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      表達在酰胺化產(chǎn)物的制備中有用的酶的細胞系的制作方法

      文檔序號:432395閱讀:246來源:國知局

      專利名稱::表達在酰胺化產(chǎn)物的制備中有用的酶的細胞系的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及重組表達載體和細胞系,用于肽基甘氨酸a-酰胺化單加氧酶(PAM或a-AE)、或它的兩個催化結(jié)構(gòu)域之一的表達。本發(fā)明還涉及使用這種PAM(或其催化結(jié)構(gòu)域之一)來催化X-Gly向X-oc-羥基-Gly或X-NH2的轉(zhuǎn)化(X是具有羰基基團的肽或任何化合物,甘氨酸基團可以共價連接到所述羰基基團上)。本發(fā)明進一步涉及優(yōu)選的細胞系的制備。在某些實施方式中,利用了CHOK1宿主。在某些實施方式中,表達載體包括人類金屬硫蛋白1IA啟動子和/或SV40增強子。相關(guān)技術(shù)的說明許多人類激素、生長因子、細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、衍生的脂肪酸和其他重要的生物學(xué)化合物具有氨基酸或肽作為它們分子結(jié)構(gòu)的實質(zhì)部分。許多疾病主動地響應(yīng)來提高患者中這些生物學(xué)化合物的水平。治療有效量的這些生物學(xué)上相關(guān)的化合物可以以各種途徑施用給患者。因而,這些化合物的有效的、低成本生產(chǎn)過程是非常重要的。當(dāng)生物學(xué)化合物在用于口服遞送的劑型中制備時這是特別實在的,盡管相對于其他施用方式有較低的生物利用率,口服遞送是通常優(yōu)選的施用方式。哺乳動物細胞和其他真核生物可以進行某些翻譯后加工過程,而原核生物不能。某些原核生物,例如E.coli,被廣泛采用作為宿主用于通過重組DNA(rDNA)技術(shù)的哺乳動物蛋白生產(chǎn),因為它們可以容易地在分批發(fā)酵過程中生長并且因為它們在遺傳學(xué)上被良好地表征了。然而,許多哺乳動物蛋白需要某些類型的翻譯后加工。例如,如果這些蛋白通過E.coli的遺傳工程化來生產(chǎn),翻譯后加工通常必需使用復(fù)雜的、體外的化學(xué)操作來實現(xiàn),這些化學(xué)操作對于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用是成本上禁止性的。即使當(dāng)使用哺乳動物宿主重組地生產(chǎn)肽時,通常希望的是有效地生產(chǎn)前體,其僅在后來經(jīng)受進一步的修飾。這種進一步的加工的一種類型包括肽或蛋白的羧基末端氨基酸的特異性酰胺化。許多天然發(fā)生的激素和肽含有這種修飾,如果該蛋白將要是生物學(xué)活性的,其通常是必需的。一個實例是降血鈣素,非酰胺化脯氨酸殘基對天然形式的酰胺化脯氨酸的替換引起了生物學(xué)活性方面非常顯著的降低。對于完全活性需要翻譯后酰胺化的其他生物學(xué)肽包括但不限于生長激素釋放因子、其他降血釣素、降血4丐素基因相關(guān)的肽、分泌素、肽YY等等。為了最大效力需要酰胺化的許多重要的生物學(xué)蛋白的多肽序列可以通過例如遺傳工程技術(shù)來產(chǎn)生。然而,重要的和有時必需的羧基末端酰胺化通常必需在體外進行。希望的是在此時避免費錢的和麻煩的化學(xué)酰胺化技術(shù),因而希望的是利用酰胺化酶來進行特異性酰胺化。蛋白的羧基末端氨基酸的特異性酰胺化通常由a-酰胺化酶來催化。肽基甘氨酸a-酰胺化單加氧酶(PAM)催化肽底物向酰胺化肽產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是兩步的反應(yīng)。PAM具有兩個催化結(jié)構(gòu)域肽基甘氨酸a-羥基化單加氧酶(PHM)催化步驟1(底部向中間物的轉(zhuǎn)變),肽基甘氨酸a-羥基甘氨酸oc-酰胺化裂解酶(PAL)催化步驟2(中間物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變)。全長PAM是雙功能的并且催化兩個步驟。如果中間物與路易斯堿接觸,步驟2也可以非酶學(xué)地有效實現(xiàn)。在自然中,大約50%的肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)按上述方式通過PAM來酰胺化。PAM活性已經(jīng)在許多物種中認識到,在多樣性如大鼠、牛和蛙的物種之中,PAM傾向于具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。還已知的是PAM的功能、底物和輔助因子在物種間是類似的(通常是相同的)。底物是化合物,通常是肽,具有帶有游離羧基的甘氨酸殘基。PAM催化的酰胺化反應(yīng)是本領(lǐng)域公知的。例如,在美國專利6,103,495中詳細描述了一種,其中肽基甘氨酸cc-酰胺化單加氧酶被用于催化甘氨酸延伸的鮭魚降血《丐素前體成為在其C-末端酰胺化的真正的鮭魚降血鈣素(即,具有代替前體的C-末端甘氨酸的氨基基團)。PAM和表達PAM的細胞系的來源是本領(lǐng)域已知的。為了最好的成本效率,酰胺化肽的大規(guī)模PAM催化生產(chǎn)需要穩(wěn)定的高產(chǎn)PAM來源。另外,由于PAM經(jīng)常用于潛在的人類藥物產(chǎn)物的生產(chǎn),重要的是用于PAM生產(chǎn)的系統(tǒng)(PAM表達細胞系和細胞系生長的培養(yǎng)基)在PAM表達期間?I入盡可能少的混雜物。特別的關(guān)注是最小化哺乳動物蛋白質(zhì)的使用以避免可傳播的海綿狀腦病(TSE)的風(fēng)險。盡管如此,培養(yǎng)基中的哺乳動物蛋白質(zhì)生長因子(根據(jù)TSE的立場不希望的)可能在幫助PAM表達細胞系的存活和產(chǎn)物表達方面是有用的。因而,本領(lǐng)域需要PAM表達(或PHM表達)細胞系,其提供了強的表達并顯示了甚至在缺少哺乳動物蛋白質(zhì)的情況下的良好穩(wěn)定性和存活率,所述哺乳動物蛋白質(zhì)在其他情況下在培養(yǎng)基中是需要的。發(fā)明概述因而本發(fā)明的目的是提供PAM表達或PHM表達細胞,其足夠強壯以在培養(yǎng)基中具有良好存活率和良好表達產(chǎn)量,所述培養(yǎng)基基本上缺少在所述酶后期用于產(chǎn)物的生產(chǎn)(例如,酰胺化藥物產(chǎn)物的生產(chǎn))時是成問題的哺乳動物蛋白質(zhì)種類和其他混雜物。本發(fā)明的進一步的目的是提供PAM表達或PHM表達細胞,其本身不共表達顯著的不希望的混雜物。進一步的目的是提供PAM表達或PHM表達細胞,其提供了良好的表達產(chǎn)量。進一步的目的是提供在這種細胞中有用的表達載體。進一步的目的是提供轉(zhuǎn)染和選擇這種細胞的良好技術(shù)。進一步的目的是提供用于酶反應(yīng)的高活性和高純度的PAM或PHM,并因而提供良好的酶反應(yīng)和產(chǎn)生酰胺化產(chǎn)物。在此公開的發(fā)明提供了這些和其他目的。在一個實施方式中,本發(fā)明提供了用用于表達肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶的表達載體轉(zhuǎn)染的CH0K1細胞。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了具有編碼區(qū)的重組表達載體,所述編碼區(qū)帶有與控制區(qū)域可操作連接的編碼肽基甘氨酸a-酰胺化單加氧酶的核酸,所述控制區(qū)域包括核糖體結(jié)合位點、啟動子和所述啟動子上游的SV40增強子。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了具有編碼區(qū)的重組表達載體,所述編碼區(qū)帶有與控制區(qū)域可操作連接的編碼肽基甘氨酸a-酰胺化單加氧酶的核酸,所述控制區(qū)域包括核糖體結(jié)合位點和人類金屬硫蛋白IIA啟動子。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了制備用于肽基甘氨酸CX-酰胺化單加氧酶表達的細胞系的方法,所述方法包括步驟(A)在存在第一、第二和第三表達載體的情況下轉(zhuǎn)染潛在的宿主細胞,其中所述第一載體包括編碼第一可選擇標(biāo)記的編碼區(qū),其中所述第二載體包括編碼第二可選擇標(biāo)記的編碼區(qū),其中所述第三載體包括編碼肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶的編碼區(qū),其中所述第三載體與所述第一載體的濃度比是至少3:1,以及其中所述第三載體與所述第二載體的濃度比是至少3:1;(B)使產(chǎn)自步驟(A)的細胞經(jīng)歷選擇壓力來選擇用所述第一載體轉(zhuǎn)染了的細胞;(C)使產(chǎn)自步驟(B)的細胞經(jīng)歷選擇壓力來選擇用所述第二載體轉(zhuǎn)染了的細胞;(D)使產(chǎn)自步驟(C)的細胞經(jīng)歷有限稀釋并選擇表達肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶的細胞。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了細胞系UGL73-26/M。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了由細胞系UGL73-26/M表達的肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了在表達和分泌到培養(yǎng)基中之后純化肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶的方法,其中所述方法包括步驟(A)使不純的肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶樣品經(jīng)歷陰離子交換層析,其中洗脫是等濃度的;(B)使步驟(A)的洗脫物經(jīng)歷疏水性相互作用層析,其中不使用硫酸銨并且其中洗脫是等濃度的。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了用用于表達肽基甘氨酸oc-羥基化單加氧酶的表達載體轉(zhuǎn)染的CH0K1細胞。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了具有編碼區(qū)的重組表達載體,所述編碼區(qū)帶有與控制區(qū)域可操作連接的編碼肽基甘氨酸cx-羥基化單加氧酶的核酸,所述控制區(qū)域包括核糖體結(jié)合位點、啟動子和所述啟動子上游的SV40增強子。