專利名稱：酶法水解蛋白制備磷酸肽和非磷酸肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于乳制品開發(fā)和功能性保健食品技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶法水解酪
蛋白制備磷酸肽(CPP)和非磷酸肽(CNPP)的方法。
背景技術(shù)：
近年來，人類鈣營養(yǎng)不足的問題受到了廣泛的關(guān)注。全世界，尤其是發(fā)展 中國家，鈣缺乏早已是普遍現(xiàn)象，其中最嚴重的是孕婦、兒童和老年人。我國 正常人鈣的推薦量為800mg/d，但是營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果顯示人均鈣攝入量僅為400 mg/d，而兒童和孕婦實際攝入量還不到應攝入量的一半。我國老年人骨質(zhì)疏松 癥發(fā)病率達到30%-50%，兒童佝僂病發(fā)病率高達20%-50%。目前有研究表明， 膳食中攝入充足的鈣可以減少高血壓的發(fā)病率。因此，鈣對不同年齡和性別的 人群都很重要。影響人體鈣吸收的因素很多，除人體自身有吸收障礙問題外， 更重要的是我國的膳食結(jié)構(gòu)是以植物性食品為主，動物性食品為輔的溫飽型膳 食類型，這種膳食類型會造成人體攝入鈣不足。人們一定要注意科學補鈣，CPP 是當之無愧的科學補鈣橋梁。此外，CPP同樣可以結(jié)合其它金屬元素并促成它 們被人體吸收，這更加增添了人們對CPP研究和開發(fā)的興趣。
高血壓是一種高發(fā)病率、高并發(fā)癥、高致殘率的嚴重影響人體健康的"無 聲殺手"。統(tǒng)計表明，發(fā)達國家高血壓患病率在20%以上，面其它國家的發(fā)病率 也在10% 20%。全世界每年的高血壓病死亡率達1200萬。對于高血壓的治療， 目前存在以下錯誤(1)對高血壓的危害認識不夠，不做治療控制；(2)只單 純降血壓，不綜合治療各種危險因素；(3) —發(fā)現(xiàn)高血壓就進行藥物治療，而 不做非藥物治療。研究表明，源于食物蛋白質(zhì)的降血壓肽完全可以克服藥物治 療中出現(xiàn)的種種副作用，它只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者卻無 降壓作用，同時它還有免疫調(diào)節(jié)作用。進一步開發(fā)天然降血壓肽產(chǎn)品是大勢所 趨，它將成為非藥物治療中的重要組成部分。
酪蛋白中富含多種生物活性肽，其中CPP是被研究和開發(fā)最早的一種，具 有結(jié)合礦物質(zhì)(如鈣)的作用。CNPP作為一種天然存在且同時具有潛在抗氧化 活性和抑制ACE活性的物質(zhì)，對高血壓等疾病起到防治效果，無病人群食用可 以有預防保健作用，有病人群食用起到非藥物治療的作用。因此，采用酪蛋白 為原料制備生物活性肽己經(jīng)成為當前的研究熱點。目前，研究者報道了酪蛋白源的ACE抑制肽的分離純化，但未對其功能性 組分的結(jié)構(gòu)予以闡明；研究者還利用包括胰酶、堿性蛋白酶在內(nèi)酶解與膜濾集 成工藝連續(xù)制備酪蛋白生物活性多肽，但其所用酶類種類多、價格貴 (CN1546682);另外有研究者以牛乳酪蛋白為原料、采用蛋白酶水解、離子交 換樹脂脫鹽生產(chǎn)由六肽至十一肽組成的ACE抑制肽(CN1552891)，但其工藝路 線較復雜，冷凍干燥使得成本不菲；還有研究者采用復合蛋白酶酶解酪蛋白制 備酪蛋白磷酸肽(CPP)，但未利用CNPP。
因此，采用價格適宜的蛋白酶水解酪蛋白制備CPP和CNPP，充分提高原 料利用率，既具有很大的經(jīng)濟效益，也具有一定的社會效益。而選擇合適的脫 鹽方式降低多肽產(chǎn)品中的鹽類，以CPP和CNPP產(chǎn)品的推廣利用具有重要的意 義。同時，對于CNPP產(chǎn)品中具有功能性質(zhì)的重要多肽也有必要鑒定其結(jié)構(gòu)， 便于深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶法水解酪蛋白同時制備酪蛋白磷酸肽(CPP)和 酪蛋白非磷酸肽(CNPP)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為以酪蛋白為原料，采用單一堿性蛋白酶Alcalase2.4L 進行控制水解，采用三硝基苯磺酸法監(jiān)控DH值，然后采用乙醇-鈣沉淀法從酪 蛋白水解液中分離CPP和CNPP，同時制備酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽， CPP的部分采用真空干燥得到CPP粉末產(chǎn)品，得率35%以上。