性這樣的適宜標記來選擇帶有外源DNA的后代。技術人員熟悉適宜的再生培養(yǎng)基組成。可通過常規(guī)的植物育種方法將可選擇標記與轉基因事件中分離，由此得到例如CE43-67B事件。如本文所述，本發(fā)明的植物對可能侵襲它的來自選自實夜蛾屬(Heliothissp.)和Helicoverpasp.的一個或多個種的昆蟲有殺昆蟲作用。本文所使用的"侵襲，，指被一或多種昆蟲以任何方式攻擊、定居、進食或損害。這樣，例如，本發(fā)明的植物將提供對抗比如谷實夜蛾(Helicoverpazea)這樣的昆蟲害蟲侵襲的自我防御機制。因此，與相同品種的非轉基因棉花植物相比，在栽種所述植物過程中將需要噴灑更少的殺蟲劑，并將由昆蟲害蟲導致的產(chǎn)量損失控制在一個最低的水平。本發(fā)明不限于CE43-67B事件本身，而是還延伸至包括由其衍生的任何植物材料，包括種子，只要它們包含至少一種本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明包括，但不限于源自與CE43-67B事件育種雜交的植物，或通過常規(guī)育種或其它方法得到的衍生物。本發(fā)明還包括衍生自CE43-67B的植物材料，其與CE43-67B事件相比可含有額外的、經(jīng)修飾的或更少的多核苷酸序列或表現(xiàn)出其它的表型特征。例如，可能期望對衍生自CE43-67B事件的植物材料進行轉化從而產(chǎn)生一種具有另外的性狀，比如第二種抗昆蟲基因，的新事件。這一過程稱為基因堆積(genestacking)。第二種昆蟲抗性基因可編碼，例如抗昆蟲凝集素、抗昆蟲蛋白酶抑制劑和源自蘇云金芽孢桿菌、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophilus)或發(fā)光光桿狀菌(Photorabdusluminescens)物種的殺昆蟲蛋白質。在一個方面，第二種昆蟲抗性基因編碼來自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲基因。優(yōu)選地，第二種昆蟲抗性基因編碼來自細菌蘇云金芽孢桿菌的VIP基因，該VIP基因產(chǎn)生具有與CrylAb不同的作用方式或在昆蟲腸道內不同的結合位點的毒素以控制不同的昆蟲種。該VIP基因可以是，例如VIP3A。本發(fā)明還提供衍生自CE43-67B事件的植物材料，其具有比如除草劑抗性、線蟲抗性或真菌抗性這樣的其它性狀。在一種實施方案中，所述性狀是除草劑抗性。除草劑抗性性狀可通過，例如，除草劑降解酶、或靶位點特異性抗性酶來提供。在又一種實施方案中，所述除草劑抗性性狀提供對包括草甘膦酸或其農業(yè)可接受鹽的除草劑的抗性。在又一種實施方案中，所述除草劑抗性性狀由編碼EPSP合酶或其突變體的基因提供。本發(fā)明還提供一種控制昆蟲的方法，包括在所述昆蟲取食的場所提供CE43-67B事件或衍生自CE43-67B事件的植物材料。本發(fā)明還提高一種控制昆蟲的方法，包括在所述昆蟲取食的場所提供CE43-67B事件或衍生自CE43-67B事件的植物材料，并向所述植物材料應用其它的農業(yè)化學物質，比如除草劑、殺真菌劑和其它的包括其它殺昆蟲蛋白在內的殺昆蟲化合物。可能的殺昆蟲化合物的例子包括殺昆蟲凝集素、殺衍生蟲蛋白酶抑制劑和來自蘇云金芽孢桿菌、嗜線蟲致病桿菌或發(fā)光光桿狀菌的殺昆蟲蛋白。可能的化合物的例子包括除蟲菊酯類、氨基甲酸醌類、吡蟲啉、有機氯制劑和比如多殺菌素、阿維菌素或依馬菌素這樣的大分子。本發(fā)明還提供檢測衍生自CE43-67B事件的植物材料的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物材料基因組DM的樣品；(b)獲得適用于擴增反應以擴增選自以下的序列的引物對(i)含如SEQIDNO:3所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列和(ii)含如SEQIDNO:4所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列；(c)將所述引物對加入到所述樣品以及用于實施擴增反應的工具中；(d)實施擴增反應；和(e)將擴增得到的序列可視化。根據(jù)本發(fā)明的方法，有許多擴增方法可以使用?；驹恚绢I域技術人員的一項已知技術，是聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR反應的是在用瓊脂糖凝膠電泳進行大小分離之后。在本發(fā)明的一種特定實施方案中，可以使用比如TaqManTM這樣的PCR變化方法。這樣的技術涉及用熒光染料對擴增過程中的至少一種引物進行標記。如果未結合，則引物會采取一種導致無法檢測到萸光的構象。然而，當引物結合到一段DNA上時，則構象發(fā)生變化，能夠檢測到焚光。通過這種方式，可以對擴增過程進行實時控制，熒光強度直接對應于擴增水平。TaqManTM分析可用于例如檢測野生型棉花背景中CE43-67B事件的存在，或者在其它種質中檢測CE43-67B的偶然存在。本發(fā)明的其它實施方案包括但不限于RACEPCR。本發(fā)明的又一實施方案涉及用多重PCR(multiplexPCR)來區(qū)分純合CE43-67B植物材料和雜合CE43-67B植物材料。這是本領域技術人員已知的合子型測試(zygositytest)，涉及使用與棉花基因組和/或插入DNA的特定部分結合的三種PCR引物。特定大小的兩種擴增產(chǎn)物每一種的存在或缺少表示測試樣品是否為CE43-67B純合或雜合。適宜在這樣的合子型測試中使用的引物如SEQIDN05、6和8所示?？梢栽谶@樣的合子型測試中使用的替代適宜引物如SEQIDNO10、11和12所示。也可以利用用不同的熒光探針標記的引物來設計合子型測試，由此擴增產(chǎn)物的焚光顏色表示測試樣品是否為CE43-67B純合或雜合。本發(fā)明還提供檢測包含如SEQIDNO:1所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備含有待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得適用于在擴增反應中擴增出含有如SEQIDNO:3所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列的引物對；(c)將所述引物對加入到所述樣品和用于實施擴增反應的工具中；(d)實施擴增反應；和(e)將擴增到的序列可視化。本發(fā)明還提供一種如上所述的方法，其中所述引物適用于在擴增反應中擴增出含如SEQIDNO:3所示序列中至少20個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增出含如SEQIDNO:3所示序列中至少25個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增出含如SEQIDNO:3所示序列的序列及其互補序列。