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了具有編碼區(qū)的重組表達載體,所述編碼區(qū)帶有與控制區(qū)域可操作連接的編碼肽基甘氨酸cc-羥基化單加氧酶的核酸,所述控制區(qū)域包括核糖體結(jié)合位點和人類金屬硫蛋白IIA啟動子。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了制備用于肽基甘氨酸oc-羥基化單加氧酶表達的細胞系的方法,所述方法包括步驟(A)在存在第一、第二和第三表達載體的情況下轉(zhuǎn)染潛在的宿主細胞,其中所述第一載體包括編碼第一可選擇標(biāo)記的編碼區(qū),其中所述第二載體包括編碼第二可選擇標(biāo)記的編碼區(qū),其中所述第三載體包括編碼肽基甘氨酸oc-羥基化單加氧酶的編碼區(qū),其中所述第三載體與所述第一載體的濃度比是至少3:1,以及其中所述第三載體與所述第二載體的濃度比是至少3:1;(B)使產(chǎn)自步驟(A)的細胞經(jīng)歷選擇壓力來選擇用所述第一載體轉(zhuǎn)染了的細胞;(C)使產(chǎn)自步驟(B)的細胞經(jīng)歷選擇壓力來選擇用所述第二載體轉(zhuǎn)染了的細胞;(D)使產(chǎn)自步驟(C)的細胞經(jīng)歷有限稀釋并選擇表達肽基甘氨酸cx-羥基化單加氧酶的細胞。在另一個實施方式中,本發(fā)明提供了在表達和分泌到培養(yǎng)基中之后純化肽基甘氨酸a-羥基化單加氧酶的方法,其中所述方法包括步驟(A)使不純的肽基甘氨酸oc-羥基化單加氧酶樣品進行陰離子交換層析,其中洗脫是等濃度的;(B)使步驟(A)的洗脫物經(jīng)歷疏水性相互作用層析,其中不使用硫酸銨并且其中洗脫是等濃度的。期望酶通過本發(fā)明的細胞和細胞系表達,在優(yōu)選的實施方式中,根據(jù)本發(fā)明的純化技術(shù)來純化。然后從前體開始在存在酶的情況下進行反應(yīng),所述前體具有處于游離酸形式并附著于羰基的甘氨酸殘基。反應(yīng)條件和輔助因子是本領(lǐng)域已知的。此處的實施例l和2顯示了典型的酰胺化反應(yīng)和酰胺化產(chǎn)物的純化。產(chǎn)生優(yōu)選的酰胺化產(chǎn)物。當(dāng)使用肽基a-羥基化單加氧酶時,中間產(chǎn)物需要使用路易斯堿或肽基oc-羥基甘氨酸oc-酰胺化裂解酶的進一步反應(yīng)來形成酰胺化產(chǎn)物。當(dāng)例如在此討論的那些的酶生產(chǎn)細胞系表達并分泌酶到培養(yǎng)基中時,可以跟隨一系列的步驟,在某些實施方式中,來純化所述酶。收獲步驟從細胞中分離條件培養(yǎng)基。首先的切向流動過濾(濃縮,滲濾)除去低分子量成分。主要使用陰離子交換層析步驟和疏水性相互作用層析步驟用于從蛋白混雜物和培養(yǎng)基成分的純化。在病毒過濾之前的最終的切向流動過濾、濃縮和緩沖液交換是在保存之前期望采用的。在此要求了改進的陰離子交換層析和疏水性相互作用層析。令人驚訝地發(fā)現(xiàn),盡管存在內(nèi)源的二氫葉酸還原酶基因,希望地穩(wěn)定的CHOKl細胞可以在本發(fā)明的環(huán)境中使用。內(nèi)源基因不顯著地干擾根據(jù)具有二氫葉酸還原酶基因的可選擇標(biāo)記的氨甲蝶呤選擇。如在此描述,在獨立的載體上與兩個可選一奪標(biāo)記共轉(zhuǎn)染PAM基因,被認為顯著提高在基因組的更期望的部分發(fā)生共擴增的機會。當(dāng)使用SV40增強子時,要理解的是該增強子可以與任何轉(zhuǎn)錄啟動子一同使用,包括但不限于SV40轉(zhuǎn)錄啟動子、在此討論的優(yōu)選的金屬硫蛋白IIA啟動子,等等。根據(jù)本發(fā)明表達和純化的肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶基本上沒有不希望的蛋白酶活性,并且適合于在此描述的有效的底物oc-酰胺化。在此討論的優(yōu)選的細胞系UGL73-26/M顯示了良好的長壽命長壽命分布型,因而被認為對于穩(wěn)定性非常重要的規(guī)模擴大特別有用。同樣地,在此討論的優(yōu)選的純化技術(shù)提供了可量的特征和顯著的產(chǎn)品純度。特別地,使用等濃度洗脫,其顯著地簡化了餾分收集。先有技術(shù)中硫酸銨連同疏水性相互作用層析的使用被期望地避免,引物硫酸銨可能引起酶的沉淀和鈍化。通過類推,預(yù)期的是在此描述的發(fā)明對于肽基甘氨酸cc-羥基化單加氧酶將是有益的,同樣它們對于肽基甘氨酸ot-酰胺化單加氧酶是有益的??梢越M合使用在此聲明的一種或多種優(yōu)先選擇。例如,而不是限制性的,優(yōu)選的啟動子可以與優(yōu)選的增強子和/或與優(yōu)選的宿主細胞一同使用。當(dāng)(A)PHM和(B)PAL或路易斯堿被用于代替PAM酰胺化時,PHM和PAL(當(dāng)4吏用時)可以以多種方式獲得。以下闡述了一些。P醒表達PAM基因的天然發(fā)生的形式,其在表達時僅含有PHM活性來自蛙的一種酶是天然發(fā)生的PHM酶。參見Mizunoetal(1986),"PeptideC-Terminala-AmidatingEnzymePurifiedtoHomogeneityFromXenopuslaevisSkin"BiochemBiophys.Res.Commun.,137(3)984-991,其后來被發(fā)現(xiàn)是PHM而不是全長PAM。參見Suzukietal(1990),EMBO9(13)4259-4265。全長PAM的表達和裂解特異性蛋白酶可以用于在PHM活性和PAL活性之間的位點、例如二堿裂解位點裂解PAM酶。然后可以通過純化獲得PHM催化結(jié)構(gòu)域。例如Ouafiketal,(1992)"TheMultifunctionalPeptidylglycineoc-AmidatingMonooxygenaseGene:Exon/IntronOrganizationofCatalytic,Processing,andRoutingDomains"MolecularEndocrinology6(10)1571-1584描述了大鼠衍生的PAM中兩個催化結(jié)構(gòu)域的位置,并注釋"在配對的堿性位點的內(nèi)蛋白水解裂解可以分離兩個催化結(jié)構(gòu)域"。還參見Eipperetal(1993),"Peptidylglycinea-AmidatingMonooxygenase:AMultifunctionalProteinWithCatalytic,Processing,andRoutingDomains"ProteinScience2,489-497.在PAM中引入終止密碼子或改變閱讀框的點突變可選擇的翻譯終止密碼子(TAA、TAG、TGA)可以引入來自任何物種的任何PAMcDNA的PAM兩個功能結(jié)構(gòu)域(PHM和PAL)之間,或在這個位置上的點突變可以被引入來改變閱讀框。重新工程化僅具有PHMcDNA的表達載體利用PCR,僅編碼PHM結(jié)構(gòu)域的截短的PAM基因可以;故合成,并插入到表達載體中啟動子或增強子/啟動子序列的下游。以下列出的是不同類型的PAM酶和其催化結(jié)構(gòu)域的其他參考文獻Mizuno,K.etal.,(1987)"CloningandsequenceofcDNAencodingapeptideC-terminalct-amidatingenzyme"fromXenopusLaevisBiochemBiophys.Res.Commun.,148(2)546-552.Ohsuye,K.,etal.,(1988)"CloningofacDNAencodinganewC-terminaloc-amidatingenzymehavingaputativemembrane-spanningdomain"fromXenopusLaevisBiochem.Biophys.Res.Commun.,150(3)1275-1281.Koljekar,A.S.,etal,(1997)"Peptidylglycinea-amidatinghydroxylatingmonooxygenase:activesiteresidues,disulfidelinkagesandtow-domainmodelofthecatalyticcore",Biochemistry36:13901-13909.Koljekar,AS.,etal.,(2002)"EssentialfeaturesofthecatalyticcoreofPeptidylglycinea勿droxyglycinea-amidatinglyase",Biochemistry,41:12384-12394.Bertelsen,A.H.,etal,(1990)"Cloningandcharacterizationoftwoalternativelysplicedrata-amidatingenzymecDNAsfromratmedullarythyroidcarcinoma",Arch.Biochem.Biophys.,279(1)87-96.JimenezN.,etal.,(2003)"Androgen-independentexpressionofadrenomedullinandpeptidylglycinea-amidatingmonooxygenaseinhumanprostaticcarcinoma",MolecularCarcinogenesis35:14-24.PAL表達PAL的天然發(fā)生形式在果蠅和腔腸動物(???中PAM的兩個催化結(jié)構(gòu)域由獨立的基因編碼。因而,當(dāng)放入表達載體的啟動子或增強子/啟動子序列下游時,編碼來自這些物種的PAL的基因可以被表達。參見Kolhekar,A.S.,etal.(1997)"NeuropeptideAmidationinDrosophila:SeparateGenesEncodetheTwoEnzymesCatalyzingAmidation'V.Neuroscience17(4):1363-1376.全長PAM的表達和裂解可以表達全長雙功能PAM,特異性蛋白酶位置處的裂解可以在PHM和PAL結(jié)構(gòu)域之間進行和/或在PHM結(jié)構(gòu)域內(nèi)進行來鈍化PHM。任何適合的特異性蛋白酶可以用于從PAL活性上分離PHM活性,例如,二堿裂解位置。PAL活性/蛋白可以被進一步純化。類似的操作和二堿裂解位點的定位如上連同獲得PHM被描述。重新工程化僅具有PALcDNA的表達載體利用PCR,僅編碼PAL結(jié)構(gòu)域的截短的PAM基因可以被合成,并插入到表達載體中啟動子或增強子/啟動子序列的下游。本發(fā)明的其他特征和益處將根據(jù)以下的參考附圖、圖表、表格等等的發(fā)明描述而變得更加明顯。附圖的簡要說明附圖1是pHS1的質(zhì)粒圖。附圖2是pUC8的質(zhì)粒圖。附圖3是pSV402MT的質(zhì)粒圖。附圖4是oc-AEcDNA基因序列的衍化。附圖5是pAE73的質(zhì)粒圖。附圖6是73-26懸浮適應(yīng)方案。附圖7是旋轉(zhuǎn)燒瓶中的溶解氧濃度和oc-AE生產(chǎn)力。