專利名稱：：分析靶核酸序列的方法與試劑盒的制作方法分析靶核酸序列的方法與試劑盒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及分析靶核酸序列的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及用寡核苷酸測定是否存在靶核酸序列的分析方法，所述寡核苷酸與核酸處理反應(yīng)配合從而產(chǎn)生可檢測信號。在一些實施方式中，這些方法有助于定量測定靶核酸序列。本發(fā)明還涉及可用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。發(fā)明背景可用能檢測與其它短核酸分子雜交的系統(tǒng)分析核酸分子，所述短核酸分子通常是指探針、引物或寡核苷酸。因為可通過核酸分子的序列和一些子序列來區(qū)分核酸分子，也因為核酸分子能與諸如寡核苷酸等互補的序列特異性結(jié)合，這是可能的。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是最靈敏的核酸分析系統(tǒng)之一。寡核苷酸與互補靶核酸序列之間的雜交形成了DNA聚合酶啟動聚合的位點，然后DNA聚合酶從該位點拷貝靶核酸序列模板進而產(chǎn)生與該靶核酸互補的新DNA鏈。通過連續(xù)拷貝新鏈以及原始鏈來擴增DNA。將PCR引物寡核苷酸摻入擴增的產(chǎn)物DNA中，然后鑒定擴增的產(chǎn)物DNA。通過凝膠電泳分離并用化學物質(zhì)染色PCR產(chǎn)物后，通常能對其進行目測觀察?；蛘撸挥媚z電泳時，可通過染料與雙鏈PCR產(chǎn)物的優(yōu)先結(jié)合來定量或半定量檢測PCR產(chǎn)物。還存在其它幾種核酸分析方法，包括連接酶鏈式反應(yīng)、寡核苷酸連接試驗、連接依賴性PCR(UgationdependentPCR)、鏈置換擴增、分支DNA擴增、滾環(huán)擴增、轉(zhuǎn)錄介導的擴增、基于核酸序列的擴增和雜交信號擴增。盡管有許多核酸分析方法，然而已開發(fā)的方法很少能同時區(qū)分兩種或多種核酸耙標或定量測定兩種或多種核酸靶標。設(shè)計用于同時分析許多不同核酸靶標的方法通常不可靠且不靈敏。因此，能同時分析多種核酸靶標(即多重)的核酸分析方法極少常規(guī)用于當前的醫(yī)學、獸醫(yī)學或農(nóng)業(yè)診斷中(Yang等，2004，Lancet.InfectiousDiseases4:337-48;Broude等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98:206-2U;Chamberlain等，1988，NucleicAcidsRes.16:11141-11156;Edwards等，1994，PCRMethodsAppl.3:S65-S75;Hacia等，1998，GenomeRes.8:1245-1258;Li等，1996，NucleicAddsRes.24:538-539;Stuven等，996，Pharmacogenetics6:417-421;雨Orsouw等，1998，Genomics52:27-36)。因此，極其需要開發(fā)不僅能分析一種靶核酸序列，還能同時分析多種靶核酸序列(即多重分析)的靈敏方法。發(fā)明概述因此，一方面，本發(fā)明提供分析試樣中靶核酸的序列方法。這些方法通常包括-在一反應(yīng)容器中合并(1)不與靶核酸序列雜交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游離于溶液中)；(2)提供可檢測信號并與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸(signalingoligonucleotide);(3)至少一種嵌合型寡核苷酸，其包含(a)與靶核酸序列的子序列雜交的第一靶向序列；和(b)與選自以下的序列雜交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信號寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一種協(xié)作性寡核苷酸，所述第二靶向序列與選自以下的序列雜交(a)靶核酸序列中與所述第一靶向序列雜交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互補鏈的子序列，或(C)至少一種嵌合型寡核苷酸；和(5)包含核酸的試樣；-使該反應(yīng)容器中的內(nèi)含物進行核酸處理反應(yīng)以形成反應(yīng)產(chǎn)物(如果試樣中存在靶核酸序列的話)，其中如此形成的反應(yīng)產(chǎn)物包含第一鏈以及第二鏈，第一鏈包含至少一種嵌合型寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，第二鏈包含至少一種協(xié)作性寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，從而阻斷了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，進而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交；和-檢測信號寡核苷酸的可檢測信號，該信號表明試樣中靶核酸的存在或含量。在一些實施方式中，核酸處理反應(yīng)是聚合依賴性核酸處理反應(yīng)，其說明性例子包括a)使嵌合型寡核苷酸的靶向序列與耙核酸序列雜交形成第一雜交體，其中該靶核酸序列以3'-5'方向延伸到該嵌合型寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，從而確定該靶核酸序列的非雜交部分；b)在聚合試劑和核苷酸前體存在下，使用該靶核酸序列的非雜交部分作為模板來延伸該第一雜交體的嵌合型寡核苷酸，從而形成了包含第一延伸產(chǎn)物和耙核酸序列的第一雙鏈體(d叩lex);C)使該第一雙鏈體變性以從第一延伸產(chǎn)物上釋放靶核酸序列；d)使協(xié)作性寡核苷酸與第一延伸產(chǎn)物雜交，從而形成第二雜交體，其中該第一延伸產(chǎn)物以3'-5'方向延伸到該協(xié)作性寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，從而確定了該第一延伸產(chǎn)物的非雜交部分；和e)在聚合試劑和核苷酸前體存在下，使用該第一延伸產(chǎn)物作為模板來延伸該第二雜交體的協(xié)作性寡核苷酸，從而形成了包含該第一延伸產(chǎn)物和與該第一延伸產(chǎn)物互補的第二延伸產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物。步驟a)-e)宜重復一次或多次，通常在約1-約100次之間，一般在約10-約50次之間，更常見在約20-約40次之間。在一些實施方式中，聚合試劑是引物依賴性DNA聚合酶(任選熱穩(wěn)定的)，其說明性例子包括激烈火球菌(尸;;rococa^y^/w的(/yi,)DNA聚合酶、火球菌種(尸jracoc'cws平)GB-D(尸印)DNA聚合酶、沃氏火球菌(/yYcocc"siwew/)(尸wo)DNA聚合酶、水生棲熱菌(772emz附a，a"c^)(7bg)DNA聚合酶、布氏棲熱菌(77^mw6raC朋^)(rar)DNA聚合酶、黃棲熱菌(TTzermz^//ams')(77/)DNA聚合酶、排氣孔嗜高溫菌(77ze，ococc^//tora/的(77/或J^W)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(77zermotogamaW"ma)(7)wfl)DNA聚合酶和嗜熱棲熱菌(:77^，M^^wop/z/Z^Xn/ODNA聚合酶和它們的衍生物。在一些實施方式中，步驟b)中的聚合試劑是引物依賴性逆轉(zhuǎn)錄酶，例如但不限于鳥類成髓細胞白血病病毒(AMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和嗜熱棲熱菌(77zermz^Aerwo;^//^)(7^)DNA聚合酶和它們的衍生物。在一些實施方式中，步驟e)中的聚合試劑是DNA聚合酶，其宜是熱穩(wěn)定的。在其它實施方式中，聚合依賴性核酸處理反應(yīng)包括i)使可環(huán)化的第一協(xié)作性寡核苷酸的第一靶向序列與耙核酸序列的第一子序列雜交形成第一雜交體，其中該第一協(xié)作性寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；ii)使該第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列與該靶核酸序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第二子序列毗連(adjacentto)該第一子序列；iii)在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一協(xié)作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列，形成的第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該耙核酸序列的第一和第二子序列及環(huán)化形式的包含該第一協(xié)作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列的連接產(chǎn)物；iv)使該第一雙鏈體變性以從靶核酸上釋放連接產(chǎn)物；V)使嵌合型寡核苷酸與連接產(chǎn)物雜交以形成第三雜交體；vi)在聚合試劑與核苷酸前體存在下，使用連接產(chǎn)物作為模板來延伸該第三雜交體的嵌合型寡核苷酸，從而形成第一延伸產(chǎn)物；Vii)使第二協(xié)作性寡核苷酸與該第一延伸產(chǎn)物雜交以形成第四雜交體，和viii)在聚合試劑(例如，引物依賴性DNA聚合酶，例如但不限于4)29DNA聚合酶)與核苷酸前體存在下，使用該第一延伸產(chǎn)物作為模板來延伸該第四雜交體的第二協(xié)作性寡核苷酸，從而形成包含第一延伸產(chǎn)物和與該第一延伸產(chǎn)物互補的第二延伸產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物。在其它實施方式中，核酸處理反應(yīng)是連接酶依賴性核酸處理反應(yīng)，其說明性例子包括1.使嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列與耙核酸序列的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；2.使第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列與該靶核酸序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第二子序列毗連該第一子序列；3.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該嵌合型寡核苷酸與該第一協(xié)作性寡核苷酸，形成的第一雙鏈體，其包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該嵌合型寡核苷酸和該第一協(xié)作性寡核苷酸的連接產(chǎn)物；4.使該第一雙鏈體變性以從靶核酸上釋放連接產(chǎn)物；和5.使第二協(xié)作性寡核苷酸與該連接產(chǎn)物的嵌合型寡核苷酸和第一協(xié)作性序列部分雜交以形成反應(yīng)產(chǎn)物。在其它說明性例子中，連接酶依賴性核酸處理反應(yīng)包括a.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸的3'寡核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補，并且可捕捉序列的5'核苷酸不可連接；b.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列與靶核酸序列中毗連該第一子序列的第二子序列雜交以形成第二雜交體，其中可捕捉序列的5'核苷酸不可連接；c.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一嵌合型寡核苷酸與該第二嵌合型寡核苷酸以形成第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該第一嵌合型寡核苷酸和該第二嵌合型寡核苷酸的連接產(chǎn)物；d.使該第一雙鏈體變性以從靶核酸上釋放連接產(chǎn)物；和e.使協(xié)作性寡核苷酸與該連接產(chǎn)物的第一和第二嵌合型寡核苷酸雜交以形成反應(yīng)產(chǎn)物。在還有其它實施方式中，連接酶依賴性核酸處理反應(yīng)包括i.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸包含的可捕捉序列能與捕捉寡核苷酸雜交，并且該第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；ii.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列與靶核酸序列中毗連該第一子序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸包含的可捕捉序列能與信號寡核苷酸雜交；iii.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一嵌合型寡核苷酸與該第二嵌合型寡核苷酸以形成第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該第一嵌合型寡核苷酸和該第二嵌合型寡核苷酸的反應(yīng)產(chǎn)物；和iv.使該第一雙鏈體變性以釋放反應(yīng)產(chǎn)物與靶核酸。在一些實施方式中，步驟l-5或a-e或i-iv可重復一次或多次，通常在約l-約100次之間，一般在約10-約50次之間，更常見在約20-約40次之間。連接試劑宜選自T4DNA連接酶、大腸桿菌Cfoc/^Wc/w'aco//)DNA連接酶和絲狀棲熱菌(77^wM,/i/^附/s)(Tfi)DNA連接酶及它們的衍生物。在另一方面，本發(fā)明提供裝有以下物質(zhì)的試劑盒(1)不與耙核酸序列雜交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游離于溶液中)；P)提供可檢測信號并與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸；(3)至少一種嵌合型寡核苷酸，其包含(a)與靶核酸序列的子序列雜交的第一靶向序列；和(b)與選自以下的序列雜交的可捕捉序列捕捉寡核苷酸；或(ii)信號寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一種協(xié)作性寡核苷酸，所述第二靶向序列與選自以下的序列雜交(a)靶核酸序列中與所述第一靶向序列雜交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互補鏈的子序列，或(c)至少一種嵌合型寡核苷酸。在一些實施方式中，試劑盒還裝有(5)—種或多種聚合和/或連接試劑。在一些實施方式中，(1)-(5)所示任一種或多種組分(例如，1、2、3、4或5)是凍干形式。(1)-(5)所示任兩種或多種組分(例如，2、3、4或5)宜是混合物的形式?；蛘咚鼈兛商幱讵毩⒌娜萜髦?。在一些實施方式中，捕捉寡核苷酸固定在固體表面上(例如，微?；蛑?、納米絲(nanowire)、診斷帶(diagnosticstrip)或反應(yīng)容器的表面)。在一些實施方式中，將兩種或多種捕捉寡核苷酸固定成捕捉寡核苷酸陣列的形式。