本發(fā)明還提供一種如上所述的方法，其中將被所述擴增反應擴增出的序列含有包含如SEQIDNO:l核苷酸275/276提供的基因組序歹'J-轉基因盒插入物的核苷酸連接點(g-g)的序列。本領域技術人員將理解，該連接點可用于表征并由此鑒定該事件，并且設計和產(chǎn)生適用于在擴增反應中擴增含有前述連接點的序列的寡核苷酸引物序列，是在所述技術人員熟練掌握范圍內的。本領域技術人員還可以理解，可以根據(jù)位于SEQIDNO:1的第一位核苷酸5，(也即上游)的基因組序列和位于SEQIDNO:1的第545位核苷酸3，(也即下游)的插入物或基因組序列來設計適用于擴增反應的引物序列。本發(fā)明還提供一種檢測含有如SEQIDNO:1所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得適用于擴增反應以擴增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少35個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列的引物對；(c)將所述引物對加入到所述樣品以及用于實施擴增反應的工具中；(d)實施擴增反應；和(e)將擴增得到的序列可視化。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少40個連續(xù)核苷酸的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少50個連續(xù)核苷酸的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:1中至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核苷酸的序列，所述序列包含SEQIDNO:1笫275和276之間的核苷酸連接點。以上所提及的引物適用于在擴增反應中擴增以上提到的序列及其互補序列。本發(fā)明還提供作為上述方法的擴增產(chǎn)物的序列。本發(fā)明還提供所述序列的互補序列。本發(fā)明還提供一種上述方法，其中的擴增產(chǎn)物包含上述序列。本發(fā)明還提供一種上述方法，其中所述引物對包含正向引物，其含有當以5，^3，方向讀取時與如SEQIDNO:1核苷酸1275所示序列的區(qū)域相同的序列，和反向引物，其含有當以5，+3，方向讀取時與如SEQIDNO:1核苷酸276~545所示序列的反向互補序列的區(qū)域相同的序列。本領域技術人員將認識到，可以根據(jù)本文所提供的序列及其互補序列創(chuàng)造出許多適用于本發(fā)明方法的引物。此外，如以上所提到的，這樣的引物序列可以基于如SEQIDN0:1所示序列5，和3，(上游和下游)的序列，而且鑒定這樣的5，和3，序列是在本領域技術人員熟練能力范圍內的。在本發(fā)明的一種特定實施方案中，所述引物對含有SEQIDNO:5和6所示的序列。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述引物對含有如SEQIDNO:9和10所示的序列。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述引物對含有如SEQIDNO:11和12所示的序列。本發(fā)明還提供一種檢測包含如SEQIDNO:2所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備包含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得適用于在擴增反應中擴增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列；(c)將所述引物對加入到所述樣品和實施擴增反應的工具中；(d)實施擴增反應；和(e)將擴增到的序列可視化。本發(fā)明還提供一種如上所述的方法，所述引物適用于在擴增反應中擴增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少20個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少25個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含有如SEQIDNO:4所示序列的序列及其互補序列。本發(fā)明還提供一種如上所述的方法，其中將被所述擴增反應擴增出的序列含有包含如SEQIDNO:2核苷酸133/134提供的轉基因盒插入物-基因組序列的核苷酸連接點(t-a)的序列。本領域技術人員將理解，該連接點可用于表征并由此鑒定該事件，并且設計和產(chǎn)生適用于在擴增反應中擴增含有前述連接點的序列的寡核苷酸引物序列，是在所述技術人員熟練掌握范圍內的。本領域技術人員還可以理解，可以根據(jù)位于SEQIDNO:2的笫一位核苷酸5，(也即上游)的插入物或基因組序列和位于SEQIDNO:2的第1198位核苷酸3，(也即下游)的基因組序列來設計適用于擴增反應的引物序列。本發(fā)明還提供一種檢測含有如SEQIDNO:2所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得適用于擴增反應以擴增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少35個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列的引物對；(c)將所述引物對加入到所述樣品以及用于實施擴增反應的工具中；(d)實施擴增反應；和(e)將擴增得到的序列可視化。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少40個連續(xù)核苷酸的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少50個連續(xù)核苷酸的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列的序列。在又一種實施方案中，所述引物適用于在擴增反應中擴增含如SEQIDNO:2中至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核苷酸的序列，所述序列包含SEQIDNO:2第133和134位核苷酸之間的核苷酸連接點。以上所提及的引物適用于在擴增反應中擴增以上提到的序列及其互補序列。本發(fā)明還提供作為上述方法的擴增產(chǎn)物的序列。本發(fā)明還提供所述序列的互補序列。本發(fā)明還提供一種上述方法，其中的擴增產(chǎn)物包含上述序列。