專利名稱：一種低酸發(fā)酵加工用植物乳桿菌專用菌株及其發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低酸發(fā)酵肉制品加工專用植物乳桿菌及其發(fā)酵劑的制備技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
植物乳桿菌是一種革蘭氏染色陽性、不形成內(nèi)生孢子、不能運動的常以單個或鏈狀存在的桿狀菌。其能進(jìn)行糖類發(fā)酵代謝產(chǎn)生乳酸、不產(chǎn)氣、不能還原硝酸鹽，屬于乳桿菌屬細(xì)菌。大量研究表明其存在于大多數(shù)低酸發(fā)酵肉制品加工過程中，具有顯著的發(fā)酵乳糖等糖類形成乳酸與抑菌素，提高肉類酸度、抑制腐敗菌與常見致病菌等的發(fā)酵作用。有鑒于此，上世紀(jì)60年代以來，國際上已廣泛開展了發(fā)酵植物源、發(fā)酵乳品源與發(fā)酵肉品源植物乳桿菌優(yōu)良發(fā)酵菌株篩選及其發(fā)酵劑制備工藝研究工作。自1974年美國發(fā)布植物乳桿菌單獨或與其他乳酸菌聯(lián)合用于干香腸專利以來，在歐美等發(fā)達(dá)國家已有多株植物乳桿菌發(fā)酵劑商業(yè)化用于多種低酸發(fā)酵肉制品干發(fā)酵向腸制品加工方面。近些年來，我國學(xué)者亦從進(jìn)口的發(fā)酵劑或一些種類干發(fā)酵香腸、臘肉加工過程與產(chǎn)品中分離篩選到一些植物乳桿菌菌株，但有關(guān)其發(fā)酵劑制備研究還處于一些制備方法優(yōu)選方面，有關(guān)其系統(tǒng)制備工藝與輔劑研究，尤其是冷凍濃縮發(fā)酵劑系統(tǒng)制備工藝技術(shù)方面研究還少見研究報道，尚未形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)科技成果，有關(guān)發(fā)酵肉制品加工用植物乳桿菌發(fā)酵劑還處于依賴進(jìn)口狀態(tài)。有關(guān)塊狀低酸發(fā)酵肉制品Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿中植物乳桿菌菌株及其發(fā)酵劑制備技術(shù)也尚未見報道。
Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿是上世紀(jì)80年代末期我國一些合資企業(yè)引進(jìn)國外技術(shù)生產(chǎn)的低酸發(fā)酵牛肉制品。近二十年來，其生產(chǎn)加工已逐漸成為我國優(yōu)質(zhì)高檔牛肉生產(chǎn)企業(yè)提高中低檔牛肉加工附加值的重要方式之一，Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿生產(chǎn)企業(yè)已由最初1～2家發(fā)展到十余家企業(yè)，其產(chǎn)品市場已處于由高檔賓館飯店向超級市場轉(zhuǎn)化階段。但是，受引進(jìn)消化的加工工藝一直處于自然發(fā)酵加工狀態(tài)所致產(chǎn)品質(zhì)量特征中式化程度低、質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性差，加工周期長、加工成本高問題制約，其生產(chǎn)還處于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、規(guī)?；⒋蟊娀潭鹊拖掳l(fā)展?fàn)顟B(tài)，如何實現(xiàn)其生產(chǎn)加工由自然發(fā)酵加工到人為控制發(fā)酵加工轉(zhuǎn)變、提高其質(zhì)量、縮短其加工周期、降低其生產(chǎn)成本一直是亟待解決的重要技術(shù)難題。針對這一技術(shù)難題，2001年以來，我們系統(tǒng)查閱了國際同類產(chǎn)品科學(xué)研究資料，并在確認(rèn)意大利Bresaola、巴西Charqui、西班牙與墨西哥Cecina等產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中存在微生物區(qū)系變化、尤其是國際上已研究確認(rèn)木糖葡萄球菌人為接種可提高Charqui感官質(zhì)量、能夠加快蛋白質(zhì)降解，存在利用分離細(xì)菌實現(xiàn)該類產(chǎn)品加工由自然發(fā)酵加工轉(zhuǎn)化到人為控制發(fā)酵加工、縮短其加工周期的可能性基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿生產(chǎn)加工過程中發(fā)酵細(xì)菌區(qū)系變化、對優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，研究了分離篩選獲得的植物乳桿菌接種對產(chǎn)品加工過程中蛋白質(zhì)、脂肪降解、發(fā)酵特性與產(chǎn)品質(zhì)量影響。我們在確認(rèn)篩選獲得植物乳桿菌菌株具有提高產(chǎn)品酸度、游離脂肪酸含量、提高產(chǎn)品甘氨酸含量，具有肉類發(fā)酵劑耐鹽、耐亞硝酸鹽等特性，具有抑制大腸桿菌、李斯特等菌提高產(chǎn)品微生物安全性，能夠改進(jìn)產(chǎn)品色澤、香氣、滋味等感官質(zhì)量的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了培養(yǎng)基、增值培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、濃縮方法與冷凍真空干燥技術(shù)方法與工藝參數(shù)變化對分離篩選獲得的植物乳桿菌存活狀況的影響以及該發(fā)酵劑應(yīng)用效果。在上述研究基礎(chǔ)上，形成了本項低酸發(fā)酵肉制品加工用專用植物乳桿菌菌株及活菌數(shù)達(dá)到1010cfu/g數(shù)量級的冷凍濃縮發(fā)酵劑制備工藝方法發(fā)明。