CNPP部分采用 納濾濃縮，回收乙醇，采用大孔吸附樹脂脫鹽，然后采用噴霧干燥得到CNPP 粉末產(chǎn)品中，得率45%以上。對CNPP產(chǎn)品中兩種ACE抑制活性肽和一種抗氧 化活性肽予以鑒定，得到其氨基酸序列。工藝為
(1) 溶解在55 65。C條件下，將酪蛋白溶解在ra為8.0 9.0的堿溶液 中，配成質(zhì)量濃度16°/。 20% (m/m)的酪蛋白溶液。
(2) 酶解按1 1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在 55 65。C的溫度下攪拌2 4h，取樣，采用三硝基苯磺酸(TNBS)法監(jiān)控DH值 達到15 2C)，然后升溫至80 85。C，保溫15min滅酶。
(3) 乙醇-鈣沉淀加入1.2% (氯化鈣質(zhì)量/水解液體積)的氯化鈣，再加 入食用級乙醇至乙醇終濃度70% 80%，攪拌30min，靜置過夜，時間在6小時 以上，溫度在30。C以下；靜置分層的方法也可以由3000rpm離心20min替代。
(4) CPP產(chǎn)品的獲得虹吸上清液，下沉部分離心(3000rpm， 15min)，沉 淀部分在45'C下真空干燥得到CPP粉末產(chǎn)品，CPP產(chǎn)品水分含量在4. 5%以下，將上清液合并，為CNPP部分。
(5) 納濾濃縮CNPP與回收乙醇對(4)的酪蛋白非磷酸肽部分以截留相 對分子質(zhì)量為300D的納濾膜進行納濾，得到酪蛋白非磷酸肽納濾濃縮液和回收 乙醇。
(6) 大孔吸附樹脂脫鹽濃縮所得60 150mg/ml濃度的酪蛋白非磷酸肽 以每小時1個床體積的流速上樣到DA201-C大孔吸附樹脂柱，水洗后用70%乙 醇解吸。
(7) 噴霧干燥制得CNPP粉末進出風溫度分別為160 18(TC和70 80 °C，噴霧干燥得到CNPP粉末。
(8) CNPP中ACE抑制活性肽和抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定依次利用體積排阻色 譜S印hadexG-25、離子交換色譜DTF_02、大敢吸附樹脂色譜DA201-C和半制備 型C18RP-HPLC從CNPP中分離得到兩種抑制ACE活性肽和一種抗氧化活性肽。 再采用SE-HPLC、 LC/MS以及氨基酸分析證明這三種肽的氨基酸序列分別為 Tyr-Leu、 Glu-Asp-Val-Pro禾口 His-Ser。
本發(fā)明的有益效果(1)采用單一蛋白酶對酪蛋白進行水解，建立了高效
的酪蛋白酶水解工藝，原料利用率達到90%以上，同時得到CPP和CNPP兩類生 物活性肽，實現(xiàn)低成本、高產(chǎn)出；(2)采用TNBS法監(jiān)控DH值，建立了可行的 水解度監(jiān)測方法，便于控制產(chǎn)物中CPP的產(chǎn)率及N/P摩爾比，減少了產(chǎn)品中的 灰分；(3)采用大孔吸附樹脂和膜分離技術(shù)脫除產(chǎn)品中的鹽分，脫鹽后CNPP與 CPP產(chǎn)品中灰分含量在6呢以下；(4)以CNPP中重要組分的結(jié)構(gòu)予以鑒定，為構(gòu) 效關(guān)系和作用機理研究奠定基礎(chǔ)。利用本發(fā)明提供的CPP與CNPP的制備方法， 提高了酪蛋白的利用率，在經(jīng)濟性和制備規(guī)模上體現(xiàn)其優(yōu)勢。同時產(chǎn)品中重要 功能成分的結(jié)構(gòu)明確，有利于其推廣利用，CPP與CNPP的用途是功能性食品配 料或保健食品。


圖1 CPP與CNPP的制備工藝。
圖2氨基酸分析與質(zhì)譜鑒定CNPP中ACE抑制肽與抗氧化肽的結(jié)構(gòu)。(a) Tyr-Leu; (b) Glu-Asp-Val-Pro; (c) His-Ser。
具體實施例方式
本發(fā)明的方法并非限定于此實施例。
實施例1