本發(fā)明還提供一種上述方法，其中所述引物對包含正向引物，其含有當以5，+3，方向讀取時與如SEQIDN0:2核苷酸1~133所示序列的區(qū)域相同的序列，和反向引物，其含有當以5，+3，方向讀取時與如SEQIDN0:2核苷酸134~1198所示序列的反向互補序列的區(qū)域相同的序列。本領域技術人員將認識到，可以根據(jù)本文所提供的序列及其互補序列創(chuàng)造出許多適用于本發(fā)明方法的引物。此外，如以上所提到的，這樣的引物序列可以基于如SEQIDNO:2所示序列5，和3，(上游和下游)的序列，而且鑒定這樣的5，和3，序列是在本領域技術人員熟練能力范圍內的。本發(fā)明還提供一種檢測衍生自CE43-67B事件的植物材料的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得能夠與選自以下的序列雜交的探針含如SEQIDNO:3所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列和含如SEQIDN0:4所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列；(c)在允許所述探針與所述樣品中的互補核酸雜交的條件下，將至少一種步驟(b)的探針加入到所述樣品中；(d)通過洗滌除去實質上未雜交的探針；和(e)檢測由此雜交的探針以鑒定該樣品是否來自CEC-67B事件。本發(fā)明還提供一種檢測包含如SEQIDNO:1所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得能夠與含如SEQIDNO:3所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列雜交的探針；(c)在允許所述探針與所述樣品中的互補核酸雜交的條件下，將探針加入到所述樣品中；(d)通過洗滌除去實質上未雜交的探針；和(e)檢測由此雜交的探針以鑒定該樣品是否包含所述多核苷酸。本發(fā)明還提供一種檢測包含如SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DNA的樣品；(b)獲得能夠與含如SEQIDNO:4所示序列中至少18個連續(xù)核苷酸的序列雜交的探針；(c)在允許所述探針與所述樣品中的互補核酸雜交的條件下，將探針加入到所述樣品中；(d)通過洗滌除去實質上未雜交的探針；和(e)檢測由此雜交的探針以鑒定該樣品是否包含所述多核苷酸。在上述方法的一種特定實施方案中，所述探針含有至少20個連續(xù)核苷酸。在所述方法的又一種實施方案中，所述探針含有SEQIDNO:1的至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核普酸，所述探針包含SEQIDNO:1第275和276位核苷酸之間的核苷酸連接點，或SEQIDNO:2的至少50、100、150、200、300、400或500個連續(xù)核苷酸，所述探針包含SEQIDNO:2的第133和134位核苷酸之間的核苷酸連接點。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述探針可含有本說明書內所述的相關多核苷酸的片段。尤其是，所述探針可含有能夠與表現(xiàn)本申請所述事件特征的序列雜交的多核苷酸序列。在所述方法又一種實施方案中，所述洗滌發(fā)生在高嚴緊條件下。可以采用本領域技術人員熟知的方法產(chǎn)生和標記所述探針。該探針可以是，例如，PCR產(chǎn)物或限制性消化片段。在又一種實施方案中，本文所述的探針可以用熒光、放射性、酶或其它適宜的標記物進行標記以使得雜交可被檢測。在本發(fā)明的又一種實施方案中，提供了一種在嚴緊條件下將探針與樣品中互補核酸雜交并檢測該探針是否已雜交的方法。高嚴緊雜交條件是本領域技術人員熟知的，包括，例如在約65'C下在包含6xSSC、0.01。/。SDS和0.25%脫脂奶粉的溶液中進行雜交，之后在相同的溫度下在含有0.2xSSC和0.1%SDS的溶液中洗滌。技術人員也可以選擇以下雜交條件，即，于6065。C之間，在含有0.1%SDS的0.3倍強度檸檬酸鹽緩沖鹽水中進行雜交，之后在相同的溫度下用含有0.1%SDS的0.3倍強度檸檬酸鹽緩沖鹽水洗滌。本領域技術人員還可以選擇可同等理解為"高嚴緊"條件的其它雜交條件?；陔s交原則的用于檢測來自本文所述事件的植物材料的適宜方法包括但不限于Southern印跡、Northern印跡和原位雜交。技術人員熟悉這些技術。通常，它們包括將探針與樣品孵育，洗滌除去未結合探針，以及檢測探針是否已雜交。所述檢測方法依賴于附著在探針上的標簽類型一一例如，放射性標記的探針可通過暴露在X射線膜上并顯影來檢測。作為選擇，酶標探針可通過底物轉化從而產(chǎn)生顏色變化來檢測。又一方面，提供了一種鑒定含有CE43-67B事件的植物的方法，所述方法包括(a)制備含待測植物基因組DM的樣品；(b)經(jīng)限制酶消化所述DNA;(c)分離消化的DNA片段并將由此分離的片段轉移到膜上；(d)用如上述所設計的探針探測由此結合的片段，所述探針已被標記以使其可視化；(e)除去實質上未雜交的探針；和(f)檢測由此雜交的探針，其中所述事件可以通過與具有特定大小的片段雜交的所述探針來表征。在有一方面，提供了一種能夠通過根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的棉花事件。在一種特定實施方案中，所述方法是根據(jù)前述段落的方法。本公開文本還包括一種檢測包含能夠被SEQIDNO:7所示多核苷酸編碼的蛋白質的植物的方法，所述方法包括(a)制備待測植物的蛋白質提取物；(b)提供能夠與來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAb蛋白結合的抗體；(c)在允許所述抗體與所述提取物中的所述蛋白質結合的條件下將所述抗體加入到所述提取物中；和(d)檢測由此結合的抗體從而鑒定該提取物是否含有所述蛋白。本公開文本還包括一種檢測含有來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAb基因的植物的方法，所述方法包括(a)制備待測植物的蛋白質提取物；(b)提供能夠與來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAb蛋白結合的抗體；件下將所述抗體加入到所述提取物中或將所述提取物加入到所述抗體中；和(d)檢測由此結合的抗體從而鑒定該提取物是否含有所述CrylAb蛋白。該方法可用于區(qū)分表達CrylAb的植物，比如含有CE43-67B的植物，和不表達CrylAb的植物。以抗體結合為基礎的檢測衍生自本文所述事件的植物材料的適宜方法包括但不限于Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)和SELDI質譜分析法。技術人員熟悉這些方法和其它的免疫學技術。通常的步驟包括將樣品與結合所述蛋白的抗體孵育，洗滌除去未結合抗體，并檢測抗體是否已結合。