附圖簡述圖1:顯示通過RT-PCR從以下澳大利亞甲型流感(AustralianInfluenzaA)分離物PB2基因區(qū)段所生成的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠照片H5N3(+)、H5N3、H11N6、H7N7、H12N9、H7N7、H4N4、H6N5和H9N2。圖2:采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的本發(fā)明方法的一種實施方式的示意圖。(圖2A)固定的捕捉寡核苷酸(B);(圖2B)包含信號試劑(C)的信號寡核苷酸(B");(圖2C)包含可捕捉序列(B')和耙向序列(E')及協(xié)作性寡核苷酸(F')的嵌合型寡核苷酸;(圖2D)靶核酸序列(E);(圖2E)包含了第一延伸產(chǎn)物(F)的嵌合型寡核苷酸與靶核酸序列的雜交體；(圖2F)嵌合型寡核苷酸與包含延伸產(chǎn)物的靶核酸序列和包含第二延伸產(chǎn)物(G)的協(xié)作性寡核苷酸的雜交體；(圖2G)固定的捕捉寡核苷酸與包含信號試劑的信號寡核苷酸的雜交體(即，正信號)；(圖211)固定的捕捉寡核苷酸與嵌合型寡核苷酸的雜交體(即，負信號)。圖3:采用滾環(huán)擴增(RCA)的本發(fā)明方法的一種實施方式的示意圖。圖4:采用連接鏈式反應(yīng)(LCR)的本發(fā)明方法的一種實施方式的示意圖。圖5:采用連接鏈式反應(yīng)(LCR)的本發(fā)明方法的一種實施方式的示意圖。圖6:采用連接鏈式反應(yīng)(LCR)的本發(fā)明方法的一種實施方式的示意圖。圖7:顯示采用終點檢測(endpointdetection)分析H7N7甲型流感cDNA的圖示。利用50的0.5pmolPCR-標簽引物(PCR-TAGprimer)進行35輪PCR后，檢測450nm吸光度圖8:顯示滴定實驗結(jié)果的圖示，該實驗采用終點檢測步驟測定本發(fā)明方法的一個實施方式中PCR-標簽引物的最佳用量。35輪PCR擴增后檢測450nm的樣品吸光度。較暗的點顯示PCR靶標存在時的吸光度，較亮的點顯示背景吸光度。圖9:顯示PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色的照片，所述PCR產(chǎn)物按照圖8所示相同試驗擴增來測定PCR-標簽引物的最佳用量。在各種情況中，反向引物的用量是PCR-標簽引物的4倍。陰性對照不含起始模板，PCR反應(yīng)總體積是50(il。泳道號指定為M，HyperLadderII(超分子量梯度II);(1)使用1皮摩爾PCR-標簽引物和H7N7模板的PCR產(chǎn)物；(2)使用0.5皮摩爾PCR-標簽引物和H7N7模板的PCR產(chǎn)物；(3)使用0.25皮摩爾PCR-標簽引物和H7N7模板的PCR產(chǎn)物；(4)使用1皮摩爾PCR-標簽引物陰性對照的PCR產(chǎn)物；(5)使用0.5皮摩爾PCR-標簽引物陰性對照的PCR產(chǎn)物；禾l::l(6)使用0.25皮摩爾PCR-標簽引物陰性對照的PCR產(chǎn)物。序列簡述<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>發(fā)明詳述丄定乂除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解相同的含意。雖然可用與本文所述相似或等價的任何方法與材料實施或檢驗本發(fā)明，但優(yōu)選本文所述的方法與材料。為本發(fā)明的目的，以下術(shù)語如下定義。本文中用冠詞"一"和"一個"指一個或一個以上(即，至少一個)該冠詞的語法賓語。例如，"一個元件"表示一個元件或一個以上的元件。"約"表示某數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或長度與參比數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或長度相比，最多有30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的不同。術(shù)語"擴增"或"核酸擴增"或"擴增反應(yīng)"指能產(chǎn)生某具體靶核酸序列的許多個多核苷酸拷貝的生化反應(yīng)。如果耙核酸序列是單鏈，則該反應(yīng)可產(chǎn)生互補序列。在一些實施方式中，該反應(yīng)是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或使用聚合酶拷貝核酸序列的相似反應(yīng)，例如解旋酶依賴性擴增(HAD)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TM.A)、鏈說換擴增技術(shù)(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增(RCA)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)。寡核苷酸與單鏈形式的耙核酸序列雜交所形成的雙鏈區(qū)域是引發(fā)(啟動)反應(yīng)所需。在其它實施方式中，術(shù)語"擴增"或"核酸擴增"或"擴增反應(yīng)"指使用連接酶或相似的酶來共價連接兩條寡核苷酸或兩條寡核苷酸子序列的生化反應(yīng)，例如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)。當兩條寡核苷酸或寡核苷酸子序列在靶核酸序列中的毗連位點雜交時，連接酶能連接二者?；蛘撸绻麅蓷l寡核苷酸或寡核苷酸子序列在隔開一個或多個核酸殘基的位點雜交，即它們不毗連，則用聚合酶將雙鏈區(qū)域之間的單鏈區(qū)域轉(zhuǎn)化成雙鏈區(qū)域，然后用連接酶連接毗連的寡核苷酸以形成連續(xù)的雙鏈區(qū)域。術(shù)語"可捕捉序列"指能與另一核酸序列雜交的核酸序列。在一些實施方式中，可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，在示范性例子中后者可以是固定于支持物(例如，固體表面)或游離于溶液中。術(shù)語"捕捉寡核苷酸陣列"表示固定在固體表面上已知不連續(xù)位置的多個捕捉寡核苷酸。對于反應(yīng)容器或診斷帶的表面，捕捉寡核苷酸可以排列成兩維空間尋址陣列，例如2X2陣列。或者，捕捉寡核苷酸可以排列成管狀構(gòu)形。在其它實施方式中，捕捉寡核苷酸排列在任何常規(guī)拓撲學構(gòu)造的兩維或三維反應(yīng)容器的內(nèi)表面或外表面上。核酸陣列是本領(lǐng)域已知的，可以許多方式分類；包括有序陣列(例如，分辨不連續(xù)位點的化學物質(zhì)的能力)和隨機陣列。有序陣列包括但不限于采用以下技術(shù)制成的陣列光刻印刷技術(shù)(阿弗麥屈克斯基因芯片(AffymetrixGeneChip))、點樣技術(shù)(辛太尼(Synteni)和其它陣列)、印刷技術(shù)(休萊特帕—德陣列(HewlettPack.ard)和羅塞特陣列(Rosetta))，三維"凝膠墊"陣列等。還可使用液體陣列，即三維陣列方法，例如流式細胞術(shù)。當采用流式細胞術(shù)時，捕捉寡核苷酸宜固定于例如微球等支持物。在一些實施方式中，有序陣列包括在已知位置含有核酸的陣列。即，本文所述的可捕捉序列或捕捉寡核苷酸固定在基板上的已知位置。"已知"位置表示己知或原來已知的位點。本文所用的術(shù)語"嵌合型寡核苷酸"指包含至少兩條核酸序列或部分的寡核苷酸，所述至少兩條核酸序列或部分的位置或連接方式不是天然產(chǎn)生的。術(shù)語"互補"和"互補性"指通過堿基配對規(guī)則而相關(guān)的核苷酸序列。例如，序列"A-G-T-C"與序列"T-C-A-G"互補?；パa可以是"部分互補"，其中只有一些核酸堿基按照堿基配對規(guī)則匹配。因此，互補性無需是完全的；可以有能影響第一序列和第二序列之間雜交的任何數(shù)量的堿基不匹配。然而，如果突變數(shù)量太大以致于在嚴格性最低的雜交條件下亦不能發(fā)生雜交，則該序列不是互補序列。因此，"基本上互補"表示第一序列與第二序列足夠互補，從而能在所選擇的反應(yīng)條件下雜交。本領(lǐng)域熟知足以實現(xiàn)特異性的互補性和雜交嚴格性的關(guān)系。因此，本發(fā)明的任何分析方法中可使用基本上互補的序列。例如，這種序列可以是完全互補的或可含有l(wèi)個到多個不匹配，只要雜交條件足以區(qū)分靶序列和非靶序列。因此，基本上互補的序列的相同性百分比可以是100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75或更低。或者，核酸之間可具有"完全"或"總體"互補性。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度有明顯影響。除非另有需要，否則本說明書全文中的詞語"包含"、"含有"和"包含的"應(yīng)理解為暗示了包括一個所述步驟或元件或步驟組或元件組，但也不排除任何其它步驟或元件或步驟組或元件組。本文所用的"雜交"表示互補核苷酸序列的配對產(chǎn)生了I)NA-DNA、DNA-RNA或DNA-PNA雜交體?；パa堿基序列是通過堿基配對規(guī)則而相關(guān)的那些序列。對于DNA，A與T配對，C與G配對。對于RNA，U與A配對，C與G配對。還可使用堿基肌苷(I)。肌苷可與C或A.或G或T(穩(wěn)定性呈降序)形成堿基配對。在這點上，本文所用的術(shù)語"匹配"和"不匹配"指互補核酸鏈中配對核苷酸的雜交能力。匹配的核苷酸能有效雜交，例如上述經(jīng)典A-T和G-C堿基配對。不匹配是不能有效雜交的核苷酸的其它組合。"分離的"表示基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含自然狀態(tài)下與其正常相伴的組分的物質(zhì)。例如，本文所用的"分離的寡核苷酸"指從天然存在的狀態(tài)下與其側(cè)接的序列中純化出的寡核苷酸，例如，除去了其正常毗連序列的DNA片段。本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"指由通過磷酸二酯鍵(或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類似物)相連的多個核苷酸單位(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類似物)構(gòu)成的聚合物。因此，雖然術(shù)語"寡核苷酸"通常指其中的核苷酸和連接鍵是天然產(chǎn)生的核苷酸聚合物，但應(yīng)該理解該術(shù)語的范圍內(nèi)還包括各種類似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、2-0_甲基核糖核酸等。該分于的確切大小可因具體應(yīng)用而不同。寡核苷酸通常較短，般約10-30個核苷酸，但該術(shù)語也可指任何長度的分子，雖然術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"通常用于大的寡核苷酸。本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"、"多核苷酸"或"核酸"指DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA或PNA。該術(shù)語通常指長度大于30個核苷酸的寡核苷酸。"引物"表示與DNA或RNA鏈配對時，能在合適的聚合試劑存在下啟動引物延伸產(chǎn)物合成的寡核苷酸。為獲得最大程度的擴增效率，引物通常是單鏈的，但還可以是雙鏈的。引物必須足夠長，從而能在聚合試劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的長度取決于許多因素，包括應(yīng)用、采用的溫度、模板反應(yīng)條件、其它試劑和引物來源。例如，依據(jù)耙序列的復雜性，寡核苷酸引物通常含有15-35個或更多個核苷酸，雖然其可以只含有較少的核苷酸。引物可以是大的多核苷酸，例如約200個核苷酸-幾千堿基或更多?？梢赃x擇引物，使其與設(shè)計與之雜交的模板上的序列"基本上互補"，并可用作啟動合成的位點。"基本上互補"表示引物的互補性足以與耙核苷酸序列雜交。引物與設(shè)計與之雜交的模板之間最好不含錯配，但這不是必需的。例如，可將非互補的核苷酸連接于引物的5，端，其余的引物序列與模板互補?；蛘?，可將非互補核苷酸或非互補的核苷酸段插入引物中，前提是引物序列與要雜交的模板序列足夠互補，從而形成用于合成引物的延伸產(chǎn)物的模板。用于描述兩條或多條核酸序列之間序列關(guān)系的術(shù)語包括"參比序列"、"比較窗"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"和"基本上相同"。"參比序列"的長度至少是10個，但經(jīng)常是15-20個，常是至少25個單體單位(即核苷酸)。因為兩條核酸序列可以各含有(l)在兩條多核苷酸之間相似的序列(即，只是整個核苷酸序列的一部分)，和(2)在兩條核酸序列之間不同的序列，一般通過在"比較窗"上比較核酸序列的序列以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域，從而在兩條(或多條)核酸序列之間進行序列比較。"比較窗"指至少50個，通常約50-約100個，更常見約100-約150個連續(xù)位置的概念性區(qū)段，其中兩條序列進行最佳比對后，將一條序列與連續(xù)位置數(shù)量相同的參比序列作比較。為了最佳比對兩條序列，與參比序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗可包含約20%或更少的添加或缺失(即，空位)。為比對某比較窗，可通過計算機執(zhí)行算法[(威斯康星遺傳學軟件包7.0版(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，遺傳學計算杉—L纟fi(GeneticsComputerGroup),575ScienceDrive麥迪遜，威斯康星州，美國)]或通過觀測和所選擇的各種方法產(chǎn)生的最佳比對(即，在比較窗..匕獲得的同源性百分比最高)來最佳比對序列。還可參考BLAST族程序，例如Altschul等，1997，Nucl.AcidsRes.25:3389所披露的。序列分析的詳細討論可見Ausubel等，"《嵐新分子生物學方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)"，約翰威立父子公司(JohnWiley&Sonslnc)，1994-1998，第15章中的19.3部分。術(shù)語"反應(yīng)容器"指進行本發(fā)明方法的容器。反應(yīng)容器可以是適用于標準分子生物學反應(yīng)的任何容器，因此可以適合這種應(yīng)用的材料構(gòu)建。這種材料可以是天然或合成的，或者可聯(lián)用天然和合成材料形成?？捎糜跇?gòu)建反應(yīng)容器的示范性材料包括塑料(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯)、玻璃等。本發(fā)明的特別優(yōu)選的反應(yīng)容器包括常規(guī)PCR試管和微量滴定板，例如96-孔微量滴定板。在本發(fā)明的一些實施方式中，將捕捉寡核苷酸固定在反應(yīng)容器的內(nèi)表面上。在這些實施方式中，反應(yīng)容器宜用透明材料構(gòu)建，從而能從反應(yīng)容器外部檢測信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸的雜交。在具體的實施方式中，反應(yīng)容器的特征在于其具有基本上平的表面?；蛘撸磻?yīng)容器的特征在于其具有基本上管狀的表面，即將兩維平面薄板巻成三維管狀構(gòu)形?？捎眠@種構(gòu)形將更大表面積的捕捉寡核苷酸固定入例如"流通"小室中。在其它實施方式中，反應(yīng)容器是微射流裝置。在本文中，術(shù)語"序列相同性"和"相同性"可互換使用，其指在比較窗上核酸序列按照核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的相同程度。