專(zhuān)利名稱(chēng)：Zo－1基因啟動(dòng)子區(qū)dna甲基化檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的甲基化引物對(duì)，進(jìn)一步包括非甲基化引物對(duì)，同時(shí)，本發(fā)明還涉及含有所述引物對(duì)的試劑盒。
背景技術(shù)：
白血病是一種造血系統(tǒng)惡性疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，早期診斷與治療至關(guān)重要，治療后殘留的白血病細(xì)胞是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)及死亡的根源。當(dāng)前，針對(duì)于白血病的檢測(cè)手段，尤其是白血病早期診斷及微小殘留病的檢測(cè)方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問(wèn)題。
白血病細(xì)胞的檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)了形態(tài)學(xué)(morphology，M)、免疫學(xué)(immunology，I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics，C)、分子生物學(xué)(molecular biology，M)檢查的漫長(zhǎng)過(guò)程，目前已發(fā)展為綜合這4大類(lèi)檢查結(jié)果將白血病按MICM進(jìn)行分型時(shí)代。MICM分型不僅對(duì)白血病的診斷具有重要意義，而且對(duì)白血病的治療、預(yù)后判斷等都具有重要的價(jià)值。
細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查仍是目前診斷白血病的基礎(chǔ)。1976年法、美、英三國(guó)的白血病專(zhuān)家依據(jù)于對(duì)白血病細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察和細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)，制訂了FAB分類(lèi)法，其確診急淋(ALL)和急非淋(ANLL)的符合率可達(dá)95％以上。而各亞型的診斷符合率僅60％-80％，因而難以預(yù)測(cè)預(yù)后和危險(xiǎn)因素，并且有少數(shù)病例由于細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不典型，細(xì)胞發(fā)育幼稚等而難以明確診斷和分型，且此診斷方法受人為因素影響較大，檢出率較低。
免疫分型(immunophenotyping)已是當(dāng)今白血病診斷、分型、預(yù)后判斷和殘留病檢測(cè)的一個(gè)有力手段，特別是在①僅根據(jù)形態(tài)不能確定白血病系列特異性(髓系還是淋系)；②區(qū)分B細(xì)胞和T細(xì)胞白血??；③雙表型白血病確診等方面，免疫分型尤顯重要性。免疫表型分析的方法主要有兩類(lèi)一、免疫酶標(biāo)法 二、免疫熒光法。近十年來(lái)，在早期免疫分型研究中，一般選用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，該技術(shù)是繼電子顯微鏡技術(shù)后細(xì)胞學(xué)研究手段的重大進(jìn)展，這種技術(shù)能高度自動(dòng)分析單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)生物學(xué)特征或多種細(xì)胞生化成分的含量，一般在1-2分鐘內(nèi)就能完成對(duì)細(xì)胞大群體(幾萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞)的定量分析測(cè)定，這種細(xì)胞大群體的分析數(shù)據(jù)具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)精度的特點(diǎn)，同時(shí)同一單細(xì)胞多參數(shù)相關(guān)分析可獲得更多更精確的信息。這是以往任何細(xì)胞分析術(shù)不可比擬的。FCM還可以在對(duì)樣品細(xì)胞多參數(shù)分析測(cè)定的基礎(chǔ)上，結(jié)合多種細(xì)胞生物學(xué)參數(shù)特性，將樣品中特定的細(xì)胞亞群高純度分選純化出來(lái)，單獨(dú)收集以供進(jìn)一步研究。FCM白血病細(xì)胞免疫表型分析可以快速精確分析白血病異常細(xì)胞的系來(lái)源及其分化階段，這稱(chēng)為FCM白血病細(xì)胞免疫表型診斷，它與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查以及分子生物學(xué)檢查結(jié)合在一起，可以較準(zhǔn)確的各類(lèi)各型白血病進(jìn)行診斷，以便正確選擇治療方案，以獲得更高的緩解率和更好的臨床治療效果。此方法也存在一定的缺點(diǎn)，如因標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存導(dǎo)致無(wú)法利用該方法進(jìn)行回顧性分析；原始細(xì)胞比例較低則結(jié)果難以分析等。
細(xì)胞遺傳學(xué)檢查對(duì)急性白血病的分型和判斷預(yù)后很有價(jià)值。應(yīng)用先進(jìn)的染色體分辯技術(shù)，80％～85％的急性白血病可檢出染色體異常。染色體的制備方法包括骨髓細(xì)胞直接法和骨髓細(xì)胞短期培養(yǎng)法。目前認(rèn)為ANLL以采用培養(yǎng)法較好，因其不但分裂相數(shù)量增加、質(zhì)量改善，而且異常分裂相檢出率高。ALL因白血病細(xì)胞培養(yǎng)后分裂較少，故更多采用直接法。染色體顯帶技術(shù)分為G顯帶(胰酶G顯帶，GTG)和R顯帶(熱變性吉姆薩R顯帶，RHG)。蘇州醫(yī)學(xué)院薛永權(quán)等根據(jù)十多年對(duì)6000余例惡性血液病開(kāi)展細(xì)胞遺傳學(xué)分析認(rèn)為，聯(lián)合骨髓直接法和短期培養(yǎng)法，以及采用R顯帶為主，G顯帶為輔的核型分析技術(shù)有助于提高染色體制備的成功率和核型異常的檢出率，但細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)難于掌握，并且僅能顯示大體的染色體異常。