附圖8是旋轉(zhuǎn)器體積對DO和cc-AE生產(chǎn)力的影響。附圖9是UGL73-26/M的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物pH值。附圖IO是沒有pH控制的攪拌的罐生物反應(yīng)器和旋轉(zhuǎn)燒瓶的pH值分布。附圖11是在攪拌的罐生物反應(yīng)器中pH值對UGL73-26/Ma-AE生產(chǎn)力的影響。附圖12是純化的PAM酶的SDSPAGE。附圖13是SDSPAGE凝膠的密度計掃描和峰面積百分比的計算。附圖14是a-AE生產(chǎn)的加工流程圖。附圖15是UGL73-26/M的接種方案。本發(fā)明的實施方式的詳細說明根據(jù)本發(fā)明的PAM表達細胞系(內(nèi)部稱為UGL73-26/MMWCB00)根據(jù)關(guān)于專利程序目的的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約在或約在2005年6月10日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC),10801UniversityBoulevard,ManassasVirginia,20110-2209,U.S.A.。ATCC登記號碼是PTA6784。這個保藏的細胞系服從于這個條約下頒布的細則,在條約要求的時間和條件下并且遵照條約簽署國的專利法和細則,樣品將成為可獲得的。例如,在基于本申請或要求其優(yōu)先權(quán)或進行參考的任何其他美國申請的美國專利授權(quán)時,關(guān)于保藏的材料的可獲得性的所有限制將不可撤銷地移動到布達佩斯條約或35U.S.C.§112所要求的程度。本發(fā)明的PAM表達載體的構(gòu)建在下文中詳細描述。在此處的質(zhì)粒圖中,標(biāo)記"a酰胺化酶"的區(qū)域(參見,例如附圖5,pAE73的質(zhì)粒圖)具有附加在此的SEQIDNO:l所列的核苷酸序列,并且編碼如附加在此的SEQIDNO:2所列的715個氨基酸的原始翻譯產(chǎn)物。該翻譯產(chǎn)物包括氨基酸1-25的信號肽、26-41的前區(qū)域以及42-715的成熟肽基甘氨酸a-酰胺化單加氧酶j艮據(jù)本發(fā)明表達和純化的大多數(shù)酶繼續(xù)包括前區(qū)域,并被證明是非常有效的。以下詳述的是優(yōu)選的PAM表達細胞系、它的發(fā)酵、加工開發(fā)、純化和使用的實例。如下文更詳細地討論的,PAM基因被克隆到pSV402MT表達載體中來創(chuàng)建PAM表達質(zhì)粒pAE73。用pAE73DNA轉(zhuǎn)染CHOKl細胞。在雙選擇過程和有限稀釋克隆之后,使用提高濃度的氨甲蝶呤進一步擴增CHO細胞系。粘附細胞系73-26轉(zhuǎn)變成無選擇、無血清懸浮培養(yǎng)物UGL73-26/M。在BioRelianceCorp.產(chǎn)生UGL73-26/MMCB和MWCB。MCB和MWCB都已經(jīng)被完全地表征,被認為對于在GMP設(shè)備中PAM的生產(chǎn)是可接受的。UGL73-26/M細胞系已經(jīng)適合于在攪拌的罐生物反應(yīng)器中生長。發(fā)酵開發(fā)導(dǎo)致限定了接種過程,其在旋轉(zhuǎn)燒瓶中處理14天。發(fā)酵/細胞培養(yǎng)階段是17天的過程。發(fā)酵過程的關(guān)鍵參數(shù)如下在第5、10和14天葡萄糖添加(2g/L),溶解氧濃度>70%,發(fā)酵的pH值達到它的天然調(diào)整點,無蛋白的、非動物來源的組織培養(yǎng)基,SigmaC5467,補充有谷氨酰胺到2mM的終濃度。對來自C5467條件CHO培養(yǎng)基的PAM開發(fā)了簡單和強大的下游純化過程。在純化后通常地實現(xiàn)純度的四倍提高和活性酶的40%總回收率。加工利用了常規(guī)的過濾系統(tǒng)和生物過程層析樹脂,其能夠規(guī)模擴大到工業(yè)水平。整個細胞培養(yǎng)發(fā)酵和下游的純化過程已經(jīng)擴大到10L中試工廠/工業(yè)水平。所描述的加工應(yīng)當(dāng)可經(jīng)受可驗證的生產(chǎn)過程用于大量PAM的生產(chǎn)。開發(fā)了CHO細胞系,其表達大量的PAM,UGL73-26/M。為UGL73-26/M開發(fā)的細胞培養(yǎng)過程處在非動物蛋白來源的培養(yǎng)基中。簡單的分批細胞培養(yǎng)過程是優(yōu)選的。純化方案的目標(biāo)是開發(fā)具有催化活性酶的良好產(chǎn)量的強大的和可擴大的過程。載體構(gòu)建用于產(chǎn)生細胞系的表達載體pAE73的創(chuàng)建基于Friedmanetal.Bio/Technology7:359-362(1989)的工作的結(jié)果。在這篇文獻描述的過程之后,我們著手創(chuàng)建pAE73表達載體用于測試。每個載體的主要成分是人類金屬硫蛋白IIA(hMTIIA)啟動子(位于pHSl,來自M.Karin)、SV40增強子(來自pSV40,ATCC)和在此描述的酰胺化酶基因。pAE73的書f生pHSl用于pAE73創(chuàng)建的起始質(zhì)粒是質(zhì)粒pHSl(附圖1),1990年2月來自UCSD的M.Karin的贈送。榮光將人類金屬硫蛋白IIA啟動子剪接到pUC8中(附圖2),在Dr.Karin的實驗室中得到pHSl。846bp的HindIII/BamHI片段克隆到pUC8多克隆位點(MCS)的HindIII-BamHI位置。產(chǎn)生的質(zhì)粒pHSl具有插入到多克隆位點中的人類金屬硫蛋白IIA啟動子。pSV401MT和pSV402MT通過在人類金屬硫蛋白啟動子上游插入SV40增強子將pHSl轉(zhuǎn)變成表達載體pSV401MT或pSV402MT(附圖3)。通過用HindIII消化pSV40質(zhì)粒DNA來制備SV40DNA片段。1167bp的HindIII片段克隆到pHSl的HindIII位點中。SV40增強子不對稱地位于HindIIIDNA片段內(nèi),因而將增強子放置為靠近或遠離hMTIIA啟動子。SV40增強子內(nèi)BglI位點相對于原始質(zhì)粒中l(wèi)acZ基因的取向決定了質(zhì)粒名稱。pSV401MT具有遠離hMTIIA啟動子的SV40增強子,pSV402MT具有靠近hMTIIA啟動子的SV40增強子。pSV402MT被選擇用于進一步的載體構(gòu)建。pAE73通過將a酰胺化酶基因(SEQIDNO:1)克隆到pSV402MT的BamHI位點來制備pAE73。在用Bgl1和BamHIDNA限制性內(nèi)切酶消化pAE64之后分離2870bpcc-AE基因片段。pAE64質(zhì)粒含有SV40啟動子/增強子下游的PAM基因,其被修飾以表達可溶的75kDaPAM蛋白。這種PAMDNA序列已經(jīng)用于另一個CHO表達細胞系UGLB3/Al-7來表達75kDaPAM蛋白。PAM基因序列的衍化在附圖4中示出。純化2870bp的DNA片段,片段的Bgl1末端用兩個互補的DNA寡核普酸片段(AE96/AE97)修飾,其將該片段的Bgl1末端轉(zhuǎn)變成新的BamHI末端。AE96(+)235'GATCCATCGATCGCACTAGTGCC3'AE97(-)165'ACTAGTGCGATCGATG3'修飾的PAMDNA片段克隆到表達載體pSV402MT的BamHI位點中。具有兩個BamHI末端的PAMDNA片l殳可以以正義或反義方向連接到表達載體中,因而PAM基因的取向由使用EcoRl對質(zhì)粒的限制性消化作圖來決定。PAM基因和表達載體中的EcoRl位點容許質(zhì)粒DNA的簡單分析。具有正確取向的PAM的質(zhì)粒被稱為pAE73,它的質(zhì)粒圖在附圖5中示出。oc酰胺化酶表達細胞系的創(chuàng)建轉(zhuǎn)染和克隆三種質(zhì)粒用于CHOKl細胞的轉(zhuǎn)化pAE73、pSV2neo和pSV2dhfr。使用質(zhì)粒pSV2neo和pSV2dhfr(都從ATCC獲得),因為轉(zhuǎn)染的細胞對這些質(zhì)粒的摻入容許容易地選擇轉(zhuǎn)化的細胞系。質(zhì)粒pSV2dhfr還是特別選擇的,因為SV40啟動子/dhfrDNA摻入CHO基因組中容許該基因和其他近端基因的選擇性擴增。要共同擴增的基因是質(zhì)粒pAE73中攜帶的a-酰胺化酶基因。通過質(zhì)粒DNA的磷酸釣沉淀來轉(zhuǎn)化CHOKl細胞。以pAE73:pSV2neo:pSV2dhfr的10:1:1比例將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中。將20jugpAE73添加到每個100mm平皿中。轉(zhuǎn)染后兩天,在含有250mg/LG418的培養(yǎng)基中在選擇壓力下生長細胞以僅容許轉(zhuǎn)化的細胞生存。這種培養(yǎng)基中的CHQ細胞生長將需要pSV2neo質(zhì)粒的穩(wěn)定摻入。一旦在G418選擇培養(yǎng)基中建立了穩(wěn)定的生長,氨甲蝶呤在轉(zhuǎn)染后27天添加到生長培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化的細胞的G418庫在含有100nM、500nM、1juM或5juM氨曱蝶呤和250mg/LG418的培養(yǎng)基中生長。兩周之后(轉(zhuǎn)染后六周)分離的細胞灶可以通過克隆圓筒從5pM氨曱蝶呤+G418培養(yǎng)基中生長的細胞中建立。通過這種方法進行嘗試來從二十五個灶建立細胞系,但是在轉(zhuǎn)染和這種技術(shù)之后生長的來自僅兩個灶的細胞被放棄。細胞在含有1iLlM氨曱蝶呤+G418的培養(yǎng)基中生長的同時開始有限的稀釋克隆,0.5細胞/孔。在較低濃度的氨曱蝶呤中生長的轉(zhuǎn)化細胞被放棄。開始有限稀釋克隆之后三周,將分離物轉(zhuǎn)移到24孔平板中,然后到100mm平皿中用于在2-3天內(nèi)擴展生長。CHOKl細胞的開始轉(zhuǎn)染后十周,建立了一個稱為73-26的分離物。該細胞系被低溫保存,并評估a酰胺化酶表達。73-26在此時是最好的生產(chǎn)細胞系之一,產(chǎn)生6953U/l()S個細胞/天。細胞系73-26的擴增73-26的原始克隆進行傳代來產(chǎn)生在含有1MM氨曱蝶呤+G418的培養(yǎng)基中維持的建立的細胞系。選擇pSV2dhfr質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染的目的不僅因為它提供了鑒定轉(zhuǎn)化細胞系的第二種選擇方法,還因為已經(jīng)廣泛地確定了當(dāng)細胞在高濃度的氨曱蝶呤中生長時dhfr迷你基被擴增。UmgeneLaboratories早先使用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞系的經(jīng)驗顯示,20-50pM的氨曱蝶呤是引發(fā)oc-酰胺化酶的最大生產(chǎn)所需的。