許多這樣的檢測方法是以酶反應——比如抗體可以用比如辣才艮過氧化物酶這樣的酶作標記——以及應用適宜的底物、檢測顏色改變?yōu)榛A的。適宜的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本公開文本還包括一種檢測衍生自本文所述事件的植物材料的方法，所述方法包括獲得用于分析的樣品；制備樣品的蛋白質提取物；提供設計用于檢測樣品中存在的所述蛋白之存在的測試條或dipstick;將測試條或dipstick與樣品孵育；并檢測所述蛋白是否存在。本方法可以是用于本文所述事件的基于抗體的檢測方法，并使用測試條或或dipsticks。通常的步驟包括將測試條或dipstick與樣品進行孵育，并觀察測試條或dipstick上有色條帶的有無。有色條帶指示樣品中蛋白的存在。這樣的測試條或dipstick測試通常是蛋白特異性的，且可用于該領域的快速樣品測試。在一種實施方案中，免疫學方法或dipstick利用SEQIDNO:7所編碼的來自蘇云金芽孢桿菌的CrylAb基因特異的一種或多種抗體或其一種或多種片段?？贵w片段包括但不限于，F(xiàn)ab、經(jīng)修飾的Fab、diFab、Fab，、F(ab，)2或FV片段，免疫球蛋白輕鏈或重鏈單體、單鏈FV(scFV)或納米抗體(nanobody)?？贵w或其片段可以是單克隆或多克隆的。在一種特定實施方案中，抗體是由選自DSMACC2723和DSMACC2724(二者均于2005年5月12日保藏于德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，MascheroderWeglb，38124Braunschweig,德國)的細胞系分泌的抗體，或能夠抑制由選自DSMACC2723和DSMACC2724的細胞系分泌的抗體與CrylAb結合的抗體。可以注意到，生產(chǎn)單克隆和多克隆抗體及其片段的方法是本領域熟知的。適宜的測試條或dipsticks以及它們的使用材料描述于PCT申請W002/27322中，例如，是一種由塑料底支持的含有醋酸纖維素、纖維素、硝化纖維素或尼龍的檢測膜的側流免疫條。這樣的免疫條可以用其中液體樣品通過毛細作用被抽吸的薄膜或濾膜來制造。當樣品中的蛋白沿條帶縱向移動時，它與免疫條中所含的抗體反應并被捕獲在一條將可視的線上。適宜的檢測方法是，例如，膠體金和有色乳膠珠。在一種特定施方案中，在由塑料底支持的硝化纖維素適當制成的測試條上噴灑一條如上述的特異抗-CrylAb抗體線。在該第一抗體線的上方平行噴灑一條抗-小鼠抗體的試劑對照線。該膜的頂部一側為一塊吸收塊，底部一側為一塊含有干燥膠體金標記的抗-CrylAb抗體。在一種優(yōu)選實施方案，膠體金標記的抗-CrylAb抗體不同于噴灑在測試線的第一抗體。在一種特定實施方案，該膠體金標記的抗-CrylAb抗體是由細胞系DSMACC2723分泌的抗體，噴灑在測試線的抗體是由細胞系DSMACC2724分泌的抗體。樣品施加塊在膠體金塊側邊。使用時，將樣品施加塊放在所提取組織的樣品中，或者將該樣品以另一種方式應用到該塊上，例如，通過滴管。樣品中所含的任何CrylAb蛋白在測試條上流動，并被膠體金標記的抗-CrylAb抗體結合。當其繼續(xù)在測試條上移動，蛋白還會被測試線處的抗-CrylAb抗體結合。多余的金綴合物在試劑對照線被捕獲。在陽性測試中，也即，如果CrylAb存在于樣品中，會出現(xiàn)雙紅線下部的線指示CrylAb的存在，而上部的線是指示裝置正確工作的對照線。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種試劑盒，該試劑盒含有以下部分上述引物對，和實施上述方法的說明，和實施擴增反應的工具，以及可選的用于制備待測樣品的工具。在又一種實施方案中，提供了一種含有包括以下部分的試劑盒上述抗體，實施上述方法的說明，實施上述方法的工具，和可選的制備待測樣品的工具。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述試劑盒可包含DNA擴增一檢測技術，比如PCR或TaqManTM。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述試劑盒可包含探針雜交一檢領，J才支術，t匕如Southern-卩跡、Northern印跡或/f4立雜交。在本發(fā)明的另一種實施方案中，所述試劑盒可包含抗體結合-檢測技術，比如Western印跡、ELISA，s、SELDI質^普法、測試條或dipsticks。在本發(fā)明的又一種實施方案中，所述試劑盒可包含前述檢測技術的任意組合。在又一種實施方案中，所述試劑盒可包含說明書形式的一或多種上述方法。又一方面提供了一種用于育種方法的根據(jù)本發(fā)明的植物或種子。例如，這些植物可用于將提供昆蟲抗性的性狀轉移到同屬但具有不同背景種質的植物中去。這樣的向不同種質的育種可能是所期望的，如果該植物要在需要可替代種質的條件下種植。可用于將性狀轉移到不同背景種質中去的育種方法是本領域熟知的。在本發(fā)明的又一方面提供了用根據(jù)本發(fā)明的植物或種子來產(chǎn)生外植體材料的用途，所述外植體材料用于用其它遺傳性狀轉化所述外植體的方法中。一旦提供了能夠用本發(fā)明的方法鑒定的事件，則產(chǎn)生這樣的外植體材料并將其用于轉化程序是本領域技術人員能力范圍內的。此外，一旦提供了能夠用本發(fā)明的方法鑒定的事件，則將所述事件用于本文所述的育種方法是本領域技術人員能力范圍內的。根據(jù)本發(fā)明，提供了將一或多種上述的本發(fā)核苷酸用于檢測CE43-67B事件的用途。在一種實施方案中，所述多核苷酸可用于如上所述的檢測CE43-67B事件的方法中。實施例通過以下非限制性實施例和相關序列表，本發(fā)明將更為清楚SEQIDNOl:CE43-67B事件基因物組序列-插入物SEQIDNO2)CE43-67B事件插入物-基因組序列SEQIDNO3:CE43-67B事件基因組序列-插入物連接點SEQIDNO4:CE43-67B事件插入物-基因組序列連接點SEQIDNO5-6:CE43-67B事件引物SEQIDNO7)CE43-67B事件:CrylAb基因序列SEQIDNO8-19:CE43-67B事件引物實施例l:克隆和轉化1.1載體克隆釆用對來自內部載體的片段進行限制性消化和連接的標準基因克隆技術構建了轉化栽體pN0V1914和pN0V4641。載體pN0V1914包括一個含有Ubiquitin(UBQ3)啟動子、UBQ3內含子、編碼賦予潮霉素抗性的蛋白質的基因序列以及nos多腺苷酸化序列的可選擇標記盒。載體pN0V4641包括革巴基因的表達盒，該表達盒含有肌動蛋白(ACT2)啟動子、ACT2內含子、已針對在玉米中表達進行了密碼子優(yōu)化的編碼CrylAb基因的序列、以及nos多腺苷酸化序列。采用標準農桿菌轉化技術將這些栽體轉化進根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌林GV3101,并通過抗生素抗性選擇出轉化細胞。