因此，"序列相同性百分比"通過以下步驟計算在比較窗上比較兩條最佳比對的序列，測定兩條序列中核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)相同的位置數(shù)以獲得匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的位置總數(shù)(即，窗大小)，將結(jié)果乘以ioo從而獲得序列相同性百分比。對于本發(fā)明的目的，"序列相同性"應(yīng)理解為表示用軟件隨附的參考手冊所用的標準默認值，通過DNASIS計算機程序(用于windows的2.5版本；購自日立軟件工程有限公司(HitachiSoftwareengineeringCo.,Ltd.),南舊金山，加利福尼亞州，美國)計算的"匹配百分比"。本文所用的"嚴格性"指雜交期間的溫度和離子強度條件，以及是否存在某些有機溶劑。嚴格性越高，進行雜交的核酸序列之間的互補性程度越高。本文所用的"嚴格條件"指如下溫度和離子強度在該條件下只有基本上互補或互補堿基比例高，優(yōu)選具有精確互補性的多核苷酸和寡核苷酸才會雜交并且在一些實施方式中會產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。所要求的嚴格性依賴于核苷酸序列，并取決于雜交期間存在的各種組分，嚴格性通常隨所用的核苷酸類似物而有很大變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知嚴格條件。對于將寡核苷酸用作雜交反應(yīng)中的探針，嚴格條件通常選擇比在確定離子強度和pH下具體序列的計算熱解鏈溫度(Tm)低約10-20°C。Tm是50%的靶序列與互補探針雜交的溫度(在確定離子強度和pH下)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知Tm的計算。利用下式可以最佳地計算長度短于14個堿基殘基的寡核苷酸的Tm:Tm=4(wG+xC)+2(yA+zT)-16.6*logl0(0.050)+16.6*loglO([Na+])，其|::l::1w、x、y、z分別是序列中堿基G、C、A、T的數(shù)目，[Na+]是鹽濃度。對于長亍13個堿基殘基的寡核苷酸，通過Breslauer等(1986，Proc.Nat.Acad.Sci.83:3746-50)所述的最近鄰公式(nearestneighbourformulae),但使用Sugimoto等(1996，Nucl.AcidsRes.24:4501-4505)公布的數(shù)值計算Tm。RNA熱力學特性的數(shù)值可取自Xia等(1998，Biochemistry37:14719-14735)。應(yīng)該理解寡核苷酸探針或引物至少可在低嚴格條件.F，優(yōu)選至少在中等嚴格條件F，更優(yōu)選在高嚴格條件下與靶序列雜交。本文所述探針雜交反應(yīng)的低嚴格條件包括和包含42'C雜交條件為至少約1Mv/v-至少約15%v/v的甲酰胺和至少約1M-至少約2M的鹽；42'C洗滌條件為至少約1M-至少約2M的鹽。低嚴格條件還包括65X:雜交條件為1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS;室溫下洗滌條件為(i)2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA，1mMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。探針雜交反應(yīng)的中等嚴格條件包括和包含42'C雜交條件為至少約16%v/v-至少約30%v/v的甲酰胺和至少約0.5M-至少約0.9M的鹽；42'C洗滌條件為至少約0.5M-至少約0.9M的鹽。中等嚴格條件還包括65t:雜交條件為1%牛血清白蛋白(BSA)、lmMEDTA、0.5MNalIP04(pH7.2)、7%SDS;42。C洗滌條件為(i)2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5。/。BSA，lmMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。探針雜交反應(yīng)的高嚴格條件包括和包含42t:雜交條件為至少約31%v/v-至少約50%v/v的甲酰胺和至少約0.01M-至少約0.15M的鹽；42。C洗滌條件為至少約0.01M-至少約0.15M的鹽。高嚴格條件還包括65。C雜交條件為1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS;65。C以上的洗滌條件為(i)0.2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA，lmMEDTA，40mMNalIP04(pH7.2)，1%SDS。本領(lǐng)域熟知探針雜交反應(yīng)的其它嚴格條件。技術(shù)人員己知可以調(diào)節(jié)各種因素來優(yōu)化雜交特異性。可優(yōu)化最終洗滌的嚴格性以確保高雜交程度。詳細的例子參見《最新分子生物學方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(同上)，第2.10.1-2.10.6頁和《分子克隆實驗室手冊》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL〕(Sambrook等編)(冷泉港出版社，1989),第1.101-1.104章。短語"靶核酸序列"指感興趣的任何核酸序列。其可以是完整的基因或其一部分。因此，靶核酸序列可以是包含遺傳突變，例如但不限于核苷酸插入、缺失和單核苷酸多態(tài)性(SNP)的某基因一部分。靶核酸序列還可以是完整的基因或其一部分編碼的核酸。因此，本發(fā)明所考慮的靶核酸序列包括DNA、cDNA、RNA、mRNA和cRNA。靶核酸序列還可以是天然產(chǎn)生或合成的核酸分子。Z分橋微,鄉(xiāng)旅本發(fā)明提供分析靶核酸序列的方法，例如測定其是否存在或數(shù)量。該方法利用多種寡核苷酸與核酸處理反應(yīng)合作，從而在耙核酸序列存在下產(chǎn)生可檢測信號。所述多種寡核苷酸包含(1)任選固定在固體表面并且不與靶核酸序列雜交的捕捉寡核苷酸；(2)提供可檢測信號并與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸；(3)在一些實施方式中可用作引物的至少一種嵌合型寡核苷酸，其包含(a)與耙核酸序列的子序列雜交的第一耙向序列；和(b)與選自以下的序列雜交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信號寡核苷酸；和(4)包含第二靶向序列的至少一種協(xié)作性寡核苷酸，其在一些實施方式中可用作引物，所述第二靶向序列與選自以下的序列雜交(a)靶核酸序列中與所述第一靶向序列雜交的子序列不同的子序列；或(b)耙核酸序列的互補鏈的子序列，或(c)至少一種嵌合型寡核苷酸。本發(fā)明的核酸處理反應(yīng)獲得的如下反應(yīng)產(chǎn)物(如果試樣中存在耙核酸序列的話)其包含第一鏈以及第二鏈，第一鏈包含至少一種嵌合型寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，第二鏈包含至少一種協(xié)作性寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，從而阻斷了嵌合寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，進而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交并給出靶標是否存在或數(shù)量的信號。當靶核酸序列不存在時，核酸處理反應(yīng)不可能發(fā)生，從而使得嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交并阻斷信號。3.孩麼必潘反座本發(fā)明方法可采用能產(chǎn)生上述反應(yīng)產(chǎn)物的任何核酸處理方法。示范性核酸處理方法包括核酸擴增。本領(lǐng)域熟知核酸擴增的代表性方法，包括但不限于PCR(參見，例如Saiki等，1985，Science,230:1350-1354;Mullis等，1987，MethodsEnzymol155:335-350)、鏈置換擴增(SDA和多重SDA(MSDA);參見，例如美國專利5,422,252和Little鄉(xiāng))、滾環(huán)擴增(RCA;參見，例如Liu等，1996，J.Am.Chem.Soc118:1587-1594和美國專利5,854,033及美國專利6,642,034)、基于核酸序列的擴增(NASBA;參見，例如So()knanan等，1994，Biotechniques17:1077-1080)、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR;參見，例如WO89/09835)和Q|3復制酶擴增(參見，例如Tyagi等，1996,同,..t:)。還可利用這些技術(shù)的各種替代方法，例如SyvanenAnne-Christine，(2001，同上)所總結(jié)的。在本方法中，可利用不同擴增反應(yīng)的任何可用特征組合來提高該方法的靈敏度和/或特異性。在一些實施方式中，本發(fā)明的核酸處理反應(yīng)基于聚合酶依賴性核酸擴增反應(yīng)。示范性的此類擴增是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，其中當一對寡核苷酸中的一條寡核苷酸與其互補的寡核苷酸分開時，由其合成的延伸產(chǎn)物可用作模板來合成該對中另一寡核苷酸的延伸產(chǎn)物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，通常利用熱穩(wěn)定的引物依賴性聚合酶，聚合酶的選擇通常取決于所用的具體PCR方法。如圖2所示，在示范性的此類例子中，嵌合型寡核苷酸的靶向序列與靶核酸序列之間形成第一雜交體。然后用聚合試劑延伸靶向序列，該試劑可以是引物依賴性DNA聚合酶或引物依賴性逆轉(zhuǎn)錄酶。這種酶的作用是將核苷三磷酸(例如，脫氧核糖核苷酸三磷酸；dNTP)摻入雜交體的靶向序列延伸段中，這種摻入作用可以對含有在寡核苷酸引物的3，末端核苷酸和靶核苷酸序列的5，末端核苷酸之間完全匹配配對的雜交體具有選擇性，或者無選擇性，無論這種配對是否完全匹配。在這點上，熟知一些酶，例如真核引物依賴性DNA聚合酶和鳥類骨髓瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶不具有3'糾錯活性(核酸外切酶'(exo:0，因此只延伸含有在寡核苷酸的3'末端核苷酸和靶核苷酸序列的5'末端核苷酸之間完全匹配的雜交體中結(jié)合的核苷酸。或者，其它結(jié)合試劑，例如原核來源的引物依賴性DNA聚合酶包括，例如大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，具有糾錯活性(核酸外切酶+(exo+))，因此不顯示其選擇性，雖然可從商品供應(yīng)商購得缺乏這種糾錯活性的這種酶的變型。然而，寡核苷酸延伸使用3'exo—聚合試劑通常是理想的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知基于PCR的核酸處理反應(yīng)可用的合適聚合試劑。為重復PCR的輪次而無需額外加入DNA聚合酶，DNA聚合酶宜是熱穩(wěn)定的，包括但不限于激烈火球菌(尸jrococc船y^/owX)(/yw)I:)NA聚合酶、火球菌種(P，ococcwGB-D(/^p)DNA聚合酶、沃氏火球菌(/^racoccMwoew/)(尸wo)DNA聚合酶、水生棲熱菌(77zermz^a^a"c船)(7^《)DNA聚合酶、布氏棲熱菌(77^wws6roc/am^)(7^)DNA聚合酶、黃棲熱菌(Thermusflavus)(^7)I)NA聚合酶、排氣孔嗜高溫菌(77^mwcocc^toorafo)(77/或^W)[)NA聚合酶、海棲熱袍菌(772ermo/oga"wW"ma)(7^a)DNA聚合酶和嗜熱棲熱菌(7Tzd^Ae，o;/z//^)(7%)DNA聚合酶和它們的衍生物。本發(fā)明所用的合適逆轉(zhuǎn)錄酶，例如但不限于鳥類成髓細胞白血病病毒(AMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和嗜熱棲熱菌(77^mzMAe，o;/H7w力(7Y/z)DNA聚合酶和它們的衍生物。選擇聚合試劑的其它因素包括試樣中的核酸是DNA還是RNA(即，一般只有逆轉(zhuǎn)錄酶能將脫氧核苷三磷酸有效摻入RNA模板的延伸產(chǎn)物中)。利用靶核酸序列作為模板來延伸嵌合型寡核苷酸的耙向序列會產(chǎn)生含有第一延伸產(chǎn)物和靶核酸序列的雙鏈體。然后通過變性使該第一延伸產(chǎn)物與耙核酸序列分開，從而使得協(xié)作性寡核苷酸能與該第一延伸產(chǎn)物雜交，因此形成了第二雜交體。然后，如上所述用該第一延伸產(chǎn)物作為模板延伸該協(xié)作性寡核苷酸。因為該第--:延伸產(chǎn)物包含該嵌合型寡核苷酸，在此階段形成的第二雙鏈體包含該第一延伸產(chǎn)物和與該第一延伸產(chǎn)物互補，因而也與該嵌合型寡核苷酸互補的第二延伸產(chǎn)物。此第二雙鏈體對應(yīng)于本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物。與可捕捉序列互補的序列是"阻斷"序列，其用亍阻斷嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，從而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交。在其它實施方式中，聚合酶依賴性擴增包括滾環(huán)擴增(RCA)，其中寡核苷酸引物與環(huán)狀核酸分子的雜交可進行連接，即環(huán)化，DNA聚合酶(通常具有鏈置換活性)利用該環(huán)狀核酸分子作為模板合成第一延伸產(chǎn)物。延伸產(chǎn)物通常是長核酸分子，其含有多個與模板環(huán)狀核酸分子互補的重復序列。對于PCR，在互補寡核苷酸引物存在F，第一延伸產(chǎn)物隨后可用作模板來合成其它延伸產(chǎn)物，從而能擴增原始模板環(huán)狀核酸分子。如圖3所示，在此類的示范性例子中，協(xié)作性寡核苷酸和靶核酸序列之間形成第一雜交體，從而能在雜交后環(huán)化該協(xié)作性寡核苷酸。協(xié)作性寡核苷酸具有可連接的末端(如圖3所示的E,'和E2')，從而可用連接酶催化連接該協(xié)作性寡核苷酸的5'和3'末端(詳述于—F文)。含有可捕捉序列(B')的嵌合型寡核苷酸與環(huán)化的協(xié)作性延伸產(chǎn)物雜交，引發(fā)用鏈說換聚合酶催化的第一延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生。加入與第一延伸產(chǎn)物某區(qū)域互補的另一協(xié)作性棼核苷酸(F')，假如環(huán)狀探針得到連接，則能引發(fā)第二延仲產(chǎn)物產(chǎn)生。第二延伸產(chǎn)物與嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列部分互補。第二延伸產(chǎn)物中與可捕捉序列互補的序列是"阻斷"序列，其阻斷嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，從而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交。適合r本發(fā)明所考慮的RCA的DNA聚合酶宜能置換與模板鏈互補的鏈，這稱為鏈'A':換，這些:DNA聚合酶缺乏5'到3'核酸外切酶活性。合成連接的協(xié)作性寡核苷酸多份拷貝需耍鏈置換。如果具有5'到3'核酸外切酶活性，則能破壞合成的鏈。本發(fā)明方法所用的DNA聚合酶具有高度持續(xù)性也是理想的。