(X-酰胺化酶細胞系73-26直接分開到含有1juM、20juM或50pM氨曱蝶呤的培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)基都含有G418作為選擇的第二方法。這種細胞系以各種時間間隔的a-酰胺化酶表達的發(fā)展在表1中示出。表1CHO細胞系73-26的擴增和表達<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>ND-未測定表l中是數(shù)據(jù)顯示,與早先開發(fā)的B3/Al-7細胞系的相比,在這種細胞系中a-酰胺化酶的提高的表達水平。cx-酰胺化酶基因和dhfr基因的共擴增通過細胞系表達更多酶和在提高的氨曱蝶呤濃度下繼續(xù)傳代培養(yǎng)的能力來顯現(xiàn)。在存在20mM或50juM氨甲蝶呤的情況下的細胞生長在3-4個月的選擇性擴增之后具有最好的表達水平。當(dāng)連續(xù)傳代培養(yǎng)數(shù)月之后,a-酰胺化酶的表達水平降低。這種細胞系的早期冷凍儲備物因此用于制備的懸浮適應(yīng)的細胞系。懸浮適應(yīng)的a-酰胺化酶表達細胞系73-26的表征開發(fā)這種細胞系的最終目標(biāo)是開發(fā)穩(wěn)定的而沒有氨曱蝶呤和G418的選擇壓力的一種過程。細胞系的另一種期望的性質(zhì)是它應(yīng)在懸浮培養(yǎng)物中生長到相對高的細胞密度。用于實現(xiàn)這些目標(biāo)的方法描述如下。懸浮適應(yīng)的、無選擇細胞系的制備無選擇懸浮適應(yīng)的細胞的制備需要UGL73-26粘附細胞斷除血清、氨曱蝶呤和G418。開發(fā)了多種prongattack,附圖5,來實現(xiàn)這個任務(wù);建立了基質(zhì)去除,最終目標(biāo)是添加盡可能少的在最終的細胞系上加倍的細胞數(shù)量。將早期的冷凍物,12/16/91的73-2620juM氨曱蝶呤細胞系解凍來建立懸浮適應(yīng)的無血清無選擇細胞系用于將來的開發(fā)研究。雖然50iuM氨曱蝶呤中的PAM活性有些高,重建活躍生長的73-2650nM細胞系的嘗試是不成功的。在開始懸浮適應(yīng)方案之前評定細胞系的cc-酰胺化酶生產(chǎn)力,表2。表273-2620juM的生產(chǎn)力細胞系ot-AE(U/l()6細胞/天)CH0K1B3/Al-773-26022,555446,625在使它適應(yīng)懸浮培養(yǎng)之前這個細胞系的PAM活性具有與B3/Al-7對照相比在每個細胞的基礎(chǔ)上高20倍的活性。對照細胞系和73-26兩者的酶活性是細胞系冷凍之前原始測試中觀察到的5-10倍12/16/91(表1)。如附圖6所示,產(chǎn)生了四種新的懸浮適應(yīng)的無血清細胞系。稱為73-26/K-N的細胞系在37天處理后一皮低溫保存。懸浮適應(yīng)的73-26的a-酰胺化酶產(chǎn)生來自新的73-26細胞系的存庫的細胞(73-26/K、73-26/L、73-26/M、73-26/N)被解凍并在旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長。在Ex-Cell301培養(yǎng)基中每周傳代細胞三次來維持細胞系。在周期性的間隔時,進行完全的培養(yǎng)基交換,以及通過a-AE分析評估的酶生產(chǎn)力24h評定。細胞系在培養(yǎng)中維持直至80天。前述細胞系B3/Al-7的半連續(xù)分批處理是40天的處理,我們選擇在這個操作的兩倍時長下評估細胞系產(chǎn)量穩(wěn)定性。這項研究的數(shù)據(jù)在表3中示出。在這個研究的過程中,在第22天和第40天終止細胞系73-26/L終止,所有其他細胞系在80天時期的結(jié)束時活躍地生長。表3懸浮適應(yīng)的細胞系73-26/K-N的酶生產(chǎn)力<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注對比的培養(yǎng)測試期的天數(shù)是15-22,40-47,60,70和80天的結(jié)果雖然在早期間隔、<40天時所有細胞系表達了比B3/Al-7顯著更多的a-酰胺化酶,在70天后僅73-26/M和73-26/N仍然產(chǎn)生大量的酶。選才奪UGL73-26/M用于進一步的開發(fā),因為它在80天時期中一致地產(chǎn)生更多的a-酰胺化酶。其他三種細胞系要么在80天測試期結(jié)束之前停止生長,要么它們的生產(chǎn)力/細胞/天在最后20天衰退消失。CHOKl、UGL73-26、UGL73-26/MMCB和UGL73-26/MMWCB00的預(yù)備庫、細胞庫表征研究對宿主細胞系(CH0K1)、祖細胞系(73-26)和UGL73-26/M種子庫進行表征研究。在2/4/98制備40小瓶UGL73-26/M種子庫。種子庫的每個小瓶含有90%Ex-Cell301/10%DMSO中的4x1()6個細胞/mL。進行的所有研究按照CHO細胞系需要的結(jié)果來評估,制成MCB和MWCB,參見表4。主細胞庫UGL73-26/M細胞系在BioRelianceCorp.制成。幾個118MCB小瓶用于細胞系的完全表征。UGL73-26/MMCB研究的所有結(jié)果符合CHO來源的細胞系并且對于傳染原是陰性的。在BioRelianceCorp.,UGL73-26/MMCB的小瓶用于產(chǎn)生238瓶廠家的工作細胞庫,UGL73-26/MMWCBOO。UGL73-26/MMWCBOO研究的所有結(jié)果符合CHO來源的細胞系并且對于傳染原是陰性的。表4CHO細胞表征研究的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表4續(xù)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表4續(xù)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>UGL73-26/M在旋轉(zhuǎn)燒瓶和攪拌罐生物反應(yīng)器中的過程開發(fā)研究由于初步實驗表明細胞系的生產(chǎn)力不能在許多世代上維持一致,研究了分批發(fā)酵方案。分批方案還提供了易于調(diào)度、容易的可擴大性和不太極端的批次失敗結(jié)果的益處。UGL73-26/M的發(fā)酵過程開發(fā)需要研究可能影響細胞系的細胞生產(chǎn)力的許多參數(shù)。以下詳述的發(fā)酵開發(fā)顯示了研究溶解氧(DO)、pH值和培養(yǎng)基添加物的關(guān)鍵性研究。沒有研究的發(fā)酵參數(shù)是轉(zhuǎn)子RPM和發(fā)酵溫度。溶解氧對ex-酰胺化酶表達的影響進行實驗來檢查旋轉(zhuǎn)燒瓶中CHO培養(yǎng)基的溶解氧濃度的影響。使用0.1x106個細胞/mL播種旋轉(zhuǎn)燒瓶。兩個旋轉(zhuǎn)燒瓶含有在250mLTechne旋轉(zhuǎn)燒瓶中的150mL的培養(yǎng)基,而第三個旋轉(zhuǎn)燒瓶含有250mL的培養(yǎng)基。對所有旋轉(zhuǎn)燒瓶進行溶解氧的每日測量。每天采集澄清的條件培養(yǎng)基的等分量,用于通過oc-AE分析評定a-AE生產(chǎn)力。兩種培養(yǎng)基用于這項研究中,低蛋白CHO培養(yǎng)基(C1707,Sigma-Aldnch)和無蛋白的CHO培養(yǎng)基(C5467,Sigma-Aldnch)。在兩種培養(yǎng)基中生長的UGL73-26/M的直接比較在附圖7中示出。兩種培養(yǎng)物中的溶解氧水平是顯著不同的。與在同體積的C5467培養(yǎng)基中生長的那些細胞相比,在150mLC1707中生長的細胞產(chǎn)生較少的總酶/mL。雖然培養(yǎng)基的初始溶解氧濃度是相同的,~80%DO,C5467培養(yǎng)基培養(yǎng)的溶解氧濃度從不低于50%。C1707培養(yǎng)物的DO含量到第9天低于50%,培養(yǎng)物的峰值活性是兩天后。這些數(shù)據(jù)表明,在DO含量/細胞生存力/cx-AE生產(chǎn)力之間可能存在相關(guān)性。還研究了旋轉(zhuǎn)器體積作為潛在的關(guān)鍵參數(shù)。由于旋轉(zhuǎn)燒瓶沒有維持值穩(wěn)定的溶解氧濃度下,培養(yǎng)物維持溶解氧的能力與培養(yǎng)物的表面體積比例相關(guān)。提高旋轉(zhuǎn)器的培養(yǎng)體積略微改變了表面體積比例。開始相同的培養(yǎng),只是一個旋轉(zhuǎn)器中的培養(yǎng)物體積是150mL(5467s),另一個是250mL(5467sa)。表面體積比例的改變對DO。/o和oc-AE生產(chǎn)力的影響在附圖8中示出。附圖8中顯示的數(shù)據(jù)顯示了,培養(yǎng)物的生產(chǎn)力大大地受到溶解的〇2的影響。無論溶解的02濃度是由于培養(yǎng)物的利用還是由于表面體積比例方面的差異的影響而降低;當(dāng)DO濃度低于50%時,在48-72h內(nèi)培養(yǎng)物停止表達更多的oc-酰胺化酶。在細胞最健康和最多產(chǎn)的培養(yǎng)階段,生物反應(yīng)器中溶解的02應(yīng)當(dāng)維持在70%來反映溶解氧濃度。培養(yǎng)基對a-酰胺化酶表達的影響作為設(shè)計以促進用于UGL73-26/M的最合適生長培養(yǎng)基選擇、或確定生物反應(yīng)器生長條件的研究的部分,使用兩種CHO培養(yǎng)基C1707和C5467(Sigma-Aldnch)開始許多旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)。確定了兩種培養(yǎng)基,C1707是具有添加到培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)鐵蛋白的低蛋白培養(yǎng)基,C5467無動物蛋白的培養(yǎng)基。當(dāng)購買時,兩種培養(yǎng)基都需要添加L-谷氨酰胺到2juM的終濃度。以下的表5列出了來自具有兩種培養(yǎng)基之一的旋轉(zhuǎn)燒瓶的大采樣的數(shù)據(jù)。表5C1707和C5467CHO培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)數(shù)據(jù)的概述培養(yǎng)基配方峰值酶活性(單位/mL)峰值活性的天數(shù)峰值細胞密度(106細胞/mL)峰值細胞密度的天數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表5中的數(shù)據(jù)顯示了在任一培養(yǎng)基中UGL73-26/M細胞系的酶生產(chǎn)力方面沒有實質(zhì)上的差異??紤]到在美國和歐盟的未來的監(jiān)管原則,SigmaCHO培養(yǎng)基C5467可能是更為被法規(guī)接受的培養(yǎng)基選擇,因為它不含動物來源的培養(yǎng)基成分。