低酸發(fā)酵肉制品是一類經(jīng)過低溫(≤22℃)發(fā)酵與干燥加工而成的，終產(chǎn)品pH值在5.5以上的發(fā)酵肉制品。該類產(chǎn)品不僅與高酸發(fā)酵肉制品一樣具有營養(yǎng)豐富、食用安全性高、貨架壽命長特點，而且因加工過程中碳水化合物降解率低、蛋白與脂肪酶解程度高，更具有口味柔和、風(fēng)味濃郁等質(zhì)量特點。其不僅是歐美發(fā)達(dá)國家備受青睞的高檔肉類產(chǎn)品，而且因其起源于占我國肉制品產(chǎn)量30％以上的腌臘肉制品，風(fēng)味較為適合我國人民飲食消費習(xí)慣且安全、營養(yǎng)、風(fēng)味等商品質(zhì)量優(yōu)于腌臘肉制品，在國內(nèi)也具有廣闊的潛在市場。有鑒于此，近些年來，我國一些企業(yè)已在積極發(fā)展低酸發(fā)酵肉制品，積極探索將腌臘肉制品提升為低酸發(fā)酵肉制品得技術(shù)途徑。但是受我國有關(guān)研究開展較遲、研究尚欠系統(tǒng)深入，低酸發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑處于依賴進(jìn)口狀態(tài)影響，我國低酸發(fā)酵肉制品因質(zhì)量特征中式化不足而發(fā)展步履艱難，腌臘肉制品生產(chǎn)因缺乏相應(yīng)發(fā)酵劑與相應(yīng)人工控制發(fā)酵技術(shù)還處于傳統(tǒng)自然發(fā)酵加工狀態(tài)，安全與質(zhì)量事故迭出，現(xiàn)代化生產(chǎn)消費發(fā)展舉步維艱。在此形勢下，植物乳桿菌發(fā)酵劑及其制備技術(shù)發(fā)明無疑對于低酸發(fā)酵肉制品與腌臘肉制品發(fā)展而言具有廣闊的開發(fā)價值與應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能用于低酸發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的專用菌株及發(fā)酵劑制備方法。
本發(fā)明所提供的所提供的低酸發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的專用菌株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌株L1分離自北京華安肉類有限公司Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿加工過程中，微生物形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，該菌株已于2007年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC No.1924。此菌株除具有植物乳桿菌一般特性外，還具有耐受6％濃度食鹽、0.15％亞硝酸鈉等肉品發(fā)酵劑需求特性，且在20℃培養(yǎng)條件下具有較強(qiáng)蛋白酶活性與抑制大腸桿菌、李斯特菌特性，。
本發(fā)明所提供的低酸發(fā)酵肉制品加工用植物乳桿菌發(fā)酵劑制備方法為以培養(yǎng)、濃縮、真空冷凍干燥為基本工藝。培養(yǎng)時使用的適宜培養(yǎng)基為麥芽汁復(fù)合增值培養(yǎng)基，其組成為麥芽汁培養(yǎng)基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁(％指g/100ml)增殖因子；適宜培養(yǎng)條件為溫度20℃，培養(yǎng)基起始pH值為6.5～7.0，適宜收獲時間為搖床培養(yǎng)18～22h后離心收獲菌體；適宜濃縮方法為離心富集法，離心條件為溫度0～4℃，離心轉(zhuǎn)速6000rpm，離心時間30min；真空冷凍干燥時懸浮介質(zhì)為加入5％蔗糖、0.5％維生素C、4％甘油、3％CaCO3(％代表g/100ml)?；蜃拥?2％的脫脂乳，真空冷凍干燥方法為將加有保護(hù)劑的和濃縮菌體的脫脂乳裝于真空冷凍干燥器、在25冷凍2小時，然后將其放入真空冷凍干燥機(jī)中在冷阱溫度-30，絕壓4帕以下條件下干燥28~32小時，使含菌與冷凍保護(hù)劑脫脂乳水分含量達(dá)到2.5~3％是停止干燥，并將其盛放于密閉包裝內(nèi)。采用本植物乳桿菌發(fā)酵劑制備技術(shù)方法制備的發(fā)酵劑中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L1 CGMCC № 1924的含量達(dá)到1010cfu/g以上。
具體實施例方式