1.2植物轉化通過農桿菌介導的對陸地棉Coker312載培種(GossypiumhirsutumL.cvCoker312)的轉化產(chǎn)生了CE43-67B事件。將Coker312種子播種于溫室中。從3至5周齡植林上切取幼嫩葉柄，并浸沒在70%乙醇中滅菌。之后將葉柄浸沒在5°/。Clorox+2ml/lTween20溶液中20分鐘。將葉柄在(1犯20中洗滌三次。切除葉柄端部，并將葉柄轉移至葉柄預培養(yǎng)基(4.3g/lMS鹽、B5維生素(lQQmg/l肌醇、lmg/l煙酸、lmg/l鹽酸吡多醇、10mg/l鹽酸硫胺素)、30g/l葡萄糖、2.4g/1phytogel,pH7.0)中，并在光照下于30。C預培養(yǎng)3天。2ml含有pNOV1914和pN0V4641構建體的農桿菌培養(yǎng)物在適當?shù)目股刂猩L過夜，之后用液體MMS1培養(yǎng)基(4.3g/lMS鹽、B5維生素(100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、lmg/l鹽酸吡多醇、10mg/l鹽酸硫胺素)、0.05rag/l2,4-D、0.lmg/l激動劑、30g/l葡萄糖、pH6.5)稀釋至OD"q介于0.1~0.2。切除葉柄端部，將葉柄置于無菌培養(yǎng)皿中的10~20ml的細菌溶液中。一旦進入該溶液，即將葉柄縱向切割然后切成2cm切片。葉柄外植體在細菌溶液中浸泡5~10分鐘后，將它們轉移到鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)平板(配方與液體MMS1相同，再加入2.4g/1Phytagel)上，使其在低光強度、24。C下共培養(yǎng)4872小時。將共培養(yǎng)的外植體轉移到含有500mg/l頭孢噢將和10mg/l潮霉素的MMS1培養(yǎng)基(配方與固S1液體培養(yǎng)基相同，再加入2.4g/lPhytagel)，并在16小時光照和8小時黑暗的光循環(huán)下、30。C培養(yǎng)。兩周后、以及此后每4~6周將外植體轉移到新鮮培養(yǎng)基上，直至愈傷組織形成。一旦愈傷組織長至豌豆大小，即將它們從外植體上取下并轉移到含有500mg/l頭孢塞將和10mg/l潮霉素的新鮮MMS1培養(yǎng)基上，并通過適當?shù)孛?周繼代培養(yǎng)來維持。將1.5g愈傷組織徹底打碎，并置于含有10ml液體MMS2培養(yǎng)基(4.3g/lMS鹽、B5維生素(lOOfflg/1肌醇、lmg/l煙酸、lmg/1鹽酸吡多醇、10mg/l鹽酸硫胺素)、L9g/1KN03、30g/l葡萄糖，pH6.5)的50ml三角瓶中。30°C、光照下以100rpm的轉速將懸浮愈傷組織振蕩兩周。用醒S2液體培養(yǎng)基洗滌這些懸浮培養(yǎng)細胞3次，重懸浮，并接種至固體畫S2培養(yǎng)基(配方與液體MMS2培養(yǎng)基相同，另加入2.4g/Lphytogel)上。一旦接種后，除去過量的液體畫S2培養(yǎng)基，并在3(TC、光照下培養(yǎng)平板。每周檢查平板上的體細胞胚發(fā)育。體細胞胚在1~2個月內形成。此液體懸浮步驟可重復多次直至胚胎發(fā)生性愈傷組織或體細胞胚形成。將體細胞胚轉移到EG(胚狀體萌發(fā))培養(yǎng)基(2.65g/lMS鹽改良No.4(Duchefa)、1.9g/lKN03，B5維生素(同前)、30g/l葡萄糖、lg/1谷氨酰胺和0.5g/l天冬酰胺，pH6.5)，并每34周繼代培養(yǎng)到新鮮EG培養(yǎng)基上。一旦體細胞胚變綠且大于2cm，即將它們根朝下植于EG培養(yǎng)基中。在所有再生階段，均要預防生長中的小植林觸及容器蓋子或側面以預防葉片脫落。將帶有1~2片真葉的萌發(fā)胚轉移到175mlGreiner容器中的EG培養(yǎng)基上。將帶有真葉的強壯小植林轉移到175mlGreiner容器中吸飽了犯20的無菌泥炭塞中，并轉移到3英寸花盆的泥炭中。在30。C下14小時日照和20'C下10小時黑暗的條件下，在高濕度的種植室的植物種植器中馴化植物。一旦看到盆的排水孔中有根長出，即將它們轉移到更大的含50%JohnInnesNo.3和50%添加有Osmocote的泥炭的盆中并置于溫室中。1.3轉基因體的鑒定和選擇對推定的轉基因植林用PCR法篩選CrylAb基因的存在。用昆蟲生物檢測法鑒定和篩選陽性事件的殺昆蟲活性。通過Southern印跡分析完成了對殺昆蟲系的分子表征。在田間試驗中觀察獲自若干事件的Tl種子的昆蟲抗性及農藝品質。根據(jù)分子表征、經(jīng)ELISA鑒定的蛋白表達7jc平、對煙蜂夜蛾(Heliothisvirescens)和棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)的殺昆蟲抗性以及田間表現(xiàn)選擇了CE43-67B事件。用常規(guī)植物育種方法分離出潮霉素選擇標記盒從而得到CE43-67B事件。1.4CE43-67B序列的驗證從CE43-67B事件分離基因組DNA。將其用于通過標準DNA測序技術對CE43-67B事件中DNA插入位點與棉花基因組DNA的連接點(SEQIDN0:1和2)進行觀'J序。實施例2:通過PCR特異性檢測CE43-67B事件2.1DNA提取根據(jù)生產(chǎn)商的說明利用WizardMagnetic96DMPlantSystem(Promega，#FF3760)從葉片組織提取DNA，但在程序開始時再加一步葉片材料研磨后，向各孔中加入0.9ml棉花抽提緩沖液(0.2MTrispH8.0,50mMEDTA，0.25MNaCl,0.1%v/v2-巰基乙醇，2.5%w/v聚乙烯吡咯烷酮)，將植物組織重懸浮，并將平板在4，000rpm(2755g)下離心10分鐘。吸出并棄掉上清后，加入300ul裂解緩沖液A(Promega),從此點開始按照生產(chǎn)商的程序進行。經(jīng)該程序得到了大約85ul濃度約為10ng/ul的純化基因組DNA。2.2事件特異性PCR反應用含有以下物質的標準反應混合物設置25ulPCR反應lxJ卿startREDTaqPCR(Sigma,#P-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:9)0.5uM引物2(SEQIDNO:10)lOng基因組DMddH20將PCR反應在熱循環(huán)儀中于94。C加熱3分鐘，之后進行35個如下循環(huán)94°C30秒，60°C30秒，72°C50秒。72。C加熱5分鐘結束反應。將PCR反應在瓊脂糖上跑膠，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA條帶可視化。得到一條大小約760bp的條帶。