SigmaCHO培養(yǎng)基C5467是用于將來的研究的培養(yǎng)基選擇。葡萄糖對a-酰胺化酶表達的影響調(diào)查UGL73-26/M分批培養(yǎng)的營養(yǎng)狀況的研究揭示了開始培養(yǎng)后5天培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度是原始培養(yǎng)基的大約50%(2g/L)。作為將額外的葡萄糖添加到培養(yǎng)物的一系列旋轉(zhuǎn)燒瓶實驗,進行了葡萄糖補充對酶生產(chǎn)力的影響的徹底的研究。以特定時間間隔用2g/L葡萄糖補充旋轉(zhuǎn)燒瓶1到3次。葡萄糖添加對a-AE生產(chǎn)力的影響在表6中示出。表6葡萄糖補充-相對酶表達<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>取決于葡萄糖添加方式,向UGL73-26/M的分批培養(yǎng)物中添加葡萄糖提高了培養(yǎng)物的最大生產(chǎn)力大50%-100%。與未補充的對照物相比,在第5、10和15天補充葡萄糖的旋轉(zhuǎn)燒瓶看起來表達了最多的酶。這些培養(yǎng)物的平均相對生存力是對照物的195%。與補充三次的那些相比,其他補充的培養(yǎng)物僅僅是稍微地多產(chǎn)的(143-164%)。補充有額外的葡萄糖的所有培養(yǎng)物顯示了培養(yǎng)基中延遲的峰酶濃度。對于補充了葡萄糖的培養(yǎng)物在第17/18天觀察到峰值酶濃度,而在對照的未補充的培養(yǎng)物中在第13天,參見表7.pH值對a-酰胺化酶表達的影響條件培養(yǎng)基的pH值是過程變量之一,其可以在攪拌罐生物反應(yīng)器中控制,不能在旋轉(zhuǎn)燒瓶中解決。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中,隨著培養(yǎng)基成分被消費和細胞副產(chǎn)物產(chǎn)生,培養(yǎng)物的pH值容許降低。含有150mL(5467s)或250mL(5467sa)的UGL73-26/M的兩個250mL旋轉(zhuǎn)燒瓶的pH值分布型在以下附圖9中顯示。培養(yǎng)物的pH值在分批的第一部分期間降低,然后在培養(yǎng)的最后部分期間升高。pH值的降低可能是由于在培養(yǎng)開始時培養(yǎng)物中提高的乳酸濃度。在培養(yǎng)結(jié)束時pH值的提高是由于細胞將乳酸鹽作為碳源來同化。培養(yǎng)物的生產(chǎn)力不受pH降低的影響(附圖8)。將幾個(n=5)6-10L攪拌罐生物反應(yīng)器沒有pH值控制地運行來模擬旋轉(zhuǎn)燒瓶中的條件。攪拌罐生物反應(yīng)器中的CHO細胞生長在C5467培養(yǎng)基、70。/。DO和37。C中。生物反應(yīng)器中條件培養(yǎng)基的平均pH值分布類似于在兩個旋轉(zhuǎn)燒瓶中觀察到的,附圖10。生物反應(yīng)器中的溶解氧濃度維持在70%,溫度維持在37°C。除了如上所述沒有pH值控制的生物反應(yīng)器運行之外,運行了一系列的生物反應(yīng)器,其中反應(yīng)器的pH值被容許自由降低到設(shè)置的pH值點(7.0-7.4之間)。在到達期望的pH值的時候,將其維持在該pH值下持續(xù)整個發(fā)酵時間。攪拌罐生物反應(yīng)器中的CHO細胞生長在C5467培養(yǎng)基、70%DO和37。C中。pH值控制的維持對于攪拌罐生物反應(yīng)器中a-AE生產(chǎn)力的影響在附圖11中顯示。附圖11顯示了當(dāng)pH值設(shè)置點沒有開始時這些運行的生物反應(yīng)器中運行的每一天的平均a-AE活性。當(dāng)pH值處于設(shè)置點的0.5pH值單位之內(nèi)之后pH值設(shè)置點被設(shè)置時,來自獨立的運行的數(shù)據(jù)也在附圖11中顯示。在培養(yǎng)物pH值和酶活性之間存在清楚的相關(guān)性。在培養(yǎng)物開始的16天期間,對于所有的運行,沒有pH值設(shè)置點的生物反應(yīng)器運行的活性分布是優(yōu)越的。單獨的例外是pH值設(shè)置點為7.1的運行的分布型。差異可能因為培養(yǎng)物比另一個運行持續(xù)更久。平均的無pH值設(shè)置點研究的峰值a-AE活性在第16天是280,707單位/mL。pH值對活細胞密度沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。培養(yǎng)物生長到1.0-1.5x106個細胞每mL的峰值活細胞密度。在生物反應(yīng)器接種之后8到10天到達最大細胞密度。除了在pH值7.1運行的一個培養(yǎng)物之外pH值對細胞生存力沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在培養(yǎng)中細胞培養(yǎng)物生存力大于50%存活持續(xù)15天或更久。以pH值設(shè)置點7.1運行的一個生物反應(yīng)器在培養(yǎng)中維持了〉50%活細胞持續(xù)20天。UGL73-26/M的研究可開發(fā)發(fā)酵參數(shù)的概述在建立a-AE表達細胞系UGL73-26/M之后,進行了一系列實驗來確定OC-酰胺化酶的最佳表達的關(guān)鍵參數(shù)。確定的是,無動物蛋白的培養(yǎng)基(Sigma,C5467)支持了高水平的酶表達。CHO細胞可以作為分批培養(yǎng)在補充有2mM終濃度的L-谷氨酰胺的C5467培養(yǎng)基中生長。然而,培養(yǎng)需要D-葡萄糖補充以進一步促進培養(yǎng)物的生產(chǎn)力。最佳的葡萄糖補充是在第5、10和15天2g/L。生物反應(yīng)器的DO濃度應(yīng)當(dāng)維持在700/0,生物反應(yīng)器的pH值容許調(diào)整到一pH值,其是培養(yǎng)基的緩沖能力與CHO細胞對培養(yǎng)基成分的新陳代謝的函數(shù)。下游純化開發(fā)UGL73-26/M以下小節(jié)概述了我們對使用UGL73-26/M克隆生產(chǎn)的PAM的下游純化開發(fā)。僅僅代表性的實驗被包括在概述中,其提供了過程開發(fā)工作的邏輯進展。提供了每個步驟的簡要說明,其描述了該步驟在純化過程中的功能。使用SDS-PAGE(穩(wěn)定的蛋白和穩(wěn)定的單位)、PAM活性分析和Bradford蛋白分析來分析純化運行。在技術(shù)轉(zhuǎn)讓給Boonton,NJ中試系統(tǒng)(pilotfacility)廠之前或之后不久完成了所有的實-瞼。在此描述的方法用于工業(yè)PAM批次1330-D-1003、1330-D-1004、1330-D-1005、1330-D-1006、1330-1009和1330-1010。切向流動過濾NO.l(TFF1)步驟描述在層析之前利用TFF1步驟來濃縮和滲濾條件CHO細胞培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基被濃縮,通過滲濾來降低導(dǎo)電率以便于與陰離子交換柱結(jié)合。TFF1步驟采用裝備有再生纖維素PLCTK30kDa膜(Millipore)的Pdlicon2模塊。研究和開發(fā)這個步驟的初始研究集中于TFF是否是層析之前必需的。研究了通過用水稀釋來降低條件CHO培養(yǎng)基的導(dǎo)電率作為TFF的替代。在層析之前未能稀釋條件培養(yǎng)基導(dǎo)致在加載之后大部分的PAM活性存留于流通物中。降低條件培養(yǎng)基的導(dǎo)電率到大約5mS最小化了流通物中檢測的PAM活性的數(shù)量。然而,當(dāng)條件培養(yǎng)基直接加載到陰離子交換柱上時鑒定了兩個難題。一種培養(yǎng)基部分不可逆結(jié)合柱并引起樹脂的嚴(yán)重變色。另一種展現(xiàn)了巨大的UV吸光度特征的培養(yǎng)基成分與PAM活性在梯度洗脫之后共同洗脫。條件CHO細胞培養(yǎng)基(C5467)用水稀釋來降低導(dǎo)電率到大約5mS,并直接加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-100、pH8.0平衡的Q-SepharoseFF柱(Pharmacia)上。柱在60分鐘內(nèi)經(jīng)歷從100%A(50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH80)到68%B(50mMTRIS、475mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0)的線性梯度。在加載之后大的深色條帶立即出現(xiàn)在柱的頂部并在整個層析運行中保持。使用2MNaCl清洗柱并用l.OMNaOH消毒。清洗和消毒操作不能從柱上除去暗色帶。隨后,柱經(jīng)歷更嚴(yán)格的清洗操作。柱經(jīng)歷以下的清潔試劑系列0.5MNaOH、1MNaCl、0.1M乙酸、O.IM乙酸、1MNaCl和70%乙醇。測試的條件都沒能從柱上除去暗色帶(NEG:OOl:225-245)暗色帶被鑒定為金精三羧酸,在原始C5467培養(yǎng)基中存在的成分。用TRIS緩沖到pH8.0的金精三羧酸的6mg/L溶液(中等濃度)直接加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的Q-Sepha,FF柱上。在加載后有色條帶立即出現(xiàn)在柱頂部。該柱經(jīng)歷如上所述相同的梯度洗脫和清洗操作。在整個運行上金精三羧酸保持與陰離子交換柱結(jié)合(NEG:001:276-290)。在pH8.0下金精三羧酸容易在水溶液中聚合產(chǎn)生具有高電荷密度的大分子。帶負電的大分子似乎不可逆地結(jié)合到陰離子交換柱上,很像DNA。這種材料對柱的重復(fù)應(yīng)用可能降低加載能力,因而將消極地影響總體的柱壽命。第二種培養(yǎng)基成分被發(fā)現(xiàn)與PAM共洗脫。未調(diào)節(jié)的原始培養(yǎng)基直接加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的Q-SepharoseFF柱上。柱再次經(jīng)歷如上所述的相同的梯度洗脫條件。在一般洗脫酶的區(qū)域中觀察到大的UV峰(NEG:001:248-257)。從條件培養(yǎng)基純化的峰的SDS-PAGE分析揭示該材料是低分子量蛋白或非蛋白培養(yǎng)基成分(NEG:001:225-245)。C5467培養(yǎng)基含有蛋白水解物,這可以說明與酶峰一致的大的UV峰。兩種培養(yǎng)基成分,金精三羧酸和未鑒別的UV峰在層析之前通過TFF有效地除去。通過30kDa膜保留了酶(滯留物),低分子量培養(yǎng)基成分穿過了過濾器(滲透)。條件培養(yǎng)基被濃縮10倍,使用裝備有再生纖維素PLCTK30kDa膜(Millipore)的PelliconXL設(shè)備進行滲濾。用4-5倍體積的25mMTRIS、0.0005%TX-100pH7.0對材料滲濾到大約3mS的最終導(dǎo)電率。