通過評估本發(fā)明方法所用DNA聚合酶進行滾環(huán)復制的能力不難測定其是否適用亍本發(fā)明方法。示范性滾環(huán)DNA聚合酶包括細菌噬菌體029DNA聚合酶(美國專利5,198.543和5,001,050)、噬菌體M2DNA聚合酶(Mats腿oto等，Gene84:247(1989))、噬菌體(!)PRD1DNA聚合酶(Jung等，Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:8287(1987))、VENT.RTM.DNA聚合酶(Kong等，J.Biol.Chem.268:1965-1975(1993))、DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等，Eur.J.Biochem.45:623-627(1974))、T5[)NA聚合兩每(Chatterjee等，Gene97:13-19(1991))、I)RDlDNA聚合酶(Zhu和Tto，Bk)chim.Biophys.Acta.1219:267-276(1994))和T4DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic,Curr.Biol.5:149-157(1995))。具體的實施方式中利用(D29DNA聚合酶。利用鏈置換因子，例如解旋酶可促進鏈置換。能在鏈置換因子存在下執(zhí)行滾環(huán)復制的任何DNA聚合酶認為適用于所述方法，即使該DNA聚合酶在不存在這種因子時不能執(zhí)行滾環(huán)擴增?？捎秘CA的鏈置換因子包括但不限于BMRF1聚合酶附屬亞難(accessorysubunit)(Tsu讓i等，J.Virology67:7648-7653(1993))、腺病點DNA-結(jié)合蛋白(Zijderveld和vanderVliet，J.Virology68:1158-1164(1994))、單純皰疹病「1ICP8(Boehmer和Lehman,J.Virology67:711-715(1993);Skaliter禾[lLehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10665-10669(1994))、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB;Rigler和Romano,J.Biol.Chem.270:8910-8919(:1995))和小牛胸腺解旋酶(Siegel等，J.Biol.Chem.267:13629-13635(1992))。/[;其它實施方式中，該核酸處理反應(yīng)基于連接酶依賴性核酸擴增。具體地說，XHl5]^利4,883,750描述了寡核苷酸連接試驗。連接酶依賴性反應(yīng)的例子是連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)，其中一種寡核苷酸與第一靶序列雜交，另一種寡核苷酸與該第一靶序列毗連的第二靶序列雜交。將雜交配對的寡核苷酸用作連接底物來產(chǎn)生含有兩種寡核苷酸的連接產(chǎn)物。如果耑耍，隨后nj以將連接產(chǎn)物從靶序列上置換下來(例如通過變性)以產(chǎn)生該靶序列的其它連接產(chǎn)物，因此擴增了與該靶核酸互補的連接寡核苷酸。如圖4所示，在該類型的示范性實例(=卩'，通過嵌合型寡核苷酸的第-耙向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交形成第一雜交體，其中該嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補。然后通過第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列與該靶核酸序列的第::::::::::子序列雜交形成第二雜交體，其中該第..::::::::::子序列毗連該第一子序列。隨后在該第一子序列的5'核苷酸與連接試劑存在.F將該嵌合型寡核苷酸與該第一協(xié)作性寡核苷酸相連，從而形成含有該靶核酸序列的第一和第二子序列及含有該嵌合型寡核苷酸和該第一協(xié)作性寡核苷酸的連接產(chǎn)物的第-雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些實施方式中可用的合適連接試劑，包括但不限于T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶和絲狀棲熱菌(77)DNA連接酶以及它們的衍生物。在某些實施方式中，該連接試劑是熱穩(wěn)定性的。連接后，通過變性將連接產(chǎn)物與靶核酸序列分離，從而可使第二協(xié)作性寡核苷酸與連接產(chǎn)物的嵌合型寡核苷酸和第協(xié)作性序列部分雜交形成反應(yīng)產(chǎn)物。第二協(xié)作性寡核苷酸具有與嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列互補的阻斷區(qū)域，即阻斷序列，該序列用亍阻斷嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，從而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交。當?shù)谝粎f(xié)作性寡核苷酸未與嵌合型寡核苷酸相連，即耙核酸序列不存在時，第二協(xié)作性寡核苷酸的阻斷區(qū)域通常不與可捕捉序列雜交，或只以較低的親和力雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知，通過以—F步驟可使得只有第一協(xié)作性寡核苷酸與嵌合型寡核苷酸相連時發(fā)生阻斷區(qū)域與可捕捉序列的實質(zhì)性雜交(i)調(diào)節(jié)第二協(xié)作性寡核苷酸的阻斷區(qū)域的大小和/或(ii)該阻斷區(qū)域與嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列的互補性；或(iii)插入非互補序列使之舭連阻斷序列。調(diào)整毗連阻斷序列的非互補序列堿基組成使之與第一連接產(chǎn)物更多或更少地互補能通過以R方式調(diào)節(jié)檢測系統(tǒng)的靈敏度。如果將非互補序列(圖4中B2和E2之間的區(qū)段)與第一連接產(chǎn)物調(diào)節(jié)(或"調(diào)諧")為更互補，將增加檢測系統(tǒng)的靈敏度(即，使之能檢測濃度較低的靶序列)，而如果將調(diào)節(jié)(或"調(diào)諧":)為與第一連接產(chǎn)物的互補性較低，則檢測系統(tǒng)的靈敏度降低。因此，可利用可調(diào)諧非互補間插序列來調(diào)節(jié)處理反應(yīng)的靈敏度。圖5A顯示了采用LCR的另一示范性例子，其包括將第一嵌合型寡核苷酸的第,巴向序列(Er-Br)與靶核酸序列的第一予序列雜交以形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一亍序列的5'核苷酸互補，并且可捕捉序列的5'核苷酸(該可捕捉序列是該第一嵌合型寡核苷酸的一部分)不可連接。然后使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列(E2'-B2')與靶核酸序列中毗連該第一子序列的第::::::::子序列雜交以形成第二雜交體，其中可捕捉序列的3，核苷酸(該可捕捉序列是該第二嵌合型寡核苷酸的一部分)不可連接。在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在F，將該第一嵌合型寡核苷酸與該第二嵌合型寡核苷酸相連，從而形成包含該靶核酸序列的第---和第::::::::::子序列及同時含有該第一嵌合型寡核1f酸和該第二嵌合型寡核苷酸的連接產(chǎn)物的第一雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知該實施方式中可用的合適連接試劑，包括但不限于T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶和絲狀棲熱菌(70DNA連接酶以及它們的衍生物。在一些實施方式中，該連接試劑是熱穩(wěn)定性的。然后使該第一雙鏈體變性來分離連接產(chǎn)物與耙核酸。以此方式可將連接產(chǎn)物與捕捉寡核苷酸(圖5A中的B)雜交，從而競爭與信號靡核苷酸(圖5A中的B")結(jié)合。在此例，超過預(yù)定范圍的信號量與起始靶序列的含量逆相關(guān)。在該例子的改進形式中，與第一嵌合型探針(Er-Br)和第二嵌合型探針間有"間隙"(圖5B)。雜交后，先用聚合酶填補Er和E2，之間的間隙，再用連接酶催化連接步驟?；蛘咴陔s交步驟中加入與靶標(E)中的間隙序列互補的間隙填補寡核苷酸，并且該間隙填補寡核苷酸參與連接反應(yīng)。圖6A顯示了采用LCR的另--示范性例子，包括將第一嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列與耙核酸序歹"E)的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸包含能雜交捕捉S核苷酸的可捕捉序列(1V)，并且該第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第-子序列的5'核苷酸互補。使第::......:嵌合型寡核苷酸的第二耙向序列(E2'-B4')與靶核酸序歹U(E)中毗連該第一子序列的第二子序列雜交以形成第二雜交體，其中該第二嵌合型寡核苷酸包含能雜交信號寡核苷酸(B")的可捕捉序列(IV)。在該第一:f序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，將該第一-嵌合型寡核苷酸4該第二嵌合型寡核苷酸相連，從而形成包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及冋時含有該第一嵌合型寡核苷酸和該第二嵌合型寡核苷酸的連接產(chǎn)物的第一雙鏈體。然后使該第--雙鏈體變性來分離反應(yīng)產(chǎn)物與靶核酸。通過與基板上的捕捉寡核苷酸以及含有可檢測部分的信號寡核苷酸雜交來檢測反應(yīng)產(chǎn)物，例如但不限于乳膠珠、膠體金、酶、量子點(quantumdot)或信號放大技術(shù)(SAT;例如翻專利5,902,724)。在后一例子中，超過預(yù)定范圍的信號量與原始樣品中的靶序列含量成比例。相關(guān)實施方式(圖6B)需要存在聚合酶來填補與El'和E2'互補的區(qū)域之間的間隙序列，或使用具有適合的磷酸化末端從而能進行酶催化連接的可連接間隙填充性寡核苷酸。本發(fā)明的連接酶依賴性實施方式產(chǎn)生的連接產(chǎn)物還可以通過RCA環(huán)化和擴增。木發(fā)明的核酸處理反應(yīng)可以包括試驗可含有的各種其它試劑。這些試劑包括，例如鹽類、緩沖液、中性蛋白質(zhì)(例如白蛋白)、洗滌劑等，這些試劑可用于促進最佳雜交、鏈合成和檢測，和/或降低非特異性或背貫相互作用。依據(jù)樣品制備方法和靶標的純度，還可使用提高試驗效率的其它試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌劑等?！段⑥k根據(jù)試樣中是否存在靶核酸序列，本發(fā)明捕捉寡核苷酸可雜交或"捕捉"信號寡核苷酸或嵌合型寡核苷酸。在一些實施方式中，將捕捉寡核苷酸固定在固體表面上，而在其它實施方式中，它游離于溶液中。在捕捉寡核苷酸固定在固體表面上的實施方式中，該表面可由合成改性的天然、合成或天然產(chǎn)生的物質(zhì)構(gòu)成，包括但不限于纖維素物質(zhì)，例如紙張，纖維素和纖維素衍生物，如醋酸纖維素；玻璃或玻璃纖維；天然或合成的織物；塑料；尼龍；多孔凝膠，例如瓊脂糖；硅膠、葡聚糖和明膠；多孔纖維基質(zhì)；基亍淀粉的物質(zhì)，例如葡聚糖凝膠(Sephadex)交聯(lián)的葡聚糖鏈；陶瓷物質(zhì)；乳膠；聚氯乙烯和聚酰胺膜；聚苯乙烯；聚碳酸酯；和聚氯乙烯-二氧化硅的組合，等，。在一些實施方式中，固體表面形成了反應(yīng)容器中進行處理反應(yīng)的表面。在其它實施方式中，固體表面還可以是插入反應(yīng)容器中并在完成用于信號檢測的處理反應(yīng)后拿出的診斷帶的表面。在還有其它實施方式中，固體表面是任選作標記以協(xié)助鑒定的微粒或珠的表面。在其它實施方式中，表面是半導體納米線(semiconductingnanowire)，該表面宜配置成場效應(yīng)晶體管，并在核酸序列(例如，可捕捉序列)與固定在納米線表面的捕捉寡核苷酸結(jié)合或雜交后能改變導電率(參見，例如Cui等，2001，Science293:1289-1292;Hahm和Lieber，2004，NanoLett.4:51-54;Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.SciUSA100:4984-4989;Chen等，2004，J.Am.Chem.Soc.126:1563-1568和Patolsky等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:〗4017-14022)?？刹捎萌魏魏线m的技術(shù)將捕捉寡核苷酸固定在固體表面。例如，Holstrom等(1993，Anal.Biochem.209:278-283)利用生物素對親和素和鏈棉親和素的親和力將生物素化的核酸分子固定于親和素/鏈霉親和素包被的支持物.....t:?？刹捎玫牧矸椒òㄓ镁?L-Lys或聚-L-Lys、Phe預(yù)先包被聚苯乙烯或玻璃固相，然后利用雙功能交聯(lián)劑共價連接氨基或巰艱改性的寡核苷酸(Running等，1990，Biotechniques8:276-277;Newton等，1993，NucleicAcidsRes.21:1155-1162)。Kawai等(1993，AnalBiochem.209:63-69)描述了連接短寡核苷酸探針以形成多聚體，再將其克隆入噬菌粒載體的替代方法。然后再將這些寡核苷酸連接在聚苯乙烯板....匕并用254nmUV照射固定。還可參考將短的5'-磷酸化寡核苷酸引物直接共價連接于化學改性的聚苯乙烯板(交聯(lián)(CovalinkTM)板，南克公司(Nunc))的方法(Rasmussen等，1991，Anal.Biochem.198:138-142)。還可考慮O'C()rmeU-Mak)ney等的文章(1996，TIBTECH14:401-407)，該篇文章披露了分別將生物素化寡核苷酸和巰基化寡核苷酸固定于鏈霉親和素包被的硅晶片和碘乙酰胺包被的硅晶片。還將氨基改性的寡核苷酸固定在異硫氰酸酯包被的玻璃上(Guo等，1994，NucleicAcidsRes.22:5456-5465)和環(huán)氧硅烷(silane-ep()xide)包被的晶片.....匕(Eggers等，1994，BioTechniques17:516-5240)。......I二述方法指合成后將寡核苷酸引物連接于基板?；蛘撸梢圆捎?，例如Maskos和Southern(1992，NucleicAcidsRes，201679-1684)或Fodor等(同上)的方法原位合成寡核苷酸引物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可將捕捉寡核苷酸直接或間接固定于固體表面上。例如，可將捕捉寡核苷酸吸附于固體表面，或者共價連接于間隔分子，該間隔分子共價連接于固體表面。所述間隔分子可包括乳膠微粒，蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)或聚合物，例如葡聚糖或聚-(乙二醇)?；蛘?，間隔分子可以包含同型-多核苷酸尾，例如寡聚-dT。捕捉寡核苷酸可以任何排列方式安排于固體表面，只要有助于在信號寡核苷酸被捕捉時檢測信號寡核苷酸。在某些實施方式中，將捕捉寡核苷酸在固體表面上排布成捕捉寡核苷酸陣列的形式。將對應(yīng)于具體靶標的捕捉寡核苷酸固定于陣列的特定位置有助于檢測多重反應(yīng)的結(jié)果。在將捕捉寡核苷酸固定在微?