實施例1、低酸發(fā)酵制品加工用專用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1CGMCC № 1924)的篩選1.備選菌株獲取過程從北京華安肉類有限公司Bundnerfleisch發(fā)酵牛肉火腿生產(chǎn)加工過程腌制階段開始，第0，6，12，18(腌制階段)，27，36，48(干燥階段)天分別無菌獲取肉樣。從各時間取得的肉樣中無菌稱取25.0g樣品，加入225mL無菌生理鹽水中，均質(zhì)30s，進(jìn)行不同濃度稀釋。然后將不同稀釋度的菌懸液接種于MRS平板培養(yǎng)基中，在30℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，分別從最高稀釋度的培養(yǎng)平板上隨機(jī)挑取10個菌落，再移接到MRS與營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，分別篩選得到乳酸菌70株，生理生化鑒定后獲得26株植物乳桿菌。
2.備選菌株蛋白酶與脂肪酶活性測定菌株蛋白酶活性測定培養(yǎng)基組成為蛋白胨5g，干酪素10g，葡萄糖10g，牛肉膏10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。
菌株脂肪酶活性測定油脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，香油或花生油10g，中性紅(1.6％水溶液)約1mL，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。
無菌吸取0.1ml所分離的26個植物乳桿菌菌株培養(yǎng)液，均勻涂布在菌株蛋白酶活性測定培養(yǎng)基與脂肪酶活性測定油脂培養(yǎng)基上。分別于15℃、20℃、25℃培養(yǎng)48h以透明圈直徑與菌落直徑的比值判斷菌株蛋白酶活的大小。確定所選菌株在20℃以上條件下具有蛋白酶活性。
分別無菌吸取0.1mL以適當(dāng)倍數(shù)稀釋的26個植物乳桿菌菌株菌懸液滴加于油脂培養(yǎng)基上，涂布均勻，20℃培養(yǎng)48h，以菌落上或其周圍出現(xiàn)紅色斑點與否判斷君主是否具有脂肪酶活性。測定發(fā)現(xiàn)該菌株無脂肪酶活性。
3.低酸發(fā)酵制品加工用專用植物乳桿菌L1菌株安全性測定采用GB4789.3-94～GB4789.14-94食品微生物學(xué)檢驗規(guī)定的沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸耶森氏菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌檢驗方法檢驗植物乳桿菌L1菌株安全性，確定所選菌株安全無害，不屬于國內(nèi)食品安全所限定的致病菌。
4.低酸發(fā)酵制品加工用專用植物乳桿菌L1菌株種屬鑒定將植物乳桿菌L1菌株經(jīng)過多次純化，然后采用美國BIOLOG公司Microstation型全自動快速微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定該菌株應(yīng)屬于植物乳桿菌。
5.低酸發(fā)酵制品加工用專用植物乳桿菌L1菌株可用性測定對菌株進(jìn)行了耐鹽性、耐亞硝酸鹽性、抑菌活性等特性測定，發(fā)現(xiàn)該菌株具備肉品發(fā)酵劑菌種應(yīng)具備的耐鹽、耐亞硝酸鹽所需特性、具有顯著抑制大腸桿菌、李斯特菌作用。
實施例2、植物乳桿菌L1的發(fā)酵培養(yǎng)1、發(fā)酵培養(yǎng)基的確定將所得植物乳桿菌L1分別在液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁培養(yǎng)基、胡蘿卜汁培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長情況，確定出其基礎(chǔ)培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基。(培養(yǎng)基配方均已公開)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉蛋白胨、乳糖等增殖因子，觀察植物乳桿菌L1菌株在其中的生長情況，通過測定菌株的增殖情況確定出有效的增殖因子，并以此設(shè)計正交試驗，優(yōu)化得到了植物乳桿菌L1菌株的復(fù)合增殖培養(yǎng)基的組成配方為麥芽汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁增殖因子。
2、培養(yǎng)條件的確定將菌株在不同溫度(10～25℃)、不同培養(yǎng)基起始pH值(5.5～7.5)、不同溶氧的條件下恒溫培養(yǎng)，定時取樣測定菌株的活菌數(shù)，確定了植物乳桿菌L1的適宜培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基適宜pH值、溶氧情況及最佳收獲期等培養(yǎng)條件溫度15～25℃，培養(yǎng)基pH值6.5～7.4，搖床培養(yǎng)18～22h后離心收獲菌體。
實施例3、干粉發(fā)酵劑的制備將培養(yǎng)好的菌種離心，去除離心上清液，然后，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥，即可以得到干粉發(fā)酵劑。