材料加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的Q-SepharoseFF柱上。柱經(jīng)歷如上所述的梯度洗脫。沒有觀察到樹脂的變色,沒有與酶共洗脫的大UV峰。產(chǎn)生的酶峰的回收%和比活性分別測定為47%和2.1x106U/mg(NEG:004:263-283)。研究了TFF步驟的各個階段的酶穩(wěn)定性。首先用50mMTRIS、0.001%TX-IOO、pH7.0滲濾條件培養(yǎng)基,隨后是5倍濃縮。分析滲濾和濃縮的樣品流出物的活性損失和降解。通過SDS-PAGE沒有觀察到降解,回收了大約95%的酶活性(NEG:008:245-251)。陰離子交換層析(Q-SepharoseFF)步驟說明陰離子交換(AEX)層析步驟提供了PAM從條件CHO細胞培養(yǎng)基的粗略純化。該步驟主要除去了高分子量蛋白。然而,某些低分子量蛋白也被除去,包括酶的截短形式。層析步驟通常提供了酶的2到3倍純化?;钚悦傅幕厥眨ァ闶?0-75%??赡艽嬖谟贑HO細胞的發(fā)酵之后的原料流中的DNA在這個階段的處理被有效地除去。研究和開發(fā)在開發(fā)Q-SepharoseFF步驟之前,我們簡單地研究了使用陽離子交換(CEX))的PAM純化。研究了有或沒有TFF步驟的CEX層析的使用。在采用pH5.0-6.0的流動相的SP550C(TosoHaas)柱上進純化。在每種情況下,產(chǎn)生不良的分辨和恢復(fù);在加載后的流通物中鑒定了大部分的酶活性(NEG:004:006-029和NEG:004:102-119)。由于酶在低pH值下潛在地缺乏穩(wěn)定性,沒有考慮降低流動相的pH值以便于結(jié)合。為此,放棄了CEX層析。在Q-SepharoseFF柱上研究了采用梯度洗脫的一系列AEX層析。所有Q-SepharoseFF純化在以180cm/hr操作的(1.1xi3.7cm)柱上進行。在純化開發(fā)早期,新鮮條件培養(yǎng)基的可用性是有限的;因而許多這些實驗使用冷凍/解凍材料進行。條件培養(yǎng)基通過TFF濃縮/滲濾,并施加到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的柱上。柱在60分鐘內(nèi)經(jīng)歷從100%A(50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0)到68%B(50mMTRIS、475mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0)的線性鹽梯度。還研究了在pH7.0或pH8.5下采用HEPES緩的酶比活性(NEG:004-139-156、NEG:005:119-132、NEG:009:009-022和NEG:009:024-038)。在許多情況下,酶活性擴大到整個梯度上,可能是差異糖基化的結(jié)果。隨著開發(fā)繼續(xù),在Q-SepharoseFF柱上研究了采用連續(xù)鹽步驟的分步洗脫方法。濃縮/滲濾的條件培養(yǎng)加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的柱上。柱經(jīng)歷使用175mMNaCl、225mMNaCl和275mMNaCl的連續(xù)分步洗脫。酶活性在175mM和225mM鹽步驟之間相等地分步,總體的回收%大約41。/。。SDS-PAGE的分析揭示了在175mM和225mMNaCl級分中75kDa酶的存在(NEG:005:198-211)。在兩個鹽步驟中的酶活性可能由于糖基化的差異或可能是保持了活性的酶的截短的形式。子交換實驗的其他部分。來自旋轉(zhuǎn)燒瓶00020S3的條件CHO培養(yǎng)基經(jīng)歷TFF,然后加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的Q-SepharoseFF上。使用單個鹽步驟50mMTRIS、225mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0從柱上洗脫酶。收集的峰的回收%和比活性值分別測定為34%%和1.9x106U/mg(NEG駕:021-033)。類似地,來自10L生物反應(yīng)器(00021BR,14天)的條件CHO培養(yǎng)基經(jīng)歷TFF,并使用單個225mMNaCl步驟在Q-Sepharose上純化。這個運行的回收%和比活性值分別測定為37%%和2.3x106U/mg(NEG:008:065畫075)。還研究了使用HEPES流動相的分步洗脫試圖改善活性酶的回收。進行了采用50mMHEPES、225mMNaCl、0.001%TX-100pH8.0作為洗脫緩沖液的雙份純化運行。來自10L生物反應(yīng)器運行的條件CHO培養(yǎng)基(Boonton中試系統(tǒng),運行NO.l,15天)用作這些純化運行的輸入材料。兩個純化運行的回收%和比活性值分別測定為大約60%和3.0x106U/mg(NEG:008:263-288)。HEPES流動相的使用似乎改善了酶的回收%和純度。研究了細胞生存力對Q-SepharoseFF純化的影響。比較了在14天和21天從10L生物反應(yīng)器運行(BOO101)收獲的條件CHO培養(yǎng)基的純化。測量了在14天和21天的細胞生存力,分別確定為95%和48%。來自14天和21天的條件CHO培養(yǎng)基經(jīng)歷TFF和使用50mMHEPES、225mMNaCl、0.001%TX-100、pH8.0作為分步洗脫緩沖液的Q-SepharoseFF純化。14天材料的純化產(chǎn)生49%的回收和2.15x106U/mg的比活性,而21天的運行提供了40%的回收和2.1x106U/mg(NEG:009:114畫125和NEG:009:149-166)。還使用來自12天和15天的10L生物反應(yīng)器運行(00107BR)的條件CHO培養(yǎng)基進行了純化。測量了在12天和15天的細胞生存力,分別確定為86%和80%。在每種情況下,使用50mMTRIS、225mMNaCl、0.001%TX-100、pH8.0從Q-SepharoseFF柱上洗脫酶。12天的材料產(chǎn)生了62%回收和1.9xl06U/mg的比活性,而15天的材料得到了54%的回收和4.3x106U/mg的比活性(NEG:009:195-203和NEG:009:227-236)??雌饋砑毎媪EX層析之后的酶的總體回收%和比活性沒有顯著影響。鑒定和研究了Q-SepharoseFF層析的關(guān)鍵參數(shù)以建立工作范圍。定義并研究了被設(shè)計以挑戰(zhàn)純化操作的情況以確定對酶的回收和純度的影響。使用不同的分步洗脫緩沖液50mMTRIS、250mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH7.8或50mMTRIS、200mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.2(低pH/高鹽和高pH/低鹽)比較了兩種Q-SepharoseFF純化運行。這些實驗的理論將使層析經(jīng)歷極端洗脫條件以確定工作范圍。來自10L生物反應(yīng)器運行(2132-D-1004)的TFF處理的條件CHO培養(yǎng)基用作純化的輸入。在低pH值/高鹽情況下,條件培養(yǎng)基加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO平衡的柱上。使用50mMTRIS、250mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH7.8從Q-SepharoseFF柱上洗脫酶。酶的回收%和比活性值分別為66。/o和2.0x106U/mg(NEG:010:151-161)。高pH值/低鹽情況中的條件培養(yǎng)基加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.2平衡的柱上,并用50mMTRIS、200mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.2洗脫。在這種情況下酶的回收%和比活性值分別為66%和2.4xl06U/mg(NEG:010:140-150)。根據(jù)這些數(shù)據(jù),Q-SepharoseFF柱可以在[7.8-8.2]的pH值范圍下操作,洗脫緩沖液中的氯化鈉濃度可以在200mM-250mMNaCl]之間變動。確定了Q-SepharoseFF柱的工作能力以幫助純化規(guī)模擴大到30L生物反應(yīng)器運行。以兩種方式確定柱的工作能力[酶單位/ml樹脂]和[mg蛋白/ml樹脂]。這些實驗的穿透被定義為在流通物和洗滌步驟中鑒定總共>10%的酶活性。經(jīng)歷了TFF的條件CHO培養(yǎng)基(100ml)(2132-D-1002)加載到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0平衡的Q-SepharoseFF柱上。條件培養(yǎng)基的酶活性和蛋白濃度分別測定為1.97x106U/mL和2.41mg/mL。AEX柱(MilliporeVantage-L,1.1x13.7cm)以180cm/小時的線速度操作。使用50mMTRIS、225mMNaCl、0.001%TX-IOO、pH8.0進行分步洗脫。在柱流通物和洗滌步驟中鑒定了低于1%的總酶活性。大約51%的酶單位在主峰中回收。根據(jù)13.0mL的柱體積,工作能力計算為[1.51x1()7u/mL樹月旨〗或n8.5mg蛋白/mL樹脂](NEG:010:081-092)。計劃進一步的實驗來確定Q-SepharoseFF步驟的真實加載能力。疏水性相互作用層析(Phenyl-SepharoseFF,低取代)步驟說明疏水性相互作用層析(HIC)步驟除去了AEX步驟后保留的大部分蛋白混雜物,并提供了額外2倍的純化。HIC之后的SDS-PAGE分析揭示了單個的主條帶,具有幾個小的低分子量混雜物。一般地,HIC之后活性酶的回收%是50-75%。研究和開發(fā)為產(chǎn)自B3/Al-7克隆的PAM開發(fā)的純化過程也利用HIC。采用含有硫酸銨的流動相來提高配體-蛋白相互作用。酶對含有硫酸銨的緩沖液的延長的暴露引起不可預(yù)見的沉淀和酶變性。研究了Hofmeister系列中的其他鹽,例如氯化鈉和檸檬酸鈉以最小化這些難題。首先研究了利用含有氯化鈉的流動相的反線性梯度。這些層析研究的輸入材料是TFF1輸出物或Q-SepharoseFF輸出物。研究了在開始的TFF步驟之后的直接HIC以試圖消除AEX步驟。一般地,用等體積的水隨后是等體積的20mMTRIS、4MNaClpH7.0來稀釋酶。在鹽添加之前用水稀釋降低了蛋白濃度,最小化由"鹽析"引起的沉淀的可能性。稀釋的材料加載到用10mMTRIS、2.0MNaCl、pH7.0平衡的Phenyl-SepharoseFF柱上。