；蛑榈膶嵤┓绞街校鶕?jù)反應(yīng)所用微?；蛑榭倲?shù)的特定比例固定對應(yīng)于具體耙標的捕捉寡核苷酸有助于檢測多重反應(yīng)的結(jié)果。本發(fā)明的捕捉寡核苷酸通常不是靶標特異性的，而是對本文所述嵌合型寡核苷酸或信號寡核苷酸中所含的各人工可捕捉序列特異(優(yōu)選的)，從而能將它們用作"通用陣列"。即，含有相同或有限組捕捉寡核苷酸的陣列(固相或液相陣列)。"液相陣列"表示通過，例如流式細胞術(shù)分析的溶液中的陣列。在一些實施方式中，捕捉寡核苷酸采取通用表面的形式；S卩，包含可制造和應(yīng)用于任何用途的有限組捕捉寡核苷酸的標準陣列。這種通用陣列與基本上互補的信號寡核苷酸聯(lián)用，信號寡核苷酸在靶序列存在下與捕捉寡核苷酸結(jié)合。最終的用戶只需設(shè)計包含任何所需靶序列的不同嵌合型寡核苷酸便可定制陣列，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這通常是簡單而低廉的。一些實施方式制備了不同的通常為人工捕捉寡核苷酸陣列；即，捕捉寡核苷酸與己知的靶序列不具有互補性。然后可將與陣列的捕捉寡核苷酸基本上互補的可捕捉序列摻入嵌合型寡核苷酸中。試樣中存在靶核酸序列時，本發(fā)明的信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交并提供表明該試樣中存在該靶核酸序列的至少部分可檢測信號。因此，信號寡核苷酸包含能與捕捉寡核苷酸雜交的核苷酸序列和與該寡核苷酸結(jié)合的信號試劑。信號寡核苷酸中結(jié)合有信號試劑，包括(1)直接連接信號試劑與信號寡核苷酸；(2)間接連接信號試劑與信號寡核苷酸(即，連接信號試劑與隨后結(jié)合信號寡核苷酸的第二中間體)；和(3)連接信號寡核苷酸的后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物。信號試劑宜直接連接于信號寡核苷酸。信號試劑可選自色原、催化劑、酶、熒光團、發(fā)光分子、化學發(fā)光分子、鑭系離子(如銪(Eu34))、放射性同位素和直接可見的信號試劑。直接可見的信號試劑可利用膠態(tài)金屬或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質(zhì)體、枝聚體(dendrimer)(或枝聚體樣或連環(huán)體(concatenated)核酸結(jié)構(gòu)，例如SAT)或含有產(chǎn)信號物質(zhì)的其它載體，等等。U.S.4,366,241;U.S.4,843,000和U.S.4,849,338披露了大量適用作信號試劑的酶。可用于本發(fā)明的合適酶信號試劑包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等?？蓡为毷褂妹感盘栐噭?，或與溶液中的第二酶聯(lián)用。或者，可用作本發(fā)明合適信號試劑的熒光團包括但不限于熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、熒光黃或R-藻紅蛋白。還應(yīng)該知道在間接連接信號試劑的情況中(2)，例如生物素、洋地黃毒甙、鏈霜親和素和各種蛋白質(zhì)抗原等試劑可用作接頭并且需要存在第二中間體來產(chǎn)生可檢測信號。對于生物素，第二中間體可包括鏈霉親和素酶偶聯(lián)物。對于抗原信號試劑，第二中間體可包括抗體-酶偶聯(lián)物。在捕捉寡核苷酸游離于溶液中的某些實施方式中，捕捉寡核苷酸包含信號檢測系統(tǒng)的一部分，信號寡核苷酸包含該信號檢測系統(tǒng)的另一部分，其中各部分協(xié)作以產(chǎn)生表明試樣中存在靶核酸序列的第一信號或表明試樣中不存在靶序列的第二信號。在示范性例子中，捕捉寡核苷酸包含受體熒光團，信號寡核苷酸包含供體熒光團，從而當信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交時，受體和供體熒光團足夠接近進而誘發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。檢測到FRET能給出試樣中存在靶核酸序列的信號，而缺乏FRET可給出試樣中不存在該序列的信號。技術(shù)人員知道，可用以下兩種方法中的至少一種檢測FRET:熒光法或猝滅法。在熒光法中，將熒光檢測器設(shè)置于受體熒光團的發(fā)射光譜，供體向受體的能量轉(zhuǎn)移以及受體的熒光表明信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸結(jié)合。在猝滅法中，將檢測器設(shè)置于供體熒光團的發(fā)射光譜，供體向受體的能量轉(zhuǎn)移以及供體光譜的猝滅表明信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸結(jié)合。本發(fā)明的嵌合型寡核苷酸包含與靶核酸序列的子序列雜交的第一靶向序列和與選自捕捉寡核苷酸或信號寡核苷酸的序列雜交的可捕捉序列。如上所述，不存在靶核酸序列時，該嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交并阻斷信號轉(zhuǎn)導。在一些實施方式中，該嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列擇優(yōu)與捕捉寡核苷酸雜交。這可能是因存在的嵌合型寡核苷酸濃度高于信號寡核苷酸所致，或者可修飾嵌合型寡核苷酸，從而使其與捕捉寡核苷酸雜交的親和力高于信號寡核苷酸的。對于靶序列而言，可捕捉序列通常是非天然的(即，外源性)核酸，但加入該靶向序列或與之相連。在本申請中應(yīng)該注意，"靶序列"可包括原始樣品靶序列，或衍生靶標，例如本文所述反應(yīng)的反應(yīng)物或產(chǎn)物；因此該靶序列可為OLA反應(yīng)中的第一連接探針或連接的探針、PCR產(chǎn)物等。可捕捉序列用作嵌合型寡核苷酸的獨特標識符(identifier)，從而成為靶序列的獨特標識符?？傊稍?，例如陣列上開發(fā)多組可捕捉序列和相應(yīng)的捕捉寡核苷酸以最大程度降低它們彼此間以及與反應(yīng)混合物中其它組分，包括耙序列和較大核酸序列中耙序列以外的序列(例如，基因組DNA中的序列)發(fā)生交叉雜交。美國申請公布號20030096239披露了一些可捕捉或"銜接頭(adapter)"序列。示范性可捕捉序列是符合以下標準的序列。它們未在基因組(優(yōu)選人基因組)中發(fā)現(xiàn)，它們不具有有害結(jié)構(gòu)，例如發(fā)夾環(huán)。此外，根據(jù)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可將可捕捉序列摻入嵌合型寡核苷酸的3'或5'端，或內(nèi)部位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可捕捉序列的長度可因所需的結(jié)合"強度"和所需的不同可捕捉序列數(shù)量而不同。在一些實施方式中，可捕捉序列一般長約6-約500個堿基對，通常是約8-約100，更常見是約10-約25個堿基對。在一些實施方式中，可捕捉序列唯一鑒別出能與靶向序列結(jié)合的靶序列。艮P，雖然可捕捉序列本身無需與靶序列結(jié)合，但該系統(tǒng)能通過檢測是否存在可捕捉序列來檢測靶序列。因此，隨后將對可捕捉序列的檢測用作存在靶序列的標志。分子生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知鑒定靶核酸序列的合適子序列的方法和算法，這些方法和算法廣泛使用。這些方法包括序列比對方法(Gotoh0.Multiplesequencealignment:algorithmsandapplications."序歹ij比對算法及應(yīng)用"Adv:Biophys.1999;36:1.59-206。LecompteO，ThompsonJD，Plewniak.:F，ThierryJ，Poch07Multiplealignmentofcompletesequences(MACS)inthepost-genomicera."后基因組時代的全長序列多重比對(MACS)"Gene.2001年5月30日；270(l,2):17-30)，點矩陣方法和數(shù)據(jù)庫檢索方法，例如局部序列比對基本檢索:I::具禾口FASTA程序(PearsonWR.FlexiblesequencesimilaritysearchingwiththeFASTA3programpackage."采用FASTA3程序包的柔性序列相似性檢索"MethodsMolBiol.2000;132:185-219;Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller,W.，Myers,E.W.和Lipman，D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool.""局部序列比對基本檢索工具"J.Mol.Biol.215:403-410)。靶核酸序列的子序列可以是核酸序列家族中的保守區(qū)域，或者可以是具體靶核酸序列中獨特的區(qū)域。設(shè)計能雜交靶核酸序列的子序列的靶向序列的方法也是熟知并廣泛使用的。在這點上，可參考Dieffenbach等，1995《PCR引物實驗室手冊》(PCRPrimer:ALaboratoryManual),CSHL出版社(CSHLpress),冷泉港，美國；Erlich，1989，《PCR技術(shù)DNA擴增的原理和應(yīng)用》(PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification),勢i，乇—克屯頁出版th(StocktonPress),纟丑纟勺；I皿is等，1990，《PCR方案方法與應(yīng)用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications),學術(shù)出版社(AcademicPress),紐約；Ellingboe等，1992，《PCR技術(shù)DNA測序》(ThePCRTechnique:DNASequencing),伊頓出版公司(EatonPublishingCo.)，內(nèi)蒂克，馬薩諸塞州；Bej等，1991，《生物化學禾卩分J'-卞物的E'il:綜述》(CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology),26:301-334;Hughes等，2001，Nat.Biotechnol.19:342-347;Kane等，2000，NucleicAcidsRes.28:4552-4557;Relogio等，2002，NucleicAcidsRes.30:e51;Wang等，2003，Bioinformatics19:796-802;Chen等，2002，BMCBioinformatics3:27;Hill等，2002，生物信息學和化學信息學目標紀要(ProceedingsofObjectsinBio-&Chem-Informatics),OMG目標管理組(OMGObjectManagementGroup),華盛頓，哥倫比亞特區(qū)(美國)，第39-44頁；Li等，2001，Bioinformatics17:1067-1076;Lipshutz等，1999，Nat.Genet.21:20-24;Nielsen等，2003，NucleicAcidsRes.3:1:3491-3496;Raddatz等，2001，Bioinformatics17:98-99;Rahmann，2003，JournalofBioinformaticsandComputationalBiology.1:343-361;Reymond等，2004，Bioinformatics20:27:1-273;Rimour等，2003，首屆健康網(wǎng)格大會紀耍(ProceedingsofthefirstHealthgridConference),里昂，法國，第88-96頁；Rouillard等，2002，Bioinformatics18:486-487;Rouillard等，2003，NucleicAcidsRes.31:3057-3062。耙向序列通常與靶核酸序列的子序列基本上互補。例如，如果靶核酸序列的子序列是A-G-T-A-C，T-G，則互補的靶向序列可以是T-C-A-T-G-A誦C。計算靶核酸序列的子序列和它們的互補序列的特性，并用于優(yōu)化靶序列的設(shè)計。所關(guān)注的特性包括但不限亍寡核苷酸長度(以堿基殘基計)、Tm和自身雜交的傾向性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知評估這些特性的算法，這些算法廣泛應(yīng)用?？梢詤⒖糐arman，2004，Bioinformatics20(10):1644-1645;Gibbs等，1997，J.Virol.Methods63(1-2):9-16;Gibbs等，1998，J.Virol.Methods,74(1):67-76;Antoniw，1995，MolBiotechnol4(2):111-119;LeGuyader等，1996，Arch.Virol.141(11):2225-2235;Chen等，1995，VimsRes.39(2-3):365-375;Wilson等，1993，J.Clin.Microbiol.323:1573-1580;Chen等，1989，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.57:19-24;Greigen等，1994，'l.Clin.Microbiol.32:335-351;Evertsson等，2000'APMIS108:385-392;Hryniewiecki等，2002，J.HeartValveDis.11:870-874;Rothman等，2002，J.Infect.Dis.186:1677-1681;McCabe等，1995，Pediatrics95:165-169;Lisby等，2002，Infect.Dis.Clin.NorthAm.16:393-412;Ley,1998，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.17:247-253。本發(fā)明的協(xié)作性寡核苷酸包含與選自以下的序列雜交的第二靶向序列靶核酸序列中與第一靶向序列所雜交的子序列不同的子序列；或靶核酸序列的互補鏈的子序列；或至少一條嵌合型寡核苷酸。在核酸處理反應(yīng)中，有靶核酸序列存在時，協(xié)作性寡核苷酸與嵌合型寡核苷酸協(xié)作形成反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明全文中，反應(yīng)產(chǎn)物包含第一鏈以及第二鏈，第一鏈包含至少一種嵌合型寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，第二鏈包含至少一種協(xié)作性寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，從而阻斷了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，進而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交。可采用任何合適的方法制備本發(fā)明方法所用的寡核苷酸，例如Nanmg等(1979，MethodsEnzymol.68:90)和美國專利4,356,270所述的磷酸三酯法?；蛘?，可采用Brown等(1979，MethodsEnzymol.68:109)所述的磷酸二酯法進行這種制備。還可采用以上方法的自動實施方式。例如，在一種這樣的自動實施方式中，將二乙基亞磷酰胺用作起始物質(zhì)，并如Beaucage等，(1981，TetrahedronLetters22:1859-1862)所述進行合成。還可參考美國專利4,458,066和4,500,707，該兩篇專利涉及在改性固體支持物上合成寡核苷酸的方法。