白血病的基因改變已經(jīng)通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)分析證實(shí)，分子生物學(xué)進(jìn)展所產(chǎn)生的一些技術(shù)，包括熒光原位雜交、DNA印跡分析和逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)，這些技術(shù)比細(xì)胞遺傳學(xué)檢查有更高的敏感性和特異性，可以對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)改變不明顯和不可見(jiàn)的亞微結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行基因分析。另外，髓系白血病細(xì)胞的免疫表型在臨床分型上的特異性較低，因而其分子表型的應(yīng)用價(jià)值相對(duì)更大些。
隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，表觀(guān)遺傳學(xué)(Epigenetics)已成為生命學(xué)科的研究前沿。表觀(guān)遺傳學(xué)是針對(duì)遺傳學(xué)而言的，是指研究DNA序列不發(fā)生改變的可遺傳的基因表達(dá)變化的科學(xué)，它可以解釋一些經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解釋的問(wèn)題，例如單卵雙生的兄弟具有完全相同的基因型，并在同樣的環(huán)境下成長(zhǎng)，但僅其中一人患白血病，而另外一人身體健康，因此表觀(guān)遺傳信息提供了何時(shí)、何地以何種方式去應(yīng)用遺傳信息的指令。在血液腫瘤領(lǐng)域中，表觀(guān)遺傳學(xué)研究主要集中DNA甲基化及組蛋白乙?；?。DNA甲基化修飾是基因組表觀(guān)遺傳調(diào)控中主要的方式，人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CG二核苷酸胞嘧啶的5號(hào)碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細(xì)胞癌變過(guò)程中早期、頻發(fā)事件，因此特異基因的甲基化可作為癌癥早期診斷的分子標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和判斷預(yù)后手段。隨著技術(shù)的進(jìn)步，檢測(cè)甲基化的手段也豐富起來(lái)，不僅可探測(cè)某段DNA序列的甲基化分布，而且還能大通量的了解整個(gè)基因組的甲基化程度。目前主要方法有兩類(lèi)一是亞硫酸氫鈉法(Sodium Bisulfite)，包括亞硫酸氫鈉法依賴(lài)的基因測(cè)序法、亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性?xún)?nèi)切酶分析法{COBRA}、甲基化特異性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的單核苷酸擴(kuò)增法(Ms-SNuE)等；另一類(lèi)是甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF)、限制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)(RLGS)、差異性甲基化雜交分析(DMH)、甲基化CpG島擴(kuò)增子分析(MCA)等。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman發(fā)明了此項(xiàng)技術(shù)后，大大簡(jiǎn)化了DNA甲基化的檢測(cè)方法，使得表觀(guān)遺傳學(xué)研究更加迅速的向前發(fā)展，其突出的優(yōu)點(diǎn)在于高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用及耗時(shí)均較少、不受限制性?xún)?nèi)切酶的限制，目前MS-PCR已成為用以研究基因甲基化狀態(tài)的應(yīng)用最為廣泛的方法，尤其對(duì)于大批的臨床標(biāo)本甲基化狀態(tài)的研究更是首選方法。MS-PCR的基本原理是DNA經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽硫化修飾后，CpG島上沒(méi)有發(fā)生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，最后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶則保持不變，因此針對(duì)上述區(qū)別分別設(shè)計(jì)甲基化引物及非甲基化引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳照相觀(guān)察結(jié)果，得出是否為甲基化的結(jié)論。
ZO-1是1986年應(yīng)用特異性單克隆抗體從小鼠的肝細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)中鑒定出來(lái)的，它是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白，并且被認(rèn)為是一種重要的緊密連接骨架結(jié)構(gòu)(Stevenson，B.R.，and D.A.Goodenough.Zonulae occludentes in junctionalcomplex-enriched fractions from mouse liverpreliminary morphological and biochemicalcharacterization.J.Cell Biol.981209-1221，1984；Stevenson，B.R.