酶在68分鐘內(nèi)使用從100%A(10mMTRIS、2.0MNaCl、pH7.0)到100%B(10mMTRIS、pH7.0)的反線性梯度從柱上洗脫。一般地,活性酶的回收%是大約50%(NEG:005:170-185和NEG:005:212-226)。還研究了采用氯化鈉流動相的分步洗脫方法。經(jīng)歷TFF1或Q-SepharoseFF層析的酶使用等體積的水和隨后等體積的20mMTRIS、4MNaClpH7.0稀釋。稀釋的材料加載到用10mMTRIS、2MNaCl、pH7.0平衡的HIC柱上。柱用另外的平衡緩沖液洗滌,隨后用10mMTRIS、l.OMNaCl、pH7.0洗滌。使用10mMTRIS、400mMNaCl、pH7.0從柱上洗脫酶?;钚悦傅漠a(chǎn)量是合理的,但僅實現(xiàn)了勉強夠格的純化(NEG:008:034-046和NEG:008:135-148)。使用氯化鈉看起來不像使用硫酸銨的情況一樣引起"鹽析",然而在高濃度的氯化鈉中酶隨著時間變性。發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉在相對低的濃度下促進酶與HIC柱的結(jié)合。經(jīng)歷TFF的條件CHO培養(yǎng)^^用等體積的水隨后是等體積的20mMTRIS、1.0M檸檬酸鈉、pH7.0稀釋,并加載到用10mMTRIS、0.5M檸檬酸鈉、pH7.0平衡的Phenyl-SepharoseFF柱上。柱用另外的平衡緩沖液洗滌,隨后用10mMTRIS、pH7.0脫除。在柱流通物或洗滌級分中都沒有鑒定到酶活性。在10mMTRIS、pH7.0級分中鑒定到大約50%的酶活性(NEG:005:064-076)。使用低濃度的檸檬酸鈉重復(fù)這個實驗。在較低的鹽濃度下,酶用等體積的水隨后是等體積的20mMTRIS、0.6M檸檬酸鈉、pH7.0稀釋,之后加載到用10mMTRIS、300mM檸檬酸鈉、pH7.0平衡的HIC柱上。柱用另外的平衡緩沖液洗滌,隨后用10mMTRIS、pH7.0脫除。結(jié)果基本上相同于早先的運行;在流通物或洗滌級分中都沒有鑒定到活性(NEG細:203-213)。研究了使用檸檬酸鈉緩沖系統(tǒng)的梯度洗脫來幫助分步洗脫方法的開發(fā)。TFF輸出物用等體積的水隨后是等體積的20mMTRIS、0.6M檸檬酸鈉、pH7.0稀釋,之后加載到在10mMTRIS、300mM檸檬酸鈉、pH7.0中平4軒的柱上。柱在70分鐘內(nèi)經(jīng)歷從100%A(10mMTRIS、300mM檸檬酸鈉、pH7.0)到100%BUOmMTRIS、pH7.0)的反線性梯度。在靠近梯度的末端鑒定了酶活性的峰。在梯度的這個區(qū)域中也洗脫出其他蛋白混雜物,并擴展到10mMTRIS、pH7.0柱條帶(NEG:008:252-262)。檢查分步洗脫來實現(xiàn)酶和在10mMTRIS、pH7.0帶中洗脫的蛋白之間的更好分離。來自Q-SepharoseFF純化(IOL生物反應(yīng)器運行,00107BR,12天)的峰級分用等體積的水隨后是等體積的50mMTRIS、600mM檸檬酸鈉、pH7.0稀釋。稀釋的材料加載到用25mMTRIS、300mM檸檬酸鈉、pH7.0平衡的Phenyl-Sepharose柱上。柱用其他平衡緩沖液洗滌,隨后用25mMTRIS、75mM檸檬酸鈉、pH7.0第二次洗滌,用25mMTRIS、pH7.0脫除。在75mM檸檬酸鈉級分中鑒定到所有的酶活性?;厥眨ズ捅然钚杂嬎惴謩e為42。/。和2.0xl06U/mL(NEG:009:204-218)。使用這種方法在酶和其他蛋白混雜物之間實現(xiàn)了更好的分辨。直接跟隨TFF的HIC(無AEX步驟)被放棄,由于該步驟從粗原料流清除DNA的無效性。使用以上詳述的氯化鈉分步洗脫方法進行了四個HIC純化。這些運行的輸入物是在層析之前經(jīng)歷了TFF的B3/Al-7條件CHO培養(yǎng)基。此時我們的內(nèi)部DNA規(guī)格是〈10ng/mg蛋白。在每種情況下,HIC后在主酶峰中存在的殘余DNA的水平高于該規(guī)格6-10倍,從而使得單步驟HIC純化不能接受(NEG:006:137-159、NEG:006:176-187和NEG:006:192-200)。研究了HIC純化步驟的工作能力以幫助30L規(guī)模擴大努力。穿透被定義為在柱流通物或洗滌級分中〉10。/。的酶活性。來自生產(chǎn)運行1330-D-1003的Q-Sepharose輸出物(125mL,0.368mg/mL,710,563U/mL)用等體積的水隨后是等體積的50mMTRIS、0.6M檸檬酸鈉、pH7.0來稀釋。稀釋的材料加載到用25mMTRIS、300mM檸檬酸鈉、pH7.0平4軒的Phenyl-SepharoseFF柱(MilliporeVantage-L,1.1x15.8cm)柱上。柱以180cm/小時操作。柱用額外的平衡化緩沖液洗涂,用25mMTRIS、75mM檸檬酸鈉、pH7.0洗脫酶。在流通物或洗滌級分中沒有鑒定到酶活性。主峰含有大約75%的酶活性單位,比活性被計算為2.6x106U/mg。根據(jù)15.0mL的柱體積,工作能力被計算為5.92x106U/mL樹脂(NEG:010:111-124)。工作能力沒有按照[mg蛋白/mL樹脂]來報道,因為在AEX之后加載到柱上的蛋白是極其低的。計劃了其他研究來測定HIC步驟的真實加載能力。通過取消水稀釋并將操作流速從180cm/h提高到240cm/h,顯著地縮短了HIC單位操作的總體時間。最小化對檸檬酸鈉的暴露時間和在樹脂上經(jīng)歷的時間可以最終幫助降低活性酶的損失。來自1330-D-1003的Q-SepharoseFF輸出物用等體積的50mMTRIS、0.6M桿檬酸鈉、pH7.0稀釋,使用前面段落中描述的HIC分步洗脫方法來純化。主峰(25mMTRIS、75mM檸檬酸鈉、pH7.0)的回收%和比活性被分別計算為77%和2.4x106U/mg(NEG:010:125-139)。在用檸檬酸鹽稀釋期間或之后沒有觀察到蛋白沉淀,然而材料必需慢慢地稀釋以避免"鹽析"現(xiàn)象。通過修改流動相的鹽濃度來挑戰(zhàn)HIC方法以確定工作范圍。通過進行兩個不同的純化操作研究了對回收°/。和酶比活性的影響。在第一個運行中,加載和洗脫期間的檸檬酸鹽濃度^^皮降^0而在第二個運行中,加載期間的檸檬酸鹽濃度被降低而洗脫緩沖液中的檸檬酸鹽濃度被提高。來自10L生物反應(yīng)器運行的Q-SepharoseFF輸出物(133O-D-1005)用等體積的50mMTRIS、0.5M檸檬酸鈉、pH7.0稀釋并加載到用25mMTRIS、250mM檸檬酸鈉、pH7.0平衡的HIC柱上。用25mMTRIS、50mM檸檬酸鈉、pH7.0洗滌柱。在50mM檸檬酸鈉級分中鑒定到大約51%的酶活性,在流通物和洗滌級分中鑒定到低于1%。在主峰中的酶的比活性被計算為1.35xio6U/mg(NEG:010:175誦186)。在第二個HIC運行中,Q-SepharoseFF輸出物如上所述稀釋和加載,然而應(yīng)用25mMTRIS、100mM檸檬酸鈉、pH7.0作為洗脫緩沖液。在這種情況下,在100mM檸檬酸鈉級分中鑒定到50%的酶活性,在流通物和洗滌級分中鑒定到低于2%。在100mM檸檬酸鹽餾分中酶的比活性是2.5x106U/mg(NEG:010:163-174)。在第一個HIC運行中觀察到的更低的比活性表明提高洗脫緩沖液中的檸檬酸鹽濃度使得通常在脫除物中發(fā)現(xiàn)的其他蛋白與酶共洗脫,因而降低了最終純度。相比之下,提高洗脫緩沖液中的檸檬酸鹽濃度看起來不降低純度。根據(jù)這些數(shù)據(jù),洗脫緩沖液中的檸檬酸鈉濃度可以在75-100mM之間變動而不損害最終的純度。切向流動過濾N0.2(TFF2)步驟描述在病毒過濾之前利用TFF2來濃縮和滲濾Phenyl-SepharoseFF輸出物。HIC輸出物立即經(jīng)歷TFF以最小化在洗脫緩沖液(25mMTRIS、75mM檸檬酸鈉、pH7.0)中延長的保持產(chǎn)生的酶的鈍化。Phenyl-SepharoseFF輸出物濃縮大約3倍,滲濾以將酶置入適合的緩沖液用于病毒過濾和隨后的貯存。TFF2步驟采用制備有再生纖維素PLCTK30kDa膜(Millipore)的Pellicon2模塊。研究和開發(fā)首先為使用B3/Al-7克隆產(chǎn)生的PAM開發(fā)TFF2步驟。已經(jīng)顯示了在50mMTRIS、25mMNaCl、0.0005%TX-100、pH8.0中在各種條件下酶是穩(wěn)定的,為此,沒有嘗試其他R&D。來自C5467條件CHO培養(yǎng)基的代表性的小規(guī)模純化來自10L生物反應(yīng)器運行(00107BR,15天)的條件CHO細胞培養(yǎng)基(500mL)的樣品濃縮8倍并相對50mMTRIS、0.001%TX-IOO、pH8.0滲濾。大約三分之一的TFF輸出物使用如上所述的純化過程的規(guī)??s小的版本來純化(NEG:009:219-249)。純化數(shù)據(jù)在表8中概述。這個純化運行的步驟產(chǎn)量相對不良,酶的比活性實際上在HIC步驟之后降低。然而,SDS-PAGE分析揭示,在大約75kDa處總體的oc-酰胺化酶被純化成單一的主要條帶(附圖12,泳道10)。凝膠和密度測定法掃描(附圖13)清楚地表明酶是高純度的(近似純度67%),僅存在微小的低分子量混雜物。在許多純化緩沖液中酶隨著時間而鈍化;因而加工的執(zhí)行必需在這些步驟之間不延遲地進行。純化過程中的變異性是由于無活性酶的存在,其降低了總回收率和比活性。更重要地,純化和發(fā)酵開發(fā)同時地進行,其也可能說明了某些觀察到的變異性。隨后發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)規(guī)模下的步驟產(chǎn)量和比活性要好得多,或許是材料在過程之間移動更快和立即分析級分的結(jié)果。表8由UGL73-26/M條件CHO培養(yǎng)基進行PAN的小規(guī)模純化<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>PAM下游純化過程的相無述以下詳述了每個加工步驟的純化操作,其反映了在技術(shù)轉(zhuǎn)讓中給予中試系統(tǒng)的信息。來自代表性小規(guī)模純化允許的數(shù)據(jù),包括SDS-PAGE和密度測定掃描,被包括在表8和附圖11和12中。TFF1過程澄清的條件CHO培養(yǎng)基濃縮5倍并用50mMTRIS、0.001%TX-100、pH8.0滲濾直到達到4-6mS的最終導(dǎo)電率。整個過濾中穿膜壓力維持在<10psi。AEX過程通過TFF濃縮/滲濾的澄清的條件CHO細胞培養(yǎng)基施加到用50mMTRIS、120mMNaCl、0.001%TX-100、pH8.0平衡的(AmershamBiosciences)柱上。柱以180cm/hr操作,在280nm監(jiān)碎見UV吸光度。柱用額外的平衡化緩沖液洗滌,用50mMTRIS、225mMNaCl、pH8.0從柱上洗脫PAM。使用2.0MNaCl清洗柱并用l.OMNaOH消毒。在運行之間柱保存在10mMNaOH中。