還可能使用從生物學來源分離的寡核苷酸(例如，質(zhì)粒或噬菌體DNA的限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的變性鏈)。在一些實施方式中，根據(jù)美國專利5,424,186(Fodor等)所披露的方法合成寡核苷酸。該方法采用光刻印刷技術(shù)在基板表面的精確已知位置合成多種不同的寡核苷酸。或者，可采用基于PCR的方法，例如Antson等(2000，NucleicAcidResearch28(12):e58)所述的方法產(chǎn)生寡核苷酸。這些基于PCR的方法特別適用于產(chǎn)生較長，特別是長于100個核苷酸的寡核苷酸。在適于寡核苷酸彼此雜交或與靶核酸(包括DNA或RNA)雜交的條件下按照本發(fā)明方法雜交核酸。在這點上，可以參考，例如NUCLEICACIDHYBRIDIZATION,APRACTICALAPPROACH(《核酸雜交，一種實用方法》)(Homes和Higgins編)(IRL出版社(IRLpress),華盛頓，哥倫比亞特區(qū)，1985)。雜交是否發(fā)生通常受以.F因素的影響核酸長度、pH、溫度、一價和二價陽離子的濃度、核酸的雜交體形成區(qū)域中G和C的比例、介質(zhì)粘度和可能存在變性劑。這種變量也影響雜交所需的時間。因此，優(yōu)選條件取決亍具體的應(yīng)用。然而，可常規(guī)測定這些經(jīng)驗條件而無需過多實驗。在某些實施方式中，本發(fā)明方法采用高區(qū)分雜交條件。例如，可參考Wallace等(1979，Nucl.AcidsRes.6:3543)，他們描述了與含有一個內(nèi)部堿基對不匹配的相似寡核苷酸探針相比，區(qū)別完全匹配并與靶序列完全同源的11-17個堿基長的寡核苷酸探針雜交情況的條件。還可參考Wood等(1985，Proc.Natl.Acid.SciUSA82:1585)，他們描述了利用3M四甲基氯化銨的11-20個堿基長寡核苷酸的雜交條件，其中雜交體的解鏈溫度只取決于寡核苷酸探針的長度而無論其GC含B。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10個核苷酸長的寡聚物進行嚴格雜交的雜交條件，利用核苷酸類似物，例如(鎖定'(locked)核酸最易亍獲得相似的條件(Christensen等，2001BiochemJ354:481-4)。雜交反應(yīng)通常能在任選含有雜交優(yōu)化劑，例如等穩(wěn)定劑(isostabilizingagent)、變性劑和/或復性加速劑的雜交緩沖液存在下進行。等穩(wěn)定劑的例子包括但不限亍甜菜堿和低級四烷基銨鹽。變性劑是通過千擾雙鏈核酸中堿基之間的氫鍵或核酸分子的水合作用來降低雙鏈核酸分子解鏈溫度的組合物。變性劑包括但不限于甲酰胺、甲醛、二甲基亞砜、乙酸四乙酯、尿素、異硫氰酸胍、甘油和離液鹽。雜交加速劑包括核不均--核糖核蛋白(hnRP)Al和陽離亍洗滌劑，例如溴化十六垸基三甲銨(CTAB)和溴化十二垸基三甲銨(DTAB)、聚賴氨酸、精胺、亞精胺、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)、噬菌體T4基因32蛋白和乙酸銨與乙醇的混合物。還應(yīng)知道如果本發(fā)明核苷酸序列含有兩條鏈(例如，基因組DNA)或具有能阻礙寡核苷酸雜交和/或延伸(例如，RNA)的二級結(jié)構(gòu)，單獨或在合成延伸引物分子的同時分離核酸序列的鏈是理想的。可采用任何合適的變性方法，例如物理、化學或酶學方法實現(xiàn)這一鏈分離。分離多核苷酸序列各鏈的一種物理方法包括加熱該核酸序列直至其基本上完全(>99%)變性。常規(guī)熱變性可包括在約8(TC-105。C的溫度進行1-10分鐘。還可利用稱為解旋酶或酶RecA(具有解旋酶活性)的各類酶中的某種酶，在有已知能使DNA變性的核糖ATP(riboATP)(rATP)存在下誘導鏈分離。KuhnHoffmann-Berling(1978，CSH-QuantitativeBiology4363)描述了用解旋酶分離核酸各鏈的合適反應(yīng)條件，Radding(1982,Ann.Rev.Genetics16405-437)總結(jié)了利用RecA的技術(shù)?；蛘?，可通過，例如施加并使低壓電通過試樣來進行電變性(Purvis等，1996，第四屆國際生物傳感器大會(4thWorldCongressonBiosensors)，曼谷，第39頁，艾爾賽維高技術(shù)公司(ElsevierAdvancedTechnology),牛濰，該份文獻納入本文作為參考)，或用稀酸處理試樣(例如，用0.25MHCl處理7.5-10分鐘(Meinkoth和Wahl，1984，AnalBiochem.138267-284)。5./依據(jù)信號試劑的性質(zhì)，可通過目測或儀器方法檢測本發(fā)明信號寡核苷酸的可檢測信號。通過用光照射熒光標記并用熒光光度計檢測熒光；通過提供酶系統(tǒng)來產(chǎn)生可用分光光度計檢測的染料；或利用反射計檢測染料顆?；蛴猩哪z態(tài)金屬或非金屬顆粒；在利用放射性標記或化學發(fā)光分子的情況中，用輻射計數(shù)器或放射自顯影法來儀器檢測信號。因此，可用檢測裝置檢測或掃描與標記相關(guān)的光，所述光可以包括熒光、發(fā)光、聚焦光束或激光。在這種情況中，可利用電荷耦合器件(chargecoupledevice)(CCD)或光電池來掃描陣列中各位置的捕捉寡核苷酸/信號寡核苷酸雜交體發(fā)射的光，并用數(shù)字計算機S接記錄數(shù)據(jù)?；蛘?，如果捕捉寡核苷酸固定在微?；蛑樯?，則可用熒光活化細胞分選(FASC)技術(shù)檢測信號試劑。在一些情況中，儀器檢測憤號不是必需的。例如，如本文所述，利用與陣列形式(format)相關(guān)的膠態(tài)金屬顆?；蛎复佼a(chǎn)生的顏色斑點，冃測陣列能解讀陣列的模式。在一些實施方式中，固定捕捉寡核苷酸的固體表面還可與模式(pattem)識別設(shè)備和軟件聯(lián)用將信號模式從(例如)陣列轉(zhuǎn)化成明語遺傳分布(plainlanguagegeneticprofile)。在某些實施方式中，利用"芯片讀數(shù)計"檢測陣列上信號試劑產(chǎn)生的信號。例如，Pirrung等(美國專利5,143,854)描述了"芯片讀數(shù)計"可利用的檢測系統(tǒng)。芯片讀數(shù)計通常還可結(jié)合一些信號處理(方法)來確定具體陣列位置或元件的信號是真陽性或者可能是假信號。例如，F(xiàn)odor等(美國專利5，925,525灘述了示范性芯片讀數(shù)計。在具體的實施方式中，依據(jù)與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸的含量，本發(fā)明的可檢測信號不僅表明靶核酸序列的存在，還表明靶核酸序列的含量。在這點上，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法定量測定靶核酸序列，例如但不限于參考濃度己知的標準核酸樣品。還可通過納入陽性和陰性對照來幫助解讀本發(fā)明的可檢測信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定合適的對照。陽性對照可包括嵌合型寡核苷酸，該嵌合型寡核苷酸中包含具有對試樣中可能存在的序列(例如p-肌動蛋白序列)具有特異性的第一子序列。陰性對照可包括嵌合型寡核苷酸，該嵌合型寡核苷酸缺乏第一耙標特異性子序列或所具有的靶標特異性子序列基本上不與耙核酸序列雜交。6.試#本發(fā)明可用的合適試樣包括從任何生物獲得的單鏈或雙鏈核酸提取物，或它們的拷貝。提取物可以從生物的任何來源獲得，例如但不限于裂解物、細胞、組織或源自病毒、真菌、細菌、植物和動物的其它材料。可按照細胞裂解步驟制備核酸的樣品提取物(例如DNA或RNA)，所述步驟包括但不限于用SDS、滲透性沖擊、超聲波處理、異硫氰酸胍和溶菌酶處理來實現(xiàn)裂解。本發(fā)明可用的合適DNA包括基因組DNA或cDNA?？赏ㄟ^例如《最新分子生物學方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(Ausubel等編)(約翰威利父子有限公司(JohnWiley&Sons,Inc.)，1995)和《分子克隆實驗室手冊》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL)(Sambrook.等編)(冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress),.1.989)描述的多種常規(guī)使用的方法中的任何一種來制備這種DNA?？赏ㄟ^例如《最新分子生物學方法》(同上)、《分子克隆實驗室手冊》(同上)和Chomczynski和Sacchi(1987，Anal.Biochem.162:156)描述的任何合適方法制備RNA樣品提取物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，樣品提取物可包括任何數(shù)量的事物，包括但不限于體液(包括但不限于實際..匕任何生物的血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液和精液)；環(huán)境樣品(包括但不限于空氣、農(nóng)業(yè)、水和土壤樣品)；生物戰(zhàn)劑樣品；研究樣品；純化的樣品，例如純化的基因組DNA、RNA、蛋白質(zhì)等；原始樣品(細菌、病毒、基因組DNA等)。樣品還可包括樣品混合物，例如不同來源的兩種或多種樣品混合在一起。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，實際上可對樣品進行任何實驗操作。7.反座敘可在任何合適的反應(yīng)容器，包括試管、微孔、晶片(g卩，芯片)和微射流裝置中實施本發(fā)明的分析方法。在一些實施方式中，用捕捉寡核苷酸、嵌合型寡核苷酸、協(xié)作性寡核苷酸、信號寡核苷酸、反應(yīng)緩沖液、酶、信號試劑和核苷酸前體中的至少-種制造或預(yù)制容器。為實施本發(fā)明的分析方法而預(yù)先優(yōu)化了含量的反應(yīng)組分優(yōu)選以溶液或凍千形式包含在一個或多個反應(yīng)容器中。在該類型的示范性例子中，最終用戶簡單地將核酸樣品、核酸加工酶、嵌合型寡核苷酸和協(xié)作性寡核苷酸l::l:'的至少-種加入這種反應(yīng)容器中以實施測定。在一些實施方式中，將反應(yīng)容器置于可控熱(thermocontrollable)環(huán)境(例如熱循環(huán)儀、孵育箱等)中來執(zhí)行本發(fā)明分析方法的各步驟。在其它實施方式中，所述反應(yīng)容器能執(zhí)行這些分析方法中所用的一步或多步操作。這些操作包括但不限于混合；過濾；核酸提取；核酸純化；結(jié)合；洗脫；為進行雜交、核酸處理反應(yīng)(例如，PCR、LCR、OLA、RCR等)和使核酸雜交體變性而控熱；和檢測信號寡核苷酸。例如，美國專利申請公布2002/0115200、2002/0173032、2003/0008286和2005/0142565披露了該類型的示范性裝置。試縱可將按照本發(fā)明方法分析試樣中靶核酸序列所需的所有基本組分一起裝在試劑盒中。這些試劑盒任選裝有使觀察信號試劑可見化的合適組分、陽性和陰性對照、稀釋緩沖液等。還可裝有適合對核酸實施核酸處理反應(yīng)的組分。這些組分包括各種聚合酶，例如但不限于Tag聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA連接酶等(取決于所采用的核酸處理反應(yīng)技術(shù))，核苷酸前體和緩沖溶液。這種試劑盒還可裝有用于各組分的不同容器。在一些實施方式中，這些試劑盒裝有實施本發(fā)明方法的使用說明書。，在具體實施方式中，如章節(jié)7的實施例所述，本發(fā)明試劑盒中包含裝有固定有捕捉寡核苷酸并含有預(yù)先制備的試劑混合物(優(yōu)選凍干形式)的反應(yīng)容器。為使本發(fā)明便于理解與實施，借助以下非限制性實施例描述了特別優(yōu)選的實施方式。實施例實施例1RT-PCR檢測甲型流感病毒聚合酶基因區(qū)段PB2設(shè)計RT-PCR引物來擴增甲型流感病毒PB2區(qū)段的一部分。在許多位點使用肌苷或混合堿基，從而能擴增許多不同病毒的聚合酶基因。引物之一是嵌合型的，只要PCR引物的5'端含有可捕捉序列或"標簽"。本實施例中所用的可捕捉序列是5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'C[SEQIDNO:l]，在圖2中標記為B')，其是設(shè)計(思路)如美國專利6，027，884所述的一條序列?？墒褂迷诎行蛄?甲型流感病&)中未發(fā)現(xiàn)的任何其它可捕捉序列。嵌合型流感病毒正向引物Ch-PB2(1)F含有序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCAG(C/T)TCITC(C/T)TT(C/T)AG(C/T)TT(C/T)GG-3'[SEQII)NO:2]。流感病^反向引物PB2(2)R含有序列5'-AGTAT(T/C)CTCAT(T/C)CC(T/A)GANCC-3'[SEQIDNO:3]。這些引物所產(chǎn)生產(chǎn)物的預(yù)期大小約為1010bp。然而，這可能依據(jù)感興趣的樣品中存在的病毒而有所不同，因為分離物之間PB2編碼序列的長度可能略有不同(圖1)。詹辟微及脫.按照生產(chǎn)商的使用說明書，利用QIAGENRNA簡便提取試劑盒提取樣品(例如，羊水或臨床樣品)的病毒RNA。先加入600pL胍變性劑和6pL2-巰基乙醇以火活100樣品，再應(yīng)用QIAGEN提取方案。將提取的RNA重懸在50fiL不含RN:A.酶的水中(恰根，QIAGEN)。將2|iL重懸的RNA用于RT-PCR反應(yīng)。將約100皮摩爾捕捉寡核苷酸(圖2中標記為B)(間隔基團-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3';[SEQIDNO:4])結(jié)合在形狀適用于熱循環(huán)機器的試符的條帶或96-孔板的各孔上?？衫?'修飾基團(例如，在氨基和捕捉寡核苷酸的5'端之間含有(CH2)6"間隔"序歹U(或類似序列)的氣基)實現(xiàn)捕捉寡核苷酸與基質(zhì)的結(jié)合。或者，可將能以極高親和力非共價結(jié)合鏈靄親和素包被平板的5'生物素部分摻入捕捉寡核苷酸的一端。將信號寡核苷酸設(shè)計為含有與檢測部分(例如，乳膠微珠)偶聯(lián)的序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'([SEQIDNO:1]，圖2中標記為B")，將其加入用捕捉棼核苷酸預(yù)包被的微孔滴定板的各孔。信號寡核苷酸的加入量與固定的捕捉寡核作酸m大致相等?？赏ㄟ^滴定各試驗和各批試劑來憑經(jīng)驗確定要加入的捕捉裒核苷酸的精確量。定量,/定肺艦.已將PB2基因的986bp區(qū)段克隆入質(zhì)粒PCRTOP02.1(英杰公司(Invitrogen))中。該質(zhì)粒(本文稱為"對照質(zhì)粒")的序列與正向引物Ch-PB2(1)F和反向引物PB2(2)R的病毒序列互補部分互補?？衫脤φ召|(zhì)粒的連續(xù)稀釋液作為試驗的定量測定標準品和RT-PCR反應(yīng)的試劑對照。將每孔0-10,000皮摩爾的質(zhì)粒連續(xù)稀釋液可用作定量測定(標準品)和試劑對照。當每孔固定約ioo皮摩爾捕捉引物時，定量測定標準品的濃度范圍應(yīng)是每孔0-10納摩爾，包括每孔0、3、10、30、100、300、1000、3000和10,000皮摩爾，標準品的每種濃度使用一式兩孔。1.如下所示，給熱循環(huán)儀編程序，從而能在PCR擴增后立即進行cDNA合成cDNA合成1輪46°C30分鐘加上60°C10分鐘變性1輪94'C2分鐘PCR擴增8輪由以下步驟構(gòu)成的降溫(stepdown)PCR:94'C變性15秒在各輪連續(xù)的"降溫輪次"中，在56"C、54°C、52°C、50°C、48°C、46°C、44°C、42。