凍干過程中的一些優(yōu)化工藝條件確定過程如下1、離心條件的優(yōu)化菌體富集培養(yǎng)后，研究了不同離心溫度(0-25℃)、不同離心轉(zhuǎn)速(3000-7500rpm)、不同離心時間(10～40min)等離心條件對菌株存活率影響，確定植物乳桿菌菌液的適宜離心條件為溫度0～4℃，離心轉(zhuǎn)速6000rpm，離心時間30min。
2、凍干保護(hù)劑配方研究了植物乳桿菌L1菌株在添加甘油、維生素C等單因子保護(hù)劑的情況下凍干存活率的變化；并以篩選出的單因子保護(hù)劑為因素項，通過正交試驗開展了不同保護(hù)劑及其劑量對植物乳桿菌L1菌株凍干存活率的影響，優(yōu)化篩選出了植物乳桿菌菌株凍干保護(hù)劑的配方濃度為12％的脫脂乳中添加蔗糖5％、維生素C0.5％、甘油4％、CaCO33％。(％代表g/100ml)
3、凍干工藝確定凍干過程中，離心濃縮菌體與凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比為0.1-10∶1，優(yōu)選為等質(zhì)量比，在凍干過程中，菌粉干燥至2～5％含水量時停止干燥，以利于保持菌種的活性。
一個具體的操作過程如下將植物乳桿菌菌L1株接種于pH值為7.0的復(fù)合增殖培養(yǎng)基中，接種量為1％，于20℃溫度下?lián)u床培養(yǎng)20h，然后經(jīng)4℃、6000rpm、離心30min后，添加與濃縮菌體等質(zhì)量的凍干保護(hù)劑，置于真空冷凍干燥機(jī)中，于-30℃，絕壓4帕以下干燥24～26h，菌粉含水量降至2.5～3％時停止干燥，即得干粉發(fā)酵劑。
所得干粉發(fā)酵劑活菌的數(shù)量級可達(dá)1010cfu/g；在0～4℃貯存60天后，菌粉活菌數(shù)仍處于同一數(shù)量級，為2.09×1010cfu/g。
權(quán)利要求
1.植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。
2.一種低酸發(fā)酵肉制品加工用的發(fā)酵劑，其活性成分為具有大腸桿菌、李斯特菌抑制活性的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵劑，其特征在于所述發(fā)酵劑中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924的含量達(dá)到1010cfu/g數(shù)量級。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵劑，其培養(yǎng)工藝在于所述發(fā)酵劑是由植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924中加入麥芽汁增殖培養(yǎng)基中在溫度20℃，初始pH值6.5～7.4條件下?lián)u床培養(yǎng)20h后離心收獲菌體。麥芽汁增殖培養(yǎng)基為麥芽培養(yǎng)基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵劑，其離心濃縮工藝條件特征為溫度0～4℃，離心轉(zhuǎn)速6000rpm，離心時間30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵劑，其真空冷凍濃縮工藝特征在于離心濃縮后菌體中加入凍干保護(hù)劑后，經(jīng)真空冷凍干燥制得；真空冷凍干燥工藝體方法為冷阱-30℃，絕壓4帕以下干燥24～26h至菌粉含水量降至2.5～3％時停止干燥，所述凍干保護(hù)劑包含有濃度為12％的脫脂乳中添加2～4％甘油、1～3％維生素c、3～5％蔗糖和3～5％碳酸鈣(％代表g/100ml)保護(hù)因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵劑制備要求，其特征在于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌株L1 CGMCC № 1924培養(yǎng)后離心濃縮菌體與凍干保護(hù)劑的用量為近等質(zhì)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低酸發(fā)酵肉制品加工用的發(fā)酵劑專用菌株及其培養(yǎng)、濃縮、真空冷凍干燥適宜工藝條件與復(fù)合增值培養(yǎng)基、冷凍保護(hù)劑配方。本發(fā)明所提供的低酸發(fā)酵肉制品加工用發(fā)酵劑，其活性成分為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。本發(fā)明通過篩選、純化分離出一株具有高大腸桿菌、李斯特菌抑制活性的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924，將該菌株經(jīng)過復(fù)合增值培養(yǎng)基培養(yǎng)、離心濃縮、加入凍干保護(hù)劑真空冷凍干燥后可制備成活菌量達(dá)到10×10
文檔編號C12R1/25GK101033455SQ20071000336
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者孫寶忠, 賈英民, 田洪濤, 高文霞, 李海鵬, 種京華, 馬愛進(jìn), 楊軍, 馬菊, 張紅梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所