HIC過程Q-Sepharose輸出物用等體積的50mMTRIS、600mM檸檬酸鹽、pH7.0稀釋,加載到用25mMTRIS、300mM檸檬酸鹽、pH7.0平tf的(AmershamBiosciences)上。柱以240cm/hr操作,在280nm監(jiān)視UV吸光度。用25mMTRIS、300mM檸檬酸鹽、pH7.0洗滌柱,用25mMTRIS、75mM檸檬酸鹽、pH7.0從柱上洗脫PAM。分別用25mMTRIS、pH7.0以及1.0MNaOH清洗和消毒柱。在運行之間柱保存在10mMNaOH中。TFF2過程Phenyl-SepharoseFF輸出物首先濃縮大約3倍,用50mMTRIS、25mMNaCl、0.0005%TX-100、pH8.0滲濾,并進一步濃縮到適合的體積用于病毒過濾和保存。10L攪拌罐生物反應(yīng)器過程運行a-酰胺化酶的IOL發(fā)酵和純化過程的概述在幾個iol攪拌罐生物反應(yīng)器運行之后制備純化的cx-AE。產(chǎn)生cc-酰胺化酶的加工步驟是14天接種期、17天發(fā)酵期和2天的純化方案,在上文和附圖14中詳述。用于這些實驗的培養(yǎng)基是無蛋白CHO培養(yǎng)基C5467(Sigma-Aldrich)。來自這些運行的所有加工細節(jié)可以在適當(dāng)?shù)呐斡涗浿姓业?。加工流程圖附圖14說明了為使用UGL73-26/M克隆產(chǎn)生的cc-AE/PAM開發(fā)的最終加工步驟。階段1—接種為了制備用于10L攪拌罐生物反應(yīng)器的接種物,解凍UGL73-26/Mmwcboo的一個小瓶。移出來自冷凍瓶的細胞并放置在新鮮培養(yǎng)基中。細胞團重懸浮到新的培養(yǎng)基中并添加到含有C5467CHO培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶。在后來的14天期間,培養(yǎng)基擴大到含有400mL培養(yǎng)基加細胞的四個燒瓶中(參見接種方案,附圖15)。在接種階段2的結(jié)束時測試培養(yǎng)物的oc-AE表達。在第12天,平均酶活性濃度是>13,000U/mL,參見表9畫面C。每次修改接種培養(yǎng)物時進行培養(yǎng)物的細胞計數(shù)和細胞生存力。在這個階段培養(yǎng)物生存力一般大于95%,參見表9畫面A。在第14天接種培養(yǎng)物平均總活細胞計數(shù)是2.03x1q9個,參見表9畫面b。表9細胞培養(yǎng)統(tǒng)計-接種階段<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>畫面C<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>階段2_發(fā)酵在每個接種階段的完成時開始IOL生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器以lx1()S個細胞/mL在具有L-谷氨酰胺的原始無蛋白培養(yǎng)基(Sigma,C5467)中接種。在以下設(shè)置點設(shè)置生物反應(yīng)器參數(shù)溫度-37。C,PRM=60,pH=不維持pH設(shè)置點,容許pH值變化(在開始時,不容許pH值大于pH7.5),DO設(shè)置點是70。/oDO。原始培養(yǎng)基的溶解氧濃度是大于70%,生物反應(yīng)器的溶解氧濃度容許趨向于70%,然后維持在該設(shè)置點。在第5、10和14天用2g/L葡萄糖補充生物反應(yīng)器。在第17天收獲條件培養(yǎng)基。收獲物收獲物材料通過MilliporeOpticap過濾器澄清。在第18天而不是第17天收獲前兩個以下描述的發(fā)酵物2131-D-1003和2131-D-1004。在第10天和17/18天達到并維持培養(yǎng)物的最大細胞密度。這些發(fā)酵的平均最大細胞密度是1.5-1.6x1()S個細胞/mL,表10畫面B。培養(yǎng)的開始14天培養(yǎng)物的生存力是>80%,在收獲的當(dāng)天平均生存力是76.0%,表10畫面A。在第17/18天收獲時評估培養(yǎng)物的生產(chǎn)力。澄清的收獲物平均含有378,567單位oc-AE/mL,表10畫面C。參io細胞培養(yǎng)統(tǒng)計-發(fā)酵階段畫面A<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>畫面B<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>畫面c<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>階段3-純化如以上詳述的,純化過程有5個不同的步驟。相對50mMTRIS、0.001%TX-100、pH8.0濃縮和滲濾澄清的收獲物。酶材料被平均濃縮大約4倍(數(shù)據(jù)未顯示,參見批次記錄)。這種加工材料施加到Q-Sepharose柱上,在NaCl分步梯度之后在含有225mMNaCl的50mMTRIS、0.001%Triton緩沖液中洗脫。酶溶液用50mMTRIS、600mM檸檬酸鹽、pH7.0稀釋并施加到phenylsepharose柱上。在檸檬酸鹽分步梯度之后從柱上洗脫oc-酰胺化酶。酶材料濃縮到大約1L的最終容積。經(jīng)過除病毒過濾加工四組六批次的酶。兩個批次通過MilliporeNFP過濾器處理(1330-D-1005和1330-D-1006),兩個批次通過PallTrincorDV50過濾器處理(1330-1009和1330-1010)。來自每個加工步驟的數(shù)據(jù)在以下的表11中示出。第一步驟TFF1對于cc-酰胺化酶活性單位保留是幾乎定量的步驟。來自10L生物反應(yīng)器運行的TFF濃縮物具有1.60x1(^單位/mg蛋白的平均比活性,表11。施加到Q-Sepharose層析柱的TFF1濃縮物在大約3L中從柱上洗脫。這個加工步驟中酶的比活性提高大約2倍到3.33x106單位/mg。Q-sepharose洗脫物的蛋白濃度和酶活性濃度是非常一致的,參見表ll。在phenyl-sepharose層析之后,酶的平均比活性從3.33x106提高到4.96x1()6單位/mg蛋白。phenyl-sepharose洗脫物使用第二TFF步驟濃縮到1L。在這個濃縮步驟之后比活性沒有改變,表11。來自某些酶批次的TFF2濃縮物施加到除病毒過濾器上。4個酶批次的3個的比活性降低,表ll。最終純化的酶的平均比活性降低350,000單位/mg到4.61x1(^單位/mg蛋白。比活性的降低可能是由于酶的某些部分的鈍化。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表ll續(xù)PhenylSepharoseFF<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>TFF2<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表ll續(xù)病毒過濾<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>說明純化過程的每個步驟的相容性的數(shù)據(jù)是重要的。然而,也重要的是每個加工步驟下期望的產(chǎn)物的回收率。表12顯示了cc-酰胺化酶純化過程的每個步驟的回收率和四或五個加工步驟之后加工的總回收率。表12顯示了酶從每個TFF步驟定量地回收。層析步驟Q-sepharose和phenylsepharose的平均回收百分比分別是65.3%和72.0%。測試的除病毒過濾器都回收了~80%的oc-AE活性。通過TFF2或病毒過濾從澄清的收獲物材料從酶純化過程的總回收率分別是40.8%或38.8%。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>結(jié)論已經(jīng)開發(fā)了穩(wěn)定良好表征的CHO細胞系UGL73-26/M,其表達高水平的oc-AE活性。在17天分批發(fā)酵過程中實現(xiàn)了高水平的酶表達,其利用了非動物來源、含低蛋白的組織培養(yǎng)基C5467(Sigma)。研究并優(yōu)化了關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)例如pH值、DO和葡萄糖濃度。還已經(jīng)開發(fā)了強大的兩步下游的純化過程,其能夠?qū)⒚讣兓浇咏鼊蛸|(zhì)。發(fā)酵和純化過程的一致性很好地適合規(guī)模擴大到工業(yè)水平。以下闡述實例,顯示了使用通過本發(fā)明的細胞表達的PAM生產(chǎn)酰胺化的產(chǎn)品。實施例1:利用肽基甘氨酸oc-酰胺化單加氧酶將甘氨酸延長的曱狀旁腺激素片段轉(zhuǎn)變成酰胺化對應(yīng)物。利用丙酮酸的rhPTH(1-34)Gly35-OH的酰胺化用于rhPTH(1-34)Gly35-OH的酰胺化的成分和終濃度在表12中顯示。隨后是酰胺化的簡要說明。表12rhPTH(1.34)Gly35-OH的a酰胺化<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在1,900mL25mMMES、200mMNaCl、pH6.0中的大約12.4克rhPTH(l-34)Gly35-OH裝到備有攪拌器和氣體起泡器的玻璃容器中。向這種溶液中按順序添加以下成分3,025mL水、741mL250mMMES、pH6.3、1.03mL3mM硫酸銅、124mL碘化鉀、62mL190強度的乙醇、124mL400mM丙酮酸鈉和124mL100mM抗壞血酸鈉。反應(yīng)容器放入水浴中,反應(yīng)混合物攪拌加熱到25-27°C。用21mL的2MHC1將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)到5.8。啟動氧噴射調(diào)節(jié)噴射速度以避免反應(yīng)混合物的過多泡沫。添加47mL的PAM,反應(yīng)混合物在25-27°C孵育4小時35分鐘(氧噴射在整個孵育期進行)。用74mL的2MHC1將反應(yīng)混合物酸化到pH2.4。用于這個實施例的PAM酶從本發(fā)明的優(yōu)選的CHOKl細胞表達,其是如上所描述的構(gòu)建的,在此被稱為UGL73-26/M。這種細胞系也用于提供上文討論的ACTT保藏。甘氨酸延長的前體可以從已知的來源獲得,或可以按已知的方法產(chǎn)生。例如,通過以類似于美國專利6,103,495(其實施例1-2)描述的方式發(fā)酵來產(chǎn)生,和在酰胺化之前如美國專利6,103,495(其實施例3)描述的來純化。在如上所述的當(dāng)前的酰胺化中使用的特定前體由2005年3月9日提交的同待決美國專利申請系列號NO.11/076,260、2005年10月6日作為發(fā)明者A·P·康薩爾沃,D·A·米勒,N·M·梅塔申請人:尤尼基因?qū)嶒炇夜?
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