，J.D.Silicano，M.S.Mooseker，and D.A.Goodenough.Identification of ZO-1a high molecular weightpolypeptide associated with the tight junction(zona occluden)in a variety of epithelia.J.CellBiol.103755-766，1986)。ZO-1基因大小為122351bp，位于人15號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)三帶，即15q13 chr1527779648-27901998，外顯子數(shù)28，CDS外顯子數(shù)27，與小鼠tjp-1基因具有高度的同源性。下面簡(jiǎn)述ZO-1基因的結(jié)構(gòu)與功能ZO-1在緊密連接中起中介作用，它把閉鎖蛋白和細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)。ZO-1是與緊密連接和細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)有密切關(guān)系的胞膜下蛋白(Itoh.M，NagafuchiA，Yone mura S et al.J Cell Biol，1993；121491-502；Jesaitis LA，Goode nough DA.J Cell Biol，1994；124949)，ZO-1與ZO-2相互結(jié)合在一起，并都與另一個(gè)130kD的蛋白質(zhì)相結(jié)合形成蛋白復(fù)合體(Bal da MS.Gozales-Mariscal Matter K et al.J Cell Biol，1993；123293-302)?，F(xiàn)已證明ZO-1與閉鎖蛋白羧基末端結(jié)合；研究提示ZO-1也與細(xì)胞骨架的血影蛋白(Spectrin)結(jié)合，它還被發(fā)現(xiàn)存在于某些以鈣粘附分子為基礎(chǔ)的細(xì)胞間連接中，如心肌細(xì)胞的潤(rùn)盤(pán)。ZO-1多肽鏈羧基末端富含脯氨酸殘基，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)此種蛋白質(zhì)含有與膜結(jié)合鳥(niǎo)苷酸激酶的同源結(jié)構(gòu)域(Bryant PJ，Watson KL，Justice RW et al.DevBiol，1993(suppl)；239-249)；ZO-1中還含有SH3(Srchomology3)結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)在許多骨架蛋白和信號(hào)傳遞蛋白質(zhì)中均存在，在亞細(xì)胞水平直接介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物，這些結(jié)果預(yù)示ZO-1參與細(xì)胞間通過(guò)緊密連接進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
ZO-1是人的膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶家族成員之一。MAGUK家族成員均含有幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，鳥(niǎo)苷酸激酶結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域。ZO-1的PDZ結(jié)構(gòu)域與Dlg同源，Dlg是果蠅lethal(1)discs-large-1抑癌基因的編碼產(chǎn)物，這表明ZO-1在細(xì)胞增殖的調(diào)控中起重要作用(Elizabeth W，Maria.S.B.，Alan S.The tight junction protein ZO-1 ishomologous to the Drosophila discs-large tumor suppressor protein of septate junctions.J.Cell Biol，1993；Vol.90，pp.7834-7838)。除與跨膜蛋白o(hù)ccludin及ZO-2直接作用外，有研究表明，在急性髓細(xì)胞白血病中ZO-1還與AF-6(ras癌基因的作用靶點(diǎn))相互作用(Yamamoto T，Harada N，Kano K，Taya S，Canaani E，Matsuura Y，Mizoguchi A，Ide C，Kaibuchi KThe Ras target AF-6 interacts with ZO-1 and serves as a peripheral component oftight junctions in epithelial cells.J Cell Biol 1997，139785-795)，這表明ZO-1可能在白血病的發(fā)生、發(fā)展中起作用。
ZO-1功能紊亂與人類(lèi)多種疾病密切相關(guān)。ZO-1功能異常，導(dǎo)致緊密連接缺陷，失去其正常的保護(hù)及屏障功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。例如保護(hù)功能喪失，導(dǎo)致細(xì)胞極性異常，因此可出現(xiàn)腫瘤、致癌乳頭瘤病毒感染等；屏障功能的喪失則與水腫、黃疸、細(xì)菌性腸炎等疾病相關(guān)(Norimasa S·Masaki M·Keisuke KTight junctions and human diseases.Med Electron Microsc(2003)36147-156)。