或者，用含有以下物質的標準反應混合物設置25ulPCR反應lxJ,startREDTaqPCR(Sigma,#P-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:11)0.5uM引物2(SEQIDNO:12)lOng基因組DNAd歸將PCR反應在熱循環(huán)儀中于94'C加熱5分鐘，之后進行35個如下循環(huán)94。C30秒，60°C30秒，72匸30秒。72。C加熱5分鐘結束反應。將PCR反應在瓊脂糖上跑膠，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA條帶可視化。得到一條大小約267bp的條帶。實施例3:通過多重PCR合子型測試檢測CE43-67B3.1基因組DNA提取如實施例2.1所述從CE43-67B提取基因組DNA。3.2多重PCRI設計了用于多重PCR合子型測試的PCR引物。按照下述為各待測樣品設置了20ulPCR反應lxJumpStartReadyMix羅TaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:5)0.5uM引物2(SEQIDNO:6)0.5uM引物3(SEQIDNO:8)10ng基因組DNAddH20將PCR反應在熱循環(huán)儀中于94。C加熱3分鐘，之后進行35個如下循環(huán)94°C15秒，55°C15秒，72°C45秒。72。C加熱5分鐘結束反應0將PCR反應在瓊脂糖上跑膠，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA條帶可視化。兩條帶(561bp和約1000bp)的存在表明，該樣品來自CE43-67B雜合植物；一條561bp大小的帶表明，該樣品來自CEW-WB純合植物；而一條約1000bp大小的帶表明該樣品來自純合野生型棉花植物。3.3多重PCRII設計了用于多重PCR合子型測試的PCR引物。按照下迷為各待測樣品設置了20ulPCR反應lxJ卿StartReadyMixREDTaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:11)0.5uM引物2(SEQIDNO:12)0.5uM引物3(SEQIDNO:13)10ng基因組DNAddH20將PCR反應在熱循環(huán)儀中于94。C加熱3分鐘，之后進行"個如下循環(huán)94°C30秒，60。C30秒，72°C45秒。72。C加熱5分鐘結束反應。將PCR反應在瓊脂糖上跑膠，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA條帶可視化。兩條帶(267bp和約1000bp)的存在表明，該樣品來自CE43-67B雜合植物；一條267bp大小的帶表明，該樣品來自CE43-67B純合植物；而一條約1000bp大小的帶表明該樣品來自純合野生型棉花植物。實施例4:通過Southern印跡檢測CE43-67B4.1用于Southern印跡的DNA抽提用冷研缽和研扦將約2~3g鮮重的冷凍幼嫩葉片組織研成細粉，并加入貼標簽試管中的15ml水冷的核酸抽提緩沖液(0.35M葡萄糖、0.1MTris-HClpH8,50mMNa2EDTA，2%聚乙烯吡咯烷酮-IO，0."/。抗壞血酸，0.2。/。B-巰基乙醇)中。在冰上孵育樣品15-20分鐘。輕輕混和試管，并于4"C在2700g下離心20分鐘。棄上清，加入8ml核酸裂解緩沖液(O.14M山梨醇，0.22MTris-ClpH8，0.8MNaCl，0.22MNa2EDTA，0.8%w/vCTAB，1。/。Sarkosyl，1%聚乙烯吡咯烷酮-10，0.1%抗壞血酸，0.2%B-巰基乙醇，5jig/ml蛋白酶K)。混和后，于65°C孵育試管3G分鐘。加入10ml氯仿，輕輕倒置混和試管直至形成乳狀物，之后于室溫在4600rpni下離心10分鐘。將水性層轉移至一支含有10(ilRNaseA(1QmgsigmaR4642)的新試管中，37'C下孵育該試管30分鐘。重復一次氯仿和離心步驟。將水性層轉移至一支含有10ml異丙醇的新試管中。室溫下孵育約15分鐘后，在試管中央觀察到凝膠狀沉淀物。輕輕混和試管，以沉淀出DNA。用無菌環(huán)將DM繞出并置于含有70%乙醇的Falcon試管中。將DNA空氣干燥以除去乙醇，并將其重懸于200-400plTE中。4.2DNA抽提的替代方法室溫下用研磨和研扦以及2ml研磨緩沖液(100mMNaOAcpH4.8，50mMEDTApH8.0，500mMNaCl，2%PVP(10，000MW)、1.4%SDS)和一些沙子將2-3片幼嫩棉花葉片(約lg鮮重)研磨成糊。將研磨組織轉移到15mlfalcon管中，并用lml研磨緩沖液將研缽中剩余的研磨組織沖洗到試管中。于65。C孵育樣品15分鐘，偶爾振蕩。加入4mlIOM醋酸銨，將樣品充分混和，于65。C孵育IO分鐘以沉淀蛋白質。室溫下4600rpm離心樣品10分鐘。將水相轉移到一支新的15ml試管中。加入0.6體積的冷異丙醇，室溫下孵育樣品約30分鐘。緩慢混合后倒置試管數(shù)次，將DNA繞出并溶解于500ulTE中。加入10ul10mg/mlRNAse，室溫下孵育15分鐘。用500ul苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)提取后，輕輕混和樣品，并以13000rpm離心5分鐘。用細的巴斯德吸液管將上清液轉移到新試管中，并如上述用氯仿異戊醇(24:i)重提。將上清液轉移到新試管中，加入i/io體積3MNaOAc(pH4.8)并混和，然后加入一倍體積的冷異丙醇?？蓪悠吩谑覝叵路跤_30分鐘以沉淀DNA。將DNA繞出并重懸于70%乙醇中?？諝飧稍顳NA以出去乙醇，并重懸于200ul水中。4.3限制酶消化用分光光度計和跑膠對DNA進行定量。以每次消化總體積40ul中5ugDM準備適當?shù)拿赶?。包括Ncol、Mscl、HindlII/Kpnl和Nhel/AscI的消化物用于檢測拷貝數(shù)和插入完整性。各酶消化物在適當溫度下孵育6小時。4.4凝膠電泳向上述4.3的各樣品中加入溴酚藍上樣染料，并將各樣品加樣到0.8%TBE瓊脂糖凝膠中。凝膠在50伏特下跑膠過夜。跑膠后，在O.25MHC1中洗滌凝膠10分鐘以使DM脫嘌呤，在變性溶液(0.5MNaOH,1.5MNaCl)中輕輕攪拌孵育30分鐘，用蒸餾水漂洗，之后在中和溶液(0.5MTris，1.5MNaCl)中孵育30分鐘。按照下述準備Southern印跡把一塊玻璃板架在一個盛有2(^SSC的托盤上，將3M紙條放在玻璃板上使紙的兩端浸入到20XSSC溶液(起燈芯的作用)中。在燈芯上放一片與凝膠相同大小的SM紙，并把凝膠置于其上。在凝膠邊緣放置nescofilm條以形成封邊。在凝膠頂面放置Hybond膜，依次再放置兩張3M紙。在組裝印跡過程中，要小心以確保在膜、凝膠和3M紙之間沒有進入氣泡。在3M紙上方堆疊Scm-10cm高的吸水紙，并加砝碼固定好。過夜使DM轉移到Hybond膜上。轉移之后，拆掉Southern印跡堆，并通過紫外交聯(lián)使DNA結合到膜上。