C退火30秒68。C延伸75秒然后進行36輪94。C15秒(變性)4(TC30秒(退火)68°C75秒(延伸)最終延伸(任選的)l輪68"C5分鐘2.在冰上將以下物質(zhì)加入0.2mL不含核酸酶的薄壁PCR試管(其壁上預(yù)先結(jié)合了捕捉寡核苷酸)2X反應(yīng)混合物25(iL模板RNA2(iL或?qū)φ召|(zhì)粒的連續(xù)稀釋液(作為定量測定標準品)(2pL)有義引物Ch-PB2(1)F2nL(160皮摩爾)反義引物2pL(160皮摩爾)S叩erscriptIIIRT/鉬標簽混合物(SuperscriptIIIRT/PlatinumTaqMix)(英杰公司)22pL信號寡核苷酸(通過滴定預(yù)先測定的IOO皮摩爾或其它含量)以不含RNA酶的水加至50pL。3.輕柔混合并簡單離心以確保所有組分位于擴增試管的底部。將反應(yīng)平板或試管置于如上所述編程的預(yù)加熱熱循環(huán)儀中。4.隨著反應(yīng)進行，嵌合型流感病毒正向引物Ch-PB2(1)F5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCAG(C/T)TCITC(C/T)TT(C/T)AG(C/T)TT(C/T)GG-3'[SEQIDNO:2]摻入雙鏈PCR產(chǎn)物并被隔離，因而其不能與固定的捕捉寡核苷酸(間隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3';[SEQIDNO.4])和0',丄寡核苷酸之間的結(jié)合發(fā)生競爭。因此，各PCR輪次的"退火"階段的信號寡核苷酸結(jié)合量隨反應(yīng)進行而增加。將含有未知(物質(zhì))的試管/孔中的信號強度與為了獲得標準曲線而摻加了連續(xù)稀釋的質(zhì)粒標準品的試管/孔中的信號強度作比較。通過與標準曲線相比較，可以計算樣品中靶病毒序列的濃度。并非必須用個別的連續(xù)試管/孔來產(chǎn)生標準曲線。在后一情況中，可使用"內(nèi)標"，其中可使用只檢測標準RNA或質(zhì)粒的不同嵌合型引物和信號寡核苷酸配對，使含量己知的序列無關(guān)標準RNA或質(zhì)粒在同一反應(yīng)試管中與未知樣品共同擴增。然后可將未知樣品產(chǎn)生的信號量與同一試管中內(nèi)標RNA或質(zhì)粒產(chǎn)生的信號作比較?？稍赑CR反應(yīng)的全部輪次結(jié)束時檢測信號強度，或者用讀數(shù)裝置檢測每輪PCR反應(yīng)的信號強度。或者，在另一實施方式中，可將信號寡核苷酸連同除模板RNA以外的所有成分預(yù)先摻入(例如，通過凍干)反應(yīng)試管?？赏ㄟ^加水重建反應(yīng)混合物。實施例2"終點"檢測本實施例采用與擴增步驟相隔離的"終點"檢測步驟。如實施例1所述，將檢測試劑和信號試劑加入96孔板中，其中每孔固定有約100皮摩爾捕捉寡核苷酸?？刹蹲角逗闲蚏T-PCR引物如實施例1所示(Ch-PB2(l)F5'-CTTTAATCTCAAIDNO:2]。信號贏核苷酸如實施例1所示，但經(jīng)生物素化，其在檢測孔中的存在量與捕捉寡核昔酸的摩爾數(shù)相等(雖然這要對各種不同的分析物進行滴定)。RT-PCR引物與實施例1所用的那些相同。RT-PCR反應(yīng)如實施例1所述進行，但RT-PCR期間不包含捕捉寡核苷酸和信號寡核苷酸。納入連續(xù)稀釋的質(zhì)粒對照作為定量測定標準品。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物在94'C加熱5分鐘，然后用濕的冰猝滅，并轉(zhuǎn)移至檢測平板。隨著PCR反應(yīng)進行，嵌合型可捕捉PCR引物摻入雙鏈產(chǎn)物中，其與捕捉寡核苷酸競爭結(jié)合信號寡核苷酸的效率較低。反應(yīng)結(jié)束時PCR產(chǎn)物的含量越高，對結(jié)合信號寡核苷酸的競爭就越弱。37。C靜置20分鐘后，用每孔300pL的lXSSCpll7.2洗滌檢測平板三次，然后將PBS/0.1M吐溫/0.5MBSA配制的鏈霉親和素過氧化物酶偶聯(lián)物(羅氏目錄號腦9153)的1:10,000稀釋液加入孔中，37"C培育30分鐘，隨后用PBS/吐溫洗漆三次。翻轉(zhuǎn)排干各平板，再向各孔中加入底物。然后加入用100mM乙酸鈉/檸檬酸，pH4.9配制的0.42mMTMB(羅氏目錄號11484281001)、0.004%H202(v/v)。用2MH2S04終止反應(yīng)。所形成的產(chǎn)物首先是藍色的，反應(yīng)終止后呈黃色，可溶于水。以650nm為參比波長，用ELISA平板讀數(shù)計檢測450nm吸光度。實施例3連接酶依賴性反應(yīng)本示范性實施例所用的DNA是對照質(zhì)粒DNA，其含有甲型流感病毒PB2基因區(qū)段編碼區(qū)的雙鏈DNA拷貝。在該質(zhì)粒中，PB2基因的986bp區(qū)段已插入質(zhì)粒PCRT0P02.1(英杰公司)中。欽激遂絲樣微艦.將可連接的寡核苷酸設(shè)計成與甲型流感病毒中包括密碼子627(或甲型流感病毒的PB2序列中位點等價的數(shù)字位點)的區(qū)域互補。Ch-PB2U5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCTTGCAGCIGCICCACCIG-3'([SEQIDNO:5]，圖4中標記為B'匿Er)。PB2D-5'-AICAIAGIAGIATGCAGT-3'([SEQIDNO:6]，圖4中標記為E2')。上游嵌合型連接寡核苷酸中所用的可捕捉序列與實施例1所用的序列相同。出于示范性的目的，利用上述標準質(zhì)粒DNA作為靶標，使用熱穩(wěn)定的DNA連接酶進行連接酶依賴性反應(yīng)。擴增和檢測對照質(zhì)粒(上述)中甲型流感病毒的PB2區(qū)段一部分的過程如下所述(Belgrader等，1995，GeneticIdentityConferenceProceedings(《遺傳同一'性大會紀要》)，第六屆人類鑒定國際論壇SixthInternationalSymposiumonHumanIdentification白勺'改進'方去)將5等份質(zhì)粒稀釋在20LCR混合物中，該LCR混合物中含有50mMTris/HClpH8.5，50mMKCl，10mMMgCl2，1mMNAD+，lOmMDTT，LCR寡核苷酸組(50皮摩爾各引物，Ch-PB2U和PB2D)和10單位的T叫DNA連接酶。熱循環(huán)如下進行先進行1輪95"C2分鐘的變性，再進行20-25輪95"C30秒的變性和65"C4分鐘的連接。進行連接酶介導反應(yīng)步驟的反應(yīng)容器整合有包含專門設(shè)計的第二種協(xié)作性寡核苷酸(在圖4中標記為B2-E2)的檢測系統(tǒng)。對于檢測系統(tǒng)，將約50皮摩爾的捕捉寡核苷酸(間隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3')([SEQIDNO:4],圖4中標記為B)結(jié)合在形狀適用于熱循環(huán)機器的試管的條帶或96孔板的孔上。可利用5'修飾基團(例如，在氨基和捕捉寡核苷酸的5'端之間含有(CH^"間隔"序列(或類似序列)的氨基)實現(xiàn)捕捉寡核苷酸與孔的結(jié)合。或者，可將能以極高親和力非共價結(jié)"鏈裙親和素包被平板的5'生物素部分摻入捕捉寡核苷酸的一端。應(yīng)注意該連接酶介導的實施方式中，捕捉寡核苷酸的序列與實施例1所用捕捉寡核苷酸的相同。該序列與嵌合型連接寡核苷酸ChPB2U的非流感病毒序列互補部分互補。將信號寡核苷酸設(shè)計為含有與檢測部分(例如，乳膠珠)偶聯(lián)的序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'[SEQIDNO:1]，將其加入用捕捉寡核苷酸(間隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG國3')[SEQIDNO:4]預(yù)包被的微量滴定板的各孔。信號寡核苷酸的加入量與已固定的捕捉寡核苷酸量大致相等?？赏ㄟ^滴定各試驗和各批試劑來憑經(jīng)驗確定耍加入的捕捉寡核苷酸的精確量。遂接蘑分導游反應(yīng)包翁.-1.95'C2分鐘，使耙質(zhì)粒DNA變性。2.使嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列(Ch-PB2U)與靶核酸序列的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補。3.使第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列(PB2D)與靶核酸序列中毗連該第一子序列的第二子序列雜交以形成第二雜交體。4.在該第一子序列的5'核苷酸存在下，利用TaqDNA連接酶連接嵌合型寡核苷酸形和第一協(xié)作性寡核苷酸，形成第一雙鏈體，其包含該耙核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該嵌合型寡核苷酸和第一協(xié)作性寡核苷酸的連接產(chǎn)物。5.95'C使第一雙鏈體變性30秒來分開連接產(chǎn)物與靶核酸。6.使專門設(shè)計的第二種協(xié)作性寡核苷酸(圖4中的B2-E2)與嵌合型寡核苷酸及該連接產(chǎn)物的第一協(xié)作性序列部分雜交以形成反應(yīng)產(chǎn)物。該專門設(shè)計的第二種協(xié)作性寡核苷酸可以在連接酶介導的循環(huán)過程結(jié)束時加入，或者可以在該過程開始時即存在于反應(yīng)混合物中。7.以上形成的反應(yīng)產(chǎn)物隔開了第二協(xié)作性寡核苷酸(圖4中標記為B2-E2)中所含的阻斷性寡核苷酸序列。隔開阻斷序列使得信號寡核苷酸能與固定的捕捉寡核苷酸雜交，從而產(chǎn)生與靶序列含量定量相關(guān)的信號(通過乳膠微珠的局部濃度)。通過連接酶介導檢測過程從起始濃度己知的對照質(zhì)粒連續(xù)稀釋液產(chǎn)生標準曲線，將產(chǎn)生的信號與標準曲線作比較并評估未知樣品的起始濃度。實施例4滾環(huán)擴增反應(yīng)本實施例描述了包含密碼子627的流感病毒PB2基因區(qū)段某區(qū)域的檢測和定量測定。在本實施例中，將含有PB2基因區(qū)段的986bpDNA插入物的質(zhì)粒PCR-TOP02.1(英杰公司)用作靶標。美國專利5,854,033中描述了起始連接和RCA步驟的方案。1.97°C，將1納克-300納克的幾種質(zhì)粒連續(xù)稀釋液在不同塑料試管中加熱4分鐘使之變性，并在有5'磷酸化開環(huán)探針存在的連接條件下溫育，所述探針的5'和3'端分別與連接寡核苷酸CH-PB2U和PB2D的靶標特異性部分相同。95個核苷酸的開環(huán)協(xié)作性寡核苷酸與以下序列聯(lián)用5'-AICAIAGIAGIATGCAGTTCATAAGACTCGTCATGTCTCAGCAGCTTCTAACGGTCACTAATACGACTCACTATAGGTTGCAGCIGCICCACCIG-3'[SEQIDNO:7]。反應(yīng)混合物中T4DNA連接酶(新英格蘭生物實驗室公司(NewEnglandBiolabs))的濃度是每mL緩沖液5單位，所述緩沖液含有10mMTris-HCl(pH7.5)、0.20MNaCl、10mMMgCl2、2mMATP。開環(huán)探針的濃度是80nM。總反應(yīng)體積是40微升。37"C連接25分鐘。2.從各試管取25pL，與等體積的緩沖液混合，所述緩沖液中含有50mMTris-HC1(pH7.5)、10mMMgCl2、1mMDTT、400一各dTTP、dATP、dGTP、dCTP，還含有濃度為0.2nM，具有以'F序列的42堿基嵌合型滾環(huán)復制引物5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGCTGAGACATGACGAGTC-3'[SEQIDNO:8]。應(yīng)注意該序列的某區(qū)域是與實施例1中用于RT-PCR的可捕捉序列相同的可捕捉序列。不同的區(qū)域與開環(huán)協(xié)作性寡核苷酸[SEQIDNO:7]互補。3.加入(D29DNA聚合酶(160ng/50pL),30。C溫育反應(yīng)混合物30分鐘。4.向以上反應(yīng)混合物中加入與新合成的鏈互補的另一種協(xié)作性寡核苷酸，即反向引物。該引物的濃度是0.2pM，其序列是5'-AATACGACTCACTATAGG-3'[SEQIDNO:9]。反應(yīng)在3or再持續(xù)30分鐘，合成的第:::::::::鏈與最初與環(huán)化協(xié)作性寡核苷酸互補的序列反向互補并包含與SEQIDNO:8所示區(qū)域互補的序列(用作阻斷性序列)。5.各反應(yīng)試管含有與SEQIDNO:8所示區(qū)域(上述)互補的固定捕捉寡核苷酸[SEQIDNO:4]和與實施例l所用信號寡核苷酸相同的信號寡核苷酸。隨著第二鏈在步驟4中合成，合成了阻斷性序列，該序列隔開了SEQIDNO:8所示區(qū)域，使其與固定的捕捉寡核苷酸序列[SEQIDNO:4]和信號寡核苷酸之間的結(jié)合的競爭較小。隨著第二鏈產(chǎn)物數(shù)量累積，結(jié)合的信號寡核苷酸的數(shù)量增加。所產(chǎn)生的信號量與加入起始反應(yīng)者的質(zhì)粒用量成比例。6.在RCA的另一例子中，該方法與以前的例子相同，除了在反應(yīng)結(jié)束時進行檢測步驟和將25各反應(yīng)樣品轉(zhuǎn)移至微孔平板中的不同檢測孔中。用100皮摩爾捕捉寡核苷酸預(yù)包被檢測孔，這些孔中含有與生物素偶連的信號寡核苷酸(100皮摩爾)。然后用鏈霉親和素過氧化物酶(羅氏目錄號10891.53)和底物TMB(采用與上述實施例2相同的方法)檢測所結(jié)合的信號寡核苷酸濃度。實施例5終點"檢測II本實施例顯示了終點檢測步驟的另一實施方式。如實施例1所述，將檢測試劑和信號試劑加入96孔板中，其中每孔固定有約0.01皮摩爾捕捉寡核苷酸?？刹蹲角逗闲蚏T-PCR引物是5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGAIGTIAGIGAIACICAIGG-3'[SEQIDNO:10]。信號寡核苷酸如實施例1所示，但作FAM標記，其在檢測孔中的存在量與捕捉寡核苷酸的摩爾數(shù)大致相等(雖然各種不同分析物要滴定)。PCR.引物如以F的表格所列(PCR-標簽引物和PB2(2)反向引物)。如實施例1所示進行PCR反應(yīng)，但以200皮克cDNA作為耙標開始并省略了起始RT(反向轉(zhuǎn)錄)步驟。該反應(yīng)在PCR期間不包含捕捉寡核苷酸和信號寡核苷酸地進行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，如下段到所述處理反應(yīng)產(chǎn)物。隨著PCR反應(yīng)進行，嵌合型可捕捉PCR弓I物(PCR-標簽弓I物)摻入雙鏈產(chǎn)物中，其與捕捉寡核苷酸競爭結(jié)合信號寡核苷酸的效率較低。反應(yīng)結(jié)束時PCR產(chǎn)物的含量越高，結(jié)合信號寡核苷酸的競爭就越弱。檢測H7N7甲型流感病毒cDNA的具體反應(yīng)條件如下所示:DNA模板(H7N7甲型流感病毒cDNA)雄pgPCR-標簽引物5'誦CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGAIGTIAGIGAIACICAIGG-3'[SEQIDNO:10]0.5-1皮摩爾PB2(2)反向引物5，-AGTATYCTCATYCCWGAICC國3，[SEQIDNO:3]4皮摩爾dNTP0.2mMDNA聚合酶l個單位MgCl22mMPCR緩沖液IX加水達到終體積50PCR擴增后(35輪)，將PCR產(chǎn)物稀釋一倍。