目前，ZO-1與腫瘤之間關(guān)系的研究是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。研究資料表明，ZO-1不僅參與腫瘤的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)與腫瘤的進(jìn)展也關(guān)系密切。在結(jié)腸癌中，癌組織中ZO-1的表達(dá)明顯減少或缺如，而在正常結(jié)腸組織中，則該基因?yàn)楦弑磉_(dá)的；在侵襲性強(qiáng)、早期發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例中，ZO-1的表達(dá)也是缺乏的，這主要與該基因表達(dá)沉默所致的緊密連接功能缺陷有關(guān)。在正常乳腺中ZO-1也是高強(qiáng)度表達(dá)的，但在乳腺癌中，ZO-1表達(dá)減少或缺失的病例占69％，其中分化良好的病例中ZO-1表達(dá)減少或缺如的占42％，在中等程度分化的比例中占83％，而分化類(lèi)型較差的病例中占93％，與疾病的惡性程度及進(jìn)展相關(guān)；在此項(xiàng)研究中還表明在23％的乳腺癌患者中ZO-1基因發(fā)生雜合性缺失，并且推測(cè)腫瘤組織中ZO-1表達(dá)下調(diào)的機(jī)制可能是雜合性缺失、點(diǎn)突變和高甲基化(Kevin B.Hoover，Shu-Yuan Liao， and Peter J.Bryant.Loss of the tight junction MAGUK ZO-1 in breastcancer relationship to glandular differentiation and loss of heterozygosity AJP December1998，Vol.153，No.61767-1773)。但也有學(xué)者研究表明，在胰腺癌、滑膜肉瘤的病人中zo-1高表達(dá)，并且這種過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤轉(zhuǎn)移特性(Kleeff J，Shi x，Bode HP，Hoover K，Shrikhande S，Altered Expression and Localization of the Tight Junction Protein ZO-1 inPrimary and Metastatic Pancreatic Cancer.Pancreas.2001 Oct；23(3)259-65；Billings SD，Walsh SV，F(xiàn)isher C，Nusrat A，Weiss SW，F(xiàn)olpe AL.，Aberrant expression of tightjunction-related proteins ZO-1，claudin-1 and occludin in synovial sarcomaanimmunohistochemical study with ultrastructural correlation.Mod Pathol.2004 Feb；17(2)141-9)。上述兩種完全相反的現(xiàn)象可能用ZO-1基因的組織特異性來(lái)解釋。一瑞士學(xué)者研究表明，ZO-1與Y-box轉(zhuǎn)錄因子(ZONAB)相互作用可下調(diào)原癌基因ErbB-2的表達(dá)與功能，這說(shuō)明ZO-1直接參與基因的表達(dá)與細(xì)胞分化的調(diào)控(Maria S.Balda.Thetight junction protein ZO-1 and an interacting transcription factor regulate ErbB-2 expression.The EMBO Journal Vol.19 NO.9 pp.2024-2033，2000)。
本發(fā)明人應(yīng)用限制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)(RLGS)對(duì)白血病小鼠、白血病前期及正常小鼠基因組進(jìn)行檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)僅在白血病小鼠中ZO-1基因呈高甲基化狀態(tài)，并且小鼠與人的ZO-1基因高度同源，該研究成果已發(fā)表在《nature genetics》上(Yu L，LiuC，Vandeusen J，et al.Global assessment of promoter methylation in a mouse model ofcancer identifies ID4 as a putative tumor-suppressor gene in human leukemia[J].NatGenet，2005，37265-274) ，因此推斷該基因的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能是一個(gè)新的白血病分子標(biāo)記物，ZO-1基因可能是一個(gè)白血病相關(guān)抑癌候選基因。以此為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，本發(fā)明人應(yīng)用MS-PCR的方法對(duì)大量臨床急性白血病及正常骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以明確其ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)細(xì)胞ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，即用于檢測(cè)ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，同時(shí)，本發(fā)明還涉及含有所述引物的試劑盒。經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)與推敲，本發(fā)明人選出一對(duì)特異性很好的甲基化引物對(duì)及非甲基化引物對(duì)，并且建立了一個(gè)穩(wěn)定的反應(yīng)體系，摸索出理想的反應(yīng)條件，應(yīng)用敏感度較高的丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)作為結(jié)果的檢出手段，因此得出可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)在人類(lèi)急性白血病中具有較高的特異性。利用所述引物對(duì)及試劑盒檢測(cè)ZO-1基因甲基化狀態(tài)的靈敏度高，解決了上述檢出率低、結(jié)果難以分析、僅能顯示大體染色體異常等一系列技術(shù)問(wèn)題，因此，本發(fā)明所述的引物及試劑盒可用于白血病早期診斷、療效判定、微小殘留病檢測(cè)等。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是用于檢測(cè)細(xì)胞ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，其為甲基化引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’。利用該甲基化引物對(duì)，以硫化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增，如果ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)存在甲基化，則會(huì)得到171bp大小的片段；如果ZO-1基因正常即未甲基化，則不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物?；诖?，本申請(qǐng)將該引物對(duì)稱(chēng)為甲基化引物。