4.5雜交通過對二元質粒pNOV4641進行HindlII/Kpnl限制性消化并純化所得片段制得適宜的DNA探針。25ng探針DNA在45ulTE中沸煮5分鐘，置于水上5分鐘，之后轉移入RediprimeII(AmershamPharmaciaBiotech,并RPN1633)試管。向Rediprime試管中加入5ul32P-標記的dCTP，37。C下孵育1小時。根據(jù)生產(chǎn)商的說明經(jīng)microspinG-50柱(AmershamPharmaciaBiotech,#27-5330-01)離心純化探針以除去未摻入的dNTPs。通過比較柱中保留的與樣品管中的放射性成分的量來粗略評估探針活性，比率至少為50:50是可接受的。Hybond膜用40ml預熱的Rapid-Hyb緩沖液(Amersham-Pha函cia)打濕，在65'C在預雜交30分鐘。將標記探針沸煮5分鐘，并置于冰上5分鐘。向預雜交緩沖液中加入適量探針(每ml預雜交緩沖液一百萬計數(shù))，65。C下雜交過夜。接下來的一天，棄雜交緩沖液，之后用50ml2xSSC/l%SDS溶液漂洗一次，在150ml2xSSC/l%SDS溶液中65。C下洗滌膜30-45分鐘。用0.lxSSC/l%SDS溶液重復該過程兩次。將膜暴露在熒光屏或X-射線膠片上以檢測探針結合的位置。實施例5:通過ELISA檢測CE43-67B5.1蛋白質提取收集用于分析的棉花組織，并于-70'C冷凍。將冷凍組織研成細粉，并稱重放入貼有標簽的聚丙烯試管中。對于冷凍組織以2:1(體積提取緩沖液樣品鮮重)的比率，或對于凍干組織以30:l(體積提取緩沖液樣品干重)的比率向樣品中加入提取緩沖液(100mMTris，100mM硼酸鈉，5mMMgCl,0.05%Tween20，0.2%抗壞血酸鈉，水，pH7.8,lmMAEBSF，0.OOlmMLeupeptin)。用裝有PTA10TS消泡發(fā)生器的BrinkmanPT10/35Polytron渦旋和均質化，直至混合物液化。將提取物在10，000xg下離心15分鐘。將蛋白質提取物上清在2-8'C儲存。5.2ELISA程序ELISA程序釆用以下標準技術。將96-孔板浸入乙醇中2小時，風干。用每孔50ul山羊抗-CrylAb抗體包被平板，并于2-8'C孵育過夜。用IXELISA洗滌液(lOOmMTris,0.5%Tween-20，75mMNaCl，pH8.5)洗滌三次后，將板扣于紙巾上稍拍打干燥。向各孔中加入150ul封閉液(10mMNaP04，140mMNaCl，1%BSA，0.02%疊氮化鈉,用NaH2P04和化2肝04滴定至pH7.4)，之后于室溫孵育45分鐘。如上述將板洗滌三次。將CrylAb標準物和蛋白質提取樣品加入到平板上適當?shù)目字?，三個重復，每孔總體積為50ul。2-8。C下將板孵育一個半小時，之后于室溫下在孵育30分鐘。用ELISA洗滌液洗滌板三次，之后于35-39。C與每孔50ul兔抗-CrylAb抗體孵育1小時。用ELISA洗滌液洗滌板三次，并在室溫下與每孔50ul綴合堿性磷酸酶的驢抗-兔抗體孵育30分鐘。之后用ELISA洗滌液洗滌板三次，向各孔中加入50ul磷酸酶底物，將板在室溫下孵育30分鐘。通過向各孔中加入50ul3MNaOH使反應停止。用Ceres900C多孔板讀數(shù)器測定405nm處各孔中的溶液吸收值，用KC3曲線擬合軟件(Bio-TekInstrumentsInc.)分析所得結果。參照CrylAb蛋白質標準品計算樣品中的CrylAb濃度。實施例6:通過DipStick檢測CE43-67B6.l蛋白質提取將一片約0.2cm2的葉片組織置于含提取緩沖液的試管中。通過切碎和浸軟組織，用塑料攪拌子從組織中提取蛋白質。6.2Dipstick測試將測試條放到試管中孵育5~IO分鐘以顯示結果。測試條在結合了抗-CrylAb抗體處有第一條帶，且在對照抗體結合處有第二條帶。孵育后，測試條結果窗中雙紅線表示CrylAb存在。較低的線表示CrylAb蛋白存在，而較高的線是表示該測試運行正確的對照。實施例7:經(jīng)終點TaqMan合子型測試檢測CE43-67B7.1基因組DNA提取如實施例2.1所述從CE43-67B中提取基因組DNA。7.2終點TaqManPCRi殳計了用于終點TaqManPCR合子型測試的PCR引物。按照以下設置了各待測樣品的20ulPCR反應lxJ卿StartReadyMix謹TaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物混合物1(等摩爾濃度的SEQIDNO:14、15和16)0.5uM引物混合物2(等摩爾濃度的SEQIDNO:17、18和19)10ng基因組DMddH20將PCR反應物在熱循環(huán)儀中于95。C加熱5分鐘，之后進行40個如下的循環(huán)95°C15秒，60°C1分鐘。7.3分析在ABI7900HT上讀取焚光值，并采用所提供的SDS軟件中的AllelicDiscrimination程序進行終點分析。檢測到FAM熒光表明，該樣品來自CE43-67B純合植抹。檢測到TET熒光表明，該樣品來自純合野生型棉花植林。檢測到FAM和TET熒光表明，該樣品來自CE43-67B雜合植林。實施例8:CE43-67B的殺昆蟲效力8.1田間試驗I——設計在美國的六個地點進行了田間試驗以測試CE43-67B的昆蟲抗性。在各地點，按隨機化完全區(qū)組設計設置重復試驗，每個試驗包括4個重復。每個試驗由包括4x40英尺的多個行、每英尺種植3林植物的地構成。在各個地點，在植物盛蕾期，一個試驗由人工侵襲煙蜂夜蛾幼蟲，另一試驗由個人工4曼襲谷實夜蛾(Heicoverpazea)幼蟲。之后評估各試驗棉鈴和棉蕾的損害百分數(shù)。人工侵襲通過將含蟲卵的黃原膠溶液噴灑到植林上從而使幼蟲直接孵化在植林上來完成。侵襲設計為約每抹植物3個蟲卵。8.2田間試驗I——結果下表中所示數(shù)據(jù)是試驗期所有評估的平均值已將多個棉蕾損害率和棉鈴損害率共同平均得到一個結實體(fruitingbody)損害率均值，并且全部六個地點的數(shù)據(jù)也一起進行了平均。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>這些數(shù)據(jù)清楚地顯示，與名稱為Coker312的非轉基因對照相比，CE43-67B對煙椅夜蛾和谷實夜蛾均具有極好的抗性。8.3田間試驗II——i殳計用在人工侵襲前24~36小時獲自Stoneville，MS的南方昆蟲管理實驗室(SouthernInsectManagementLaboratory)的煙對夜蛾蟲卵人工侵襲CE43-67B植林。將蟲卵與黃原膠溶液混合，并利用常規(guī)的C02背負噴灑器噴灑到棉花植林的末端區(qū)域。蟲卵經(jīng)一個扁平扇形8006噴嘴以約10psi進行噴灑。該試驗在Leland,MS的Syngenta，sSouthernRegionalTechnicalCentre和VeroBeach,FL的VeroBeachResearchCentre兩個地點進行。