Sept9基因甲基化檢測(cè)引物探針體系及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測(cè)引物和檢測(cè)體系, 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 06-甲基鳥(niǎo)噪呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06-methylguanine-DNA methyhransferase, SEPT9)是一種DNA修復(fù)酶,是人類細(xì)胞中唯一的能去除DNA上鳥(niǎo)嘌呤06位點(diǎn)上致細(xì)胞毒性和 突變的烷化劑加合物,使損傷的鳥(niǎo)嘌呤恢復(fù),從而能夠保護(hù)細(xì)胞免受抗烷化基團(tuán)的損害。啟 動(dòng)子甲基化是SEPT9基因最常見(jiàn)的異常,與SEPT9蛋白的表達(dá)密切相關(guān),導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄停 止,蛋白表達(dá)減少。
[0003] 有研究顯示在膠質(zhì)瘤中SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率越高,SEPT9含量越低,月中 瘤惡性程度就越高。SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化還可用于臨床上評(píng)估不同膠質(zhì)瘤患者烷化劑 化學(xué)治療療效。在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,SEPT9啟動(dòng)子甲基化作為預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)烷化劑如替 莫唑胺(ΤΜΖ)治療的獲益已得到驗(yàn)證,加拿大國(guó)家癌癥研究所(NCIC)和歐洲癌癥研究和治 療組織(EORTC)研究表明SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者接受替莫唑胺治療 后存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。SEPT9基因甲基化是膠質(zhì)瘤化療效果好的因素之一,檢測(cè)膠質(zhì)瘤病人 血清中SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可用來(lái)預(yù)測(cè)病人的預(yù)后及制定個(gè)體化的化療方案,這 將在提高化療療效,改善病人預(yù)后方面有著十分重要的意義。研究也顯示結(jié)直腸癌生成期 間的SEPT9表觀遺傳沉默與CpG島在其啟動(dòng)子高甲基化有關(guān);此轉(zhuǎn)錄后基因沉默造成的結(jié)果 是〇 6-烷基鳥(niǎo)嘌呤加合物的DNA修復(fù)被削弱,并且對(duì)烷化劑尤其是達(dá)卡巴嗪和其口服前藥替 莫唑胺的化療敏感性增加。另外,骨肉瘤SEPT9基因甲基化狀態(tài)與化療療效明顯負(fù)相關(guān), SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在判斷骨肉瘤患者化療療效中具有重要意義。
[0004] 目前,檢測(cè)甲基化的方法包括:1、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶(Methylat ion-sensitive restriction Endonuclease ,MS_RE) 法。但識(shí)別的CG序列因酶的識(shí)別位點(diǎn)有限 故有局限性,且存在酶不完全消化引起的假陽(yáng)性問(wèn)題;2、甲基化特異性PCR法 (Methylation-specific PCR,MSP),是目前較為常見(jiàn)的檢測(cè)基因甲基化的方法。MSP法的原 理是首先用亞硫酸鹽修飾處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶則不變。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后通 過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析,確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。但是該方法對(duì)引物設(shè)計(jì) 要求非常高,一般會(huì)因?yàn)閬喠蛩猁}過(guò)度的處理,使得模板很難擴(kuò)增出來(lái)。MSP法目前多結(jié)合 巢式PCR法。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增。第一對(duì)PCR 引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似;第二對(duì)引物稱為巢式引物(因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段 的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的 好處在于,如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷,則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò) 增的概率極低。因此,巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。MSP法結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增的方法是設(shè)計(jì)針對(duì) 沒(méi)有變化的模板的一組引物;針對(duì)變化了的模板的一組引物;看哪組引物能擴(kuò)增出來(lái)從而 判斷模板有沒(méi)有變化,如果模板沒(méi)變化,就表示模板被甲基化了。MSP法結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增的 方法能提高單一 MSP法的特異性,但操作時(shí)間長(zhǎng),且相比MSP法同樣存在重亞硫酸鹽處理不 完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性修飾過(guò)程中的pH值要絕對(duì)準(zhǔn)確、所有試劑要求新鮮配置,并且需要反復(fù) 摸索找出合適的反應(yīng)時(shí)間,造成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程繁瑣,且不能做到定量檢測(cè),存在較高的假陽(yáng) 性率;也存在亞硫酸鹽處理過(guò)度,造成擴(kuò)增困難的情況;3、甲基化敏感性解鏈曲線分析法 (MS-High Resolution Melting Cu rve,MS_HRM),操作繁瑣,假陽(yáng)性率高,且不適于大量樣 本的檢測(cè);4、熒光法(Methylight),由于探針的局限性,一般沒(méi)有合適的對(duì)照體系,假陽(yáng)性 率較高;5、亞硫酸氫鹽基因測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR,BSP),是PCR聯(lián)合Sa nger 測(cè)序技術(shù),結(jié)果準(zhǔn)確,但過(guò)程繁瑣,不適合大批量檢測(cè),且價(jià)格昂貴不能廣泛使用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種方案簡(jiǎn)潔,靈敏度高,準(zhǔn)確率高的SEPT9基因 甲基化檢測(cè)試劑盒,以及其檢測(cè)引物探針和檢測(cè)體系。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種SEPT9基因甲基化檢測(cè) 弓丨物探針,包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的引物探針組X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的引物探 針組Y和用于檢測(cè)SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化情況的引物探針組Z;
[0007] 所述引物探針組X包括正向引物a、反向引物a和探針a;
[0008] 所述引物探針組Y包括正向引物b、反向引物b和探針b;
[0009] 所述引物探針組Z包括正向引物b、反向引物b、探針c和探針d;
[0010]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示;
[0011]所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
[0012]所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
[0013]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;
[0014] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;
[0015] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示;
[0016] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;
[0017] 所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;
[0018] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報(bào)告熒光基團(tuán),所述探針a、探針b、探針c和 探針d的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0019] 上述各引物應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃度為0.4μΜ;各探針應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃 度為0.2μΜ。
[0020] 上述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)。
[0021] 上述相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種,第一種是FAM,第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1。
[0022] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種采用上述引物探針的 SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒。
[0023]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種SEPT9基因甲基化檢測(cè) 體系,包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的反應(yīng)體系X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的反應(yīng)體系Y和用 于檢測(cè)SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化情況的反應(yīng)體系Z;
[0024] 所述反應(yīng)體系X包括正向引物a、反向引物a、探針a、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水;
[0025] 所述反應(yīng)體系Y包括正向引物b、反向引物b和探針b、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水;
[0026] 所述反應(yīng)體系Z包括正向引物b、反向引物b、探針c、探針d、PCR緩沖液、dNTPs、 MgCh和純水;
[0027]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示;
[0028] 所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
[0029] 所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
[0030] 所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;
[0031] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;
[0032] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示;
[0033] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示;
[0034] 所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;
[0035] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報(bào)告熒光基團(tuán),所述探針a、探針b、探針c和 探針d的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0036]上述各反應(yīng)體系的組分中包括十倍濃度的PCR緩沖液1體積,2mM的dNTPs試劑1體 積,15mM的MgCl2溶液1體