所述甲基化引物對(duì)，其上游引物的Tm 58.27，GC含量48％，’C’s 4，下游引物的Tm59.71，GC含量78.26％，’C’s 10。
本發(fā)明還涉及下述非甲基化引物對(duì)，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.4所述，即5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3’。利用該非甲基化引物對(duì)，以硫化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增，如果ZO-1基因正常即未甲基化，則會(huì)得到179bp大小的片段?；诖耍旧暾?qǐng)將該引物對(duì)稱(chēng)為非甲基化引物。
所述非甲基化引物對(duì)，其上游引物的Tm 57.54，GC含量44.83％，’C’s 4，下游引物的Tm56.44，GC含量80％，’C’s 11。
進(jìn)一步地，利用本發(fā)明的引物對(duì)進(jìn)行MS-PCR的方法，其理想的反應(yīng)條件如下95℃下預(yù)變性15min，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性50s，在56℃下退火40s，在72℃下延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)在72℃下延伸10min。
進(jìn)一步地，利用本發(fā)明的引物對(duì)檢測(cè)白血病細(xì)胞的MS-PCR反應(yīng)體系，以總體25ul計(jì)，其包括(1)模板2ul；(2)濃度為10pmol/ul的所述甲基化引物對(duì)或非甲基化引物對(duì)，其中，上游引物與下游引物各為3ul；(3)10×Herman’s buffer緩沖液2.5ul；(4)25mMdNTP1.25ul；(5)Hotstar taq酶0.15ul；(6)去離子水13.1ul；其中，所述模板為硫化修飾后的待測(cè)細(xì)胞DNA，或硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％甲基化的白血病細(xì)胞DNA，或硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％非甲基化的正常骨髓細(xì)胞DNA。
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)白血病細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包含上述的甲基化引物對(duì)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明試劑盒還包含上述的非甲基化引物對(duì)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包含甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板，該模板為硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％甲基化的白血病細(xì)胞DNA。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包含非甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板，該模板為硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％非甲基化的正常骨髓細(xì)胞DNA。
進(jìn)一步，本發(fā)明的試劑盒還包含MS-PCR反應(yīng)所需的下列成分10×Herman’s buffer緩沖液，25mMdNTP，Hotstar taq酶，去離子水。
本發(fā)明中，用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，而用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物為完全甲基化；用甲基化及非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，均有擴(kuò)增產(chǎn)物，為部分甲基化；用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，為無(wú)甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定為甲基化。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)利用本發(fā)明所述引物及試劑盒檢測(cè)骨髓細(xì)胞，在白血病細(xì)胞中ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，甲基化率約為61.7％，而在正常骨髓細(xì)胞中，ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，表明該基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)對(duì)于白血病細(xì)胞具有特異性；同時(shí)應(yīng)用本發(fā)明所述引物及試劑盒、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件可使檢測(cè)白血病細(xì)胞的靈敏度達(dá)到0.5％，即1000個(gè)細(xì)胞中有5個(gè)白血病細(xì)胞就能夠被檢測(cè)出，這說(shuō)明ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可作為急性白血病一個(gè)新的分子標(biāo)志。