在兩個地點，利用了約2240個CE43—67B植林的非重復固定區(qū)組(unreplicated，solidblocks),以及約224個非轉基因Coker312植林的較小區(qū)組進行侵襲。如果認為天敵群體高到足以干擾侵襲，則在計劃的侵襲前24~48小時用acephate(Orthene)以0.5lbai/A噴灑研究區(qū)域。用非轉基因Coker312棉花區(qū)估計侵襲技術的有效性，以及確定這些研究中所使用的煙辨夜蛾林的田間適應性。在各地點，對CE43-67B和Coker312棉花進行四次人工侵襲，每次侵襲四分之一的可用植株。侵襲在中蕾和早花期之間進行。通過收集數(shù)片來自Coker312植抹的帶卵葉片并將其置于培養(yǎng)皿中來評估蟲卯孵化率。計數(shù)所收集葉片上的蟲卵，并在2~3天后評估成功的幼蟲羽化。侵襲后7天進行評估。在Leland，MS地點，評估了所有侵襲植抹中的一半，而在VeroBeach,FL地點，評估了所有侵襲植株中的四分之三。在每種情況下，評估包括對整林徹底尋找存活幼蟲。還從Leland的試驗中得到了棉蕾損害率。對于在CE43-67B植林上發(fā)現(xiàn)了存活幼蟲的地方，對含有幼蟲的果實結構做了標記。4至7天后，再次徹底評估這些果實結構以及所有相鄰結構以評估這些幼蟲是否仍然存活。由于至該階段，Coker312植林上的許多幼蟲已經(jīng)開始在土壤中尋找化蛹位置，因此后來在Coker地塊中并沒有進行類似的評估。8.4田間試驗II——結果下表是所收集數(shù)據(jù)的總結。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*基于所施用的蟲卵數(shù)量和所觀察到的孵化率進行的評估。ND=未檢觀寸侵襲7天后在兩個地點在CE43-67B植林上存活的幼蟲均非常小，在一齡至三齡之間。侵襲后7天包含活幼蟲的果實結構作了標記，并在4~7天后再次進行了評估。在笫二次評估時，在所標記的、或是周圍的果實結構中都沒有回收到活幼蟲。此外，所有標記的果實結構均保留在植抹上并正常發(fā)育。這強烈提示，侵襲7天后在CE43-67B植抹上仍然存活的極少數(shù)幼蟲在第二次評估時不再存活。在CE43-67B植抹上觀察到的棉蕾損害水平與非轉基因Coker312對照相比是極低的，這證實，煙圻夜蛾幼蟲是很有生命力的，并且能夠建立強侵襲。該人工侵襲試驗的數(shù)據(jù)顯示，與名稱為Coker312的非轉基因對照相比，CE43-67B對煙奸夜蛾具有極好的抗性。權利要求1.包含含有SEQIDNO1所示序列的第一區(qū)和含有SEQIDNO2所示序列的另一區(qū)的多核苷酸。2.包含以下序列的多核苷酸a)SEQIDNO:3所示序列中的至少18個連續(xù)核普酸；b)SEQIDNO:1核苷酸246~305所示序列中的至少35個連續(xù)核苷酸；或c)SEQIDNO:l所示序列中的至少50個連續(xù)核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l的第275和276位核苷酸。3.包含以下序列的多核苷酸a)SEQIDNO:4所示序列中的至少18個連續(xù)核普酸；b)SEQIDNO:2核苷酸103~164所示序列中的至少35個連續(xù)核普酸j或c)SEQIDNO:2所示序列中的至少50個連續(xù)核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:2的第133和134位核普酸。4.含根據(jù)權利要求13任一項的多核苷酸的棉花植物。5.含根據(jù)權利要求l~3任一項的多核苷酸的根據(jù)權利要求4的棉花植物的種子。6.—種檢測包含SEQIDNO:l所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制備包含待測植物基因組DNA的樣品；b)獲得適用于擴增反應以擴增含有SEQIDNO:3所示序列中的至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列的引物對；c)將所述引物對加入所述樣品和用于實施擴增反應的工具中；d)實施擴增反應；和e)將由此擴增的序列可視化。7.—種檢測包含SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制備包含待測植物基因組DM的樣品；b)獲得適用于擴增反應以擴增含有SEQIDNO:4所示序列中的至少18個連續(xù)核苷酸的序列及其互補序列的引物對；c)將所述引物對加入所述樣品和用于實施擴增反應的工具中；d)實施擴增反應；和e)將由此擴增的序列可視化。8.根據(jù)權利要求6或權利要求7的方法，其中所述序列包含至少20個連續(xù)核苷酸。9.一種檢測包含SEQIDNO:l所示多核苷酸和/或SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制備包含待測植物基因組DNA的樣品；b)獲得能夠與選自下組的序列雜交的探針，所述組由含有SEQIDNO:3所示序列中的至少18個連續(xù)核苷酸的序列和含有SEQIDNO:4所示序列中的至少18個連續(xù)核苷酸的序列組成；c)在允許所述探針與所述樣品中的互補核酸雜交的條件下向所述樣品中加入至少一種步驟(b)的探針；d)除去實質上未雜交的探針；和e)檢測由此雜交的探針從而鑒定該樣品中是否包含所述多核苷酸。10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述序列含有至少20個連續(xù)核苷酸。11.根據(jù)權利要求9或權利要求10的方法，其中通過在高嚴緊條件下漂洗所述探針來除去所述實質上未雜交的探針。12.試劑盒，其包含權利要求6或權利要求7中所定義的引物對，實施權利要求6或權利要求7的方法的說明，用于實施擴增反應的工具，以及可選的用于制備待測樣品的工具。13.由細胞系DSMACC2723或DSMACC2724分泌的抗CrylAb抗體。14.一種dipstick，其含有a)特異性抗CrylAb抗體的測試線；b)抗小鼠抗體的試劑對照線；c)包含干燥的膠體金標記的抗CrylAb抗體的區(qū)塊；和d)沖羊品施加區(qū)塊，其中抗-CrylAb抗體和干燥的膠體金標記的抗CrylAb抗體獨立地選自由細胞系DSMACC2723分泌的抗體和由細胞系DSMACC2724分泌的抗體。全文摘要本申請涉及抗昆蟲轉基因棉花植物。尤其涉及一個稱作CE43-67B的特定事件。本申請還涉及CE43-67B事件特征性的多核苷酸、含有所述多核苷酸的植物以及檢測CE43-67B事件的方法。文檔編號C12N15/82GK101184847SQ200680018728公開日2008年5月21日申請日期2006年5月15日優(yōu)先權日2005年6月2日發(fā)明者D·V·奈格羅托,J·巴內特,P·J·凱雷申請人:先正達參股股份有限公司