制備以下混合物抗-標簽(5'-生物素-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3'，[SEQIDNO:4])0.01皮摩爾標簽(5，-FAM-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'，[SEQIDNO:l])0.25皮摩爾*用水將抗-標簽和標簽的總體積補至50PCR產(chǎn)物50|iL將100反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移入鏈霉親和素平板的各孔中，37"C溫育40分鐘。倒掉平板中的混合物，用PBS洗滌4次。45向鏈霉親和素平板的各孔中加入用抗體稀釋劑(150mMTris-HCl，100mMNaCl，2%V/VFBS(胎牛血清)作1:1,000稀釋的100(15毫單位)過氧化物酶偶連的抗-FAM抗體，37"C溫育40分鐘。倒掉平板中的混合物，用PBS洗滌4次。向鏈霉親和素平板的各孔中加入100nLBM藍(羅氏)底物，室溫.F溫育5分鐘。將100H2S04加入鏈霉親和素平板的各孔，室溫下溫育10分鐘。檢測450nm的吸光度。如圖7所示，本項分析的結(jié)果表明采用終點檢測步驟，該試驗?zāi)莒`敏地檢測H7N7甲型流感病毒cDNA，相對于背景的信噪比良好。圖8顯示了測定上述試驗中PCR-標簽引物最佳用量的滴定實驗的結(jié)果。這些結(jié)果表明50中PCT-標簽引物的最佳用量約為0.5皮摩爾。瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色測定到采用該方法擴增的PCR產(chǎn)物具有預(yù)期大小(見圖9)。本文引用的每份專利、專利申請和出版物的內(nèi)容全文納入本文作為參考。本文引用任何參考文獻不應(yīng)理解為承認該參考文獻可用作本申請的"現(xiàn)有技術(shù)，，。說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，而不是將本發(fā)明限制于任一實施方式或具體的特征組合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，借鑒本文內(nèi)容可在所示例的具體實施方式中作出各種改進和改變而不脫離本發(fā)明的范圍。所有這些改進和改變應(yīng)屬于隨附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分析試樣中靶核酸序列的方法，該方法包括-在一反應(yīng)容器中合并(1)不與該靶核酸序列雜交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游離于溶液中)；(2)提供可檢測信號并與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸；(3)至少一種嵌合型寡核苷酸，其包含(a)與靶核酸序列的子序列雜交的第一靶向序列；和(b)與選自以下的序列雜交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信號寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一種協(xié)作性寡核苷酸，所述第二靶向序列與選自以下的序列雜交(a)靶核酸序列中與所述第一靶向序列雜交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互補鏈的子序列，或(c)至少一種嵌合型寡核苷酸；和(5)包含核酸的試樣；-使該反應(yīng)容器中的內(nèi)含物進行核酸處理反應(yīng)，如果試樣中存在靶核酸序列的話則形成反應(yīng)產(chǎn)物，其中如此形成的反應(yīng)產(chǎn)物包含第一鏈以及第二鏈，第一鏈包含至少一種嵌合型寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，第二鏈包含至少一種協(xié)作性寡核苷酸或其延伸產(chǎn)物，從而阻斷了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列與捕捉寡核苷酸雜交，進而使得信號寡核苷酸與捕捉寡核苷酸雜交；和-檢測信號寡核苷酸的可檢測信號，該信號表明試樣中靶核酸的存在或含量。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸處理反應(yīng)是聚合依賴性核酸處理反應(yīng)。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，其包括a)使嵌合型寡核苷酸的靶向序列與靶核酸序列雜交形成第一雜交體，其中該靶核酸序列以3'-5'方向延伸到該嵌合型寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，從而確定該靶核酸序列的非雜交部分；b)在聚合試劑和核苷酸前體存在下，使用該靶核酸序列的非雜交部分作為模板來延伸該第一雜交體的嵌合型寡核苷酸，從而形成了包含第一延伸產(chǎn)物和靶核酸序列的第一雙鏈體；C)使該第一雙鏈體變性以從第一延伸產(chǎn)物釋放耙核酸序列；d)使協(xié)作性寡核苷酸與第一延伸產(chǎn)物雜交，從而形成第二雜交體，其中該第一延伸產(chǎn)物以3'-5'方向延伸到該協(xié)作性寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，從而確定了該第一延伸產(chǎn)物的非雜交部分；和e)在聚合試劑和核苷酸前體存在下，使用該第一延伸產(chǎn)物作為模板來延伸該第二雜交體的協(xié)作性寡核苷酸，從而形成了包含該第一延伸產(chǎn)物和與該第一延伸產(chǎn)物互補的第二延伸產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟a)-e)重復一次或多次。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述聚合試劑是引物依賴性DNA聚合酶。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟b)中的聚合試劑是引物依賴性逆轉(zhuǎn)錄酶。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合依賴性核酸處理反應(yīng)包括i)使可環(huán)化的第一協(xié)作性寡核苷酸的第一靶向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交形成第一雜交體，其中該第一協(xié)作性寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；ii)使該第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列與該靶核酸序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第二子序列毗連該第一子序列；iii)在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一協(xié)作性寡核苷酸的第-一和第二靶向序列，形成的第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及環(huán)化形式的包含該第一協(xié)作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列的連接產(chǎn)物；iv)使該第一雙鏈體變性以從靶核酸釋放連接產(chǎn)物；v)使嵌合型寡核苷酸與連接產(chǎn)物雜交以形成第三雜交體；vi)在聚合試劑與核苷酸前體存在下，使用連接產(chǎn)物作為模板來延伸該第三雜交體的嵌合型寡核苷酸，從而形成第一延伸產(chǎn)物；Vh)使第二協(xié)作性寡核苷酸與該第一延伸產(chǎn)物雜交以形成第四雜交體，和viii)在聚合試劑與核苷酸前體存在下，使用該第一延伸產(chǎn)物作為模板來延伸該第四雜交體的第二協(xié)作性寡核苷酸，從而形成包含第一延伸產(chǎn)物和與該第一延伸產(chǎn)物互補的第二延伸產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸處理反應(yīng)是連接酶依賴性核酸處理反應(yīng)。9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其包括1.使嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；2.使第一協(xié)作性寡核苷酸的第二靶向序列與該耙核酸序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第二子序列毗連該第一子序列；3.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該嵌合型寡核苷酸與該第一協(xié)作性寡核苷酸，形成第一雙鏈體，所述第一雙鏈體包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該嵌合型寡核苷酸和該第一協(xié)作性寡核苷酸的連接產(chǎn)物；4.使該第一雙鏈體變性以從靶核酸釋放連接產(chǎn)物；和5.使第二協(xié)作性寡核苷酸與該連接產(chǎn)物的嵌合型寡核苷酸和第一協(xié)作性序列部分雜交以形成反應(yīng)產(chǎn)物。10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括a.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列與靶核酸序列的第一子序列雜交以形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸的3'寡核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補，并且可捕捉序列的5'核苷酸不可連接；b.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列與耙核酸序列中毗連該第一子序列的第二子序列雜交以形成第二雜交體，其中可捕捉序列的5'核苷酸不可連接；c.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一嵌合型寡核苷酸與該第二嵌合型寡核苷酸以形成第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該耙核酸序列的第-和第二子序列及同時包含該第一嵌合型寡核苷酸和該第二嵌合型寡核苷酸的連接產(chǎn)物；d.使該第一雙鏈體變性以從靶核酸釋放連接產(chǎn)物；和e.使協(xié)作性寡核苷酸與該連接產(chǎn)物的第一和第二嵌合型寡核苷酸雜交以形成反應(yīng)產(chǎn)物。11.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其包括i.使第一嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列與耙核酸序列的第一子序列雜交形成第一雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸包含能與捕捉寡核苷酸雜交的可捕捉序列，并且該第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸與該第一子序列的5'核苷酸互補；ii.使第二嵌合型寡核苷酸的第二耙向序列與耙核酸序列中毗連該第一子序列的第二子序列雜交形成第二雜交體，其中該第一嵌合型寡核苷酸包含能與信號寡核苷酸雜交的可捕捉序列；iii.在該第一子序列的5'核苷酸和連接試劑存在下，連接該第一嵌合型寡核苷酸與該第二嵌合型寡核苷酸以形成第一雙鏈體，該第一雙鏈體包含該靶核酸序列的第一和第二子序列及同時包含該第一嵌合型寡核苷酸和該第二嵌合型寡核苷酸的反應(yīng)產(chǎn)物；和iv.使該第一雙鏈體變性以從靶核酸釋放反應(yīng)產(chǎn)物。12.如權(quán)利要求9-11中任一項所述的方法，其特征在于，步驟l-5或a-e或i-iv重復一次或多次。13.—種試劑盒，其裝有(1)不與靶核酸序列雜交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游離于溶液中)；(2)提供可檢測信號并與捕捉寡核苷酸雜交的信號寡核苷酸；(3)至少一種嵌合型寡核苷酸，其包含(a)與靶核酸序列的子序列雜交的第一靶向序列；和(b)與選自以下的序列雜交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信號寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一種協(xié)作性寡核苷酸，所述第二靶向序列與選自以下的序列雜交(a)靶核酸序列中與所述第一靶向序列雜交的子序列不同的子序列；或(b)耙核酸序列的互補鏈的子序列，或(C)至少一種嵌合型寡核苷酸。14.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，其還裝有(5)—種或多種聚合試劑和/或連接試劑。15.如權(quán)利要求13或14所述的試劑盒，其特征在于，組分(l)-(5)中的任一種或多種采用凍干形式。16.如權(quán)利要求13或14所述的試劑盒，其特征在于，組分(l)-(5)中的任兩種或多種采用混合物形式。17.如權(quán)利要求13或14所述的試劑盒，其特征在于，組分(l)-(5)中的任兩種或多種裝在不同容器中。18.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在固體表面上。19.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在微?；蛑榈谋砻?。20.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在納米線的表面。21.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在反應(yīng)容器的表面。22.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，多個捕捉寡核苷酸以捕捉寡核苷酸陣列形式固定。23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于，所述陣列是固相陣列。24.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于，所述陣列是液相陣列。25.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，在反應(yīng)容器中提供組分(l)-(5)中的任一種或多種。26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其特征在于，所述組分以預(yù)先優(yōu)化以用來實施權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法的形式存在。27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，最終用戶向反應(yīng)容器中加入核酸樣品、核酸處理酶、嵌合型寡核苷酸和協(xié)作性寡核苷酸中的至少一種來全文摘要本發(fā)明披露了用寡核苷酸測定靶核酸序列存在的方法，所述寡核苷酸與核酸處理反應(yīng)相配合從而產(chǎn)生可檢測信號。在一些實施方式中，這些方法還有助于定量測定靶核酸序列。本發(fā)明還披露可用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101248191SQ200680030935公開日2008年8月20日申請日期2006年7月6日優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日發(fā)明者G·R·巴尼特,R·T·巴納德申請人:生物芯片創(chuàng)新控股有限公司