本試劑盒首次選用ZO-1基因作為目標(biāo)基因，該基因是本發(fā)明人應(yīng)用RLGS技術(shù)篩選出的在白血病細(xì)胞中啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)的基因，具有首創(chuàng)性。因此，應(yīng)用本發(fā)明引物及試劑盒來(lái)檢測(cè)ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為急性白血病診斷、療效觀(guān)察、預(yù)后判斷、微小殘留病檢測(cè)等的有力手段，而且，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖1以硫化修飾后的正常骨髓細(xì)胞DNA、硫化修飾后的白血病細(xì)胞DNA、去離子水(陰性對(duì)照)為模板，分別用甲基化引物及非甲基化引物進(jìn)行MS-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(分別擴(kuò)增，混合點(diǎn)樣)。
1DNA標(biāo)記(DL2000)2、4、6、8、10、12、14、16為甲基化引物擴(kuò)增的產(chǎn)物；
3、5、7、9、11、13、15、17為非甲基化引物擴(kuò)增的產(chǎn)物；2、3為正常骨髓a；6、7為正常骨髓b；4、5為急性白血病(1)；8、9為急性白血病(2)；10、11為急性白血病(3)；12、13為急性白血病(4)；14、15為急性白血病(5)；16、17為陰性對(duì)照(去離子水)。
圖2將白血病細(xì)胞系HL60的DNA(zo-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％甲基化)與正常細(xì)胞的DNA(ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％非甲基化)按比例混合，進(jìn)行硫化修飾，此后用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(分別擴(kuò)增，混合點(diǎn)樣)。
第1組100％HL60細(xì)胞DNA+0％正常細(xì)胞DNA；第2組50％HL60細(xì)胞DNA+50％正常細(xì)胞DNA；第3組5％HL60細(xì)胞DNA+95％正常細(xì)胞DNA；第4組1％HL60細(xì)胞DNA+99％正常細(xì)胞DNA；第5組0.5％HL60細(xì)胞DNA+99.5％正常細(xì)胞DNA；第6組0％HL60細(xì)胞DNA+100％正常細(xì)胞DNA。
具體實(shí)施例方式
為更詳細(xì)地了解本發(fā)明，以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例一1、模板的制備(基因組DNA的提取及硫化修飾過(guò)程)DNA的制備獲取白血病骨髓標(biāo)本及正常骨髓標(biāo)本。在本實(shí)施例中取5個(gè)急性白血病患者的骨髓標(biāo)本(1)、(2)、(3)、(4)、(5)，2個(gè)正常骨髓標(biāo)本a、b。每個(gè)標(biāo)本各取2ml，應(yīng)用酚-氯仿抽提的方法分別提取基因組DNA，紫外分光光度儀測(cè)定吸光度(A)值確定其含量及純度。
亞硫酸鹽修飾參考herman(J.G.Herman，J.R.Graff，S.Myohanen，B.D.Nelkin andS.B.Baylin，Methylation-specific PCRa novel PCR assay for methylation status of CpGislands，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，9821-9826.)等報(bào)道的方法加以改進(jìn)。取上述制備的基因組DNA，經(jīng)稀釋后，在液氮中反復(fù)凍融2次，再用26G注射器抽吸40次，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并精確取1ugDNA，加去離子水至終體積50ul，加入新鮮配制的3M的NaOH 5ul，37℃孵育25min。之后加入新鮮配制的10mM的氫醌30ul及3M亞硫酸氫鈉520ul混合均勻(其內(nèi)已加入新鮮配制的3M的NaOH，計(jì)算方法10ml3M亞硫酸氫鈉中加入3M的NaOH 740ul)，50℃孵育16h，此后應(yīng)用DNA純化試劑盒(AXYGEN公司產(chǎn)品)純化并回收DNA，應(yīng)用50ul去離子水洗脫DNA，向其內(nèi)加入5ul3M的NaOH以終止硫化修飾，用3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，最終硫化修飾后的DNA重新溶解在20ul去離子水中，得到DNA模板，立即使用或-20℃保存。
2、MS-PCR擴(kuò)增以甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul計(jì)，包括模板(硫化修飾后的DNA)2ul；甲基化引物(10pmol/ul)上游引物(5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’)3ul，下游引物(5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’)3ul；10×Herman’s buffer(緩沖液)2.5ul；25mMdNTP1.25ul；Hotstar taq酶0.15ul；去離子水13.1ul以非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul計(jì)，包括與甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系所不同的是引物不同，在該體系中為非甲基化引物(10pmol/ul)上游引物(5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’)3ul，下游引物(5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3，)3ul；其余均與甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系中的相同。
利用上面建立的MS-PCR反應(yīng)體系對(duì)制備的7個(gè)DNA模板(急性白血病細(xì)胞(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、正常骨髓a、b)分別進(jìn)行擴(kuò)增，并以去離子水作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃下預(yù)變性15min，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性50s，在56℃下退火40s，在72℃下延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)在72℃下延伸10min。
3.PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行8％丙烯酰胺凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測(cè)并照相。
4.結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖1，用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，急性白血病(1)、(3)、(4)有擴(kuò)增產(chǎn)物，急性白血病(2)、(5)、正常骨髓a、b無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，而用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，急性白血病(1)、(2)、(3)、(5)、正常骨髓a、b有擴(kuò)增產(chǎn)物，急性白血病(4)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，急性白血病(1)、(3)為部分甲基化，急性白血病(4)為完全甲基化，急性白血病(2)、(5)、正常骨髓a、b無(wú)甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定為甲基化。
實(shí)施例二臨床標(biāo)本檢測(cè)取臨床標(biāo)本60例急性白血病病人骨髓標(biāo)本，其中，初治急性白血病42例(AML 23例，ALL型12例，未分型7例)、復(fù)發(fā)急性白血病5例、緩解的急性白血病13例，33例正常骨髓，進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增，模板制備、PCR擴(kuò)增體系及條件、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)均與實(shí)施一中的相同，檢測(cè)結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)下表

實(shí)施例三敏感度實(shí)驗(yàn)將白血病細(xì)胞系HL60的DNA(ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％甲基化)與正常細(xì)胞的DNA(ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％非甲基化)按比例混合，進(jìn)行硫化修飾(方法同實(shí)施例一)，再進(jìn)行MS-PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行8％丙烯酰胺電泳，紫外透射分析儀測(cè)定并照相。
分組第1組100％HL60細(xì)胞DNA+0％正常細(xì)胞DNA第2組50％HL60細(xì)胞DNA+50％正常細(xì)胞DNA第3組5％HL60細(xì)胞DNA+95％正常細(xì)胞DNA第4組1％HL60細(xì)胞DNA+99％正常細(xì)胞DNA第5組0.5％HL60細(xì)胞DNA+99.5％正常細(xì)胞DNA第6組0％HL60細(xì)胞DNA+100％正常細(xì)胞DNA結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖2在1000個(gè)正常細(xì)胞中有5個(gè)白血病細(xì)胞就可以被檢測(cè)出，即用本發(fā)明引物及反應(yīng)體系、條件檢測(cè)急性白血病細(xì)胞ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)其靈敏度可達(dá)到0.5％，靈敏度較高，可用來(lái)監(jiān)測(cè)白血病微小殘留病變。
實(shí)施例四檢測(cè)白血細(xì)胞的試劑盒組成檢測(cè)白血細(xì)胞的試劑盒包括以下成分，其中，進(jìn)行1次MS-PCR的用量為1、甲基化引物上游引物核苷酸序列為SEQ ID No.1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID No.2，各為3ul。
2、非甲基化引物上游引物核苷酸序列為SEQ ID No.3，下游引物核苷酸序列為SEQ IDNo.4，各為3ul。
3、反應(yīng)液2份，每份反應(yīng)液包括(1)Herman’s buffer(緩沖液)2.5ul；(2)25mMdNTP1.25ul；(3)Hotstar taq酶0.15ul；(4)去離子水13.1ul。
一個(gè)試劑盒可以包括上述各成分進(jìn)行多次MS-PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具體量視情況需要而定。
為防止出現(xiàn)MS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的假陽(yáng)性，試劑盒還可包括下述a、b中的一項(xiàng)或兩項(xiàng)a、甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％甲基化的白血病細(xì)胞DNA，進(jìn)行1次MS-PCR其用量為2ul。
b、非甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)為100％非甲基化的正常骨髓細(xì)胞DNA，進(jìn)行1次MS-PCR其用量為2ul。
核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院<120>檢測(cè)白血病細(xì)胞的引物及試劑盒<160>4<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1AAAATAAATA GGAAGATTCG TACGG25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2GAAACTAAAC GAAACGAAAC GAA 23<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3GGATAAAAAT AAATAGGAAG ATTTGTATG29<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4AACAAAACTA AACAAAACAA AACAA2權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)細(xì)胞ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，其為甲基化引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’。
2.一種用于檢測(cè)細(xì)胞ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，包括甲基化引物對(duì)和非甲基化引物對(duì)，其中所述甲基化引物對(duì)，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，所述非甲基化引物對(duì)，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3 所述，即5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.4所述，即5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3’。
3.利用權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)進(jìn)行MS-PCR的方法，其中反應(yīng)條件如下95℃下預(yù)變性15min，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性50s，在56℃下退火40s，在72℃下延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)在72℃下延伸10min。
4.一種檢測(cè)白血病細(xì)胞的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于還包含甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板，該模板為硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％甲基化的白血病細(xì)胞DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于還包含非甲基化陽(yáng)性對(duì)照PCR模板，該模板為硫化修飾后的ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)100％非甲基化的正常骨髓細(xì)胞DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于還包含MS-PCR反應(yīng)所需的下列成分10×Herman’s buffer緩沖液，25mMdNTP，Hotstar taq酶，去離子水。
8.一種用于檢測(cè)白血病細(xì)胞的MS-PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul計(jì)，其包括(1)模板2ul；(2)濃度為10pmol/ul的權(quán)利要求1或2中所述的甲基化引物對(duì)或權(quán)利要求2中所述的非甲基化引物對(duì)，其中，上游引物與下游引物各為3ul；(3)10×Herman’s buffer緩沖液2.5ul；(4)25mMdNTP1.25ul；(5)Hotstar taq酶0.15ul；(6)去離子水13.1ul。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測(cè)細(xì)胞ZO－1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物及試劑盒，引物為一對(duì)甲基化引物或?yàn)橐粚?duì)甲基化引物和一對(duì)非甲基化引物。本試劑盒首次選用ZO－1基因作為目標(biāo)基因，該基因是本發(fā)明人應(yīng)用RLGS技術(shù)篩選出的在白血病細(xì)胞中啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)的基因，具有首創(chuàng)性。利用本發(fā)明所述引物及試劑盒檢測(cè)白血病細(xì)胞的特異性好，可達(dá)61.7％；靈敏度高，達(dá)到0.5％，即1000個(gè)細(xì)胞中有5個(gè)白血病細(xì)胞就能夠被檢測(cè)出。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒來(lái)檢測(cè)ZO－1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為急性白血病診斷、療效觀(guān)察、預(yù)后判斷、微小殘留病檢測(cè)等的有力手段，而且，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1986834SQ200710000028
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2007年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月5日
發(fā)明者于力, 李薇, 王暢, 王冠軍, 竇立萍, 秦耘, 康慧媛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院