在10L夾層反應器中進行酶反應。將5000ml的水加入反應器中，升溫至55°C，然后稱取1000g酷蛋白，攪拌下緩慢加入水中。用2mol/L，取樣用TNBS 監(jiān)測DH。加入60g無水CaCl2，攪拌至完全溶解，然后在攪拌狀態(tài)下緩慢加入食 用乙醇至最終濃度達到70% (v/v)，放置30min，離心(3000rpm， 20min)，沉 淀經(jīng)真空干燥(40°C)制得CPP產(chǎn)品354g。上清液進納濾裝置(納濾膜截留的 相對分子質(zhì)量為300D)濃縮，透過液用于回收乙醇，濃縮(濃度為60mg/ml) 液上DA201-C大孔吸附樹脂色譜柱，水洗脫鹽后用70%乙醇解吸，流速為每小時 一個床體積，水洗時間3小時，解吸時間5小時。噴霧干燥，進風溫度160'C， 出風溫度80 。C ，制得CNPP產(chǎn)品486g。
CNPP樣品配成3(F。的溶液，通過體積排阻色譜S印hadexG-25、 DTF-02離子 交換色譜、大孔吸附樹脂色譜DA201-C和半制備型C18RP-HPLC從CNPP中分離 得到兩種ACE抑制活性肽，采用SE-HPLC、 LC/MS和氨基酸分析對CNPP中的抑 制ACE活性肽進行一級結(jié)構(gòu)鑒定，確其氨基酸序列分別為Tyr-Leu和 Glu-Asp-Val-Pro。
在25L夾層反應器中進行酶反應。將15000ml水加入反應器中，升溫至65 °C，然后稱取3750g酷蛋白，攪拌下緩慢加入水中。用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)PH值 至8. 5，在65。C條件下使酪蛋白全部溶解，加入55mLAlcalase2. 4L，取樣用TNBS 監(jiān)測DH。加入180g無水CaCl2，攪拌至完全溶解，然后在攪拌狀態(tài)下緩慢加入食 用乙醇至最終濃度達到80% (v/v)，靜置過夜，虹吸上層清液后離心 (3000rpm，15min)，沉淀以真空干燥(45°C)制得CPP產(chǎn)品函g。上清液進納 濾裝置(納濾膜截留的相對分子質(zhì)量為300D)濃縮，透過液用于回收乙醇，濃 縮(濃度為150mg/ml)液上DA201-C大孔吸附樹脂色譜柱，水洗脫鹽后用70% 乙醇解吸，流速為每小時一個床體積，水洗時間3小時，解吸時間5小時。噴 霧干燥，進風溫度180。C，出風溫度7(TC，制得CNPP產(chǎn)品1690g。
CNPP樣品配制成25%的溶液，通過體積排阻色譜S印hadex G_25、 DTF-02 離子交換色譜、大孔吸附樹脂色譜DA201-C和半制備型C18RP-HPLC從CNPP中 分離得到兩種ACE抑制活性太，采用SE-HPLC、 LC/MS和氨基酸分析對CNPP中 的抑制ACE活性肽進行一級結(jié)構(gòu)鑒定，確其氨基酸序列分別為His-Ser。
權(quán)利要求
1、一種酶法水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，以酪蛋白為原料，采用單一堿性蛋白酶Alcasase2.4L進行控制水解，采用三硝基苯磺酸法監(jiān)控DH值，然后采用乙醇-鈣分離法從酪蛋白水解液中同時制備酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽，工藝為(1)溶解在55～65℃下，將酪蛋白溶解在PH8.0～9.0的堿溶液中，配成質(zhì)量濃度16％～20％的酪蛋白溶液；(2)酶解按1～1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在55～65℃下攪拌2～4h，取樣，采用三硝基苯磺酸法監(jiān)控DH值達到15～20，然后升溫滅酶；(3)乙醇-鈣沉淀加入氯化鈣質(zhì)量/水解液體積比1.2％的氯化鈣，再加入食用級乙醇終濃度70％～80％，攪拌30min，30℃以下靜置過夜；或3000rpm離心20min分層；(4)酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品的獲得虹吸出上層清液，底部的沉淀部分3000rpm、15min離心，沉淀部分在45℃以下真空干燥得到酪蛋白磷酸肽粉末產(chǎn)品，產(chǎn)品水分含量在4.5％以下；將上清液合并，為酪蛋白非磷酸肽部分；(5)酪蛋白非磷酸肽的納濾濃縮與乙醇回收對(4)的酪蛋白非磷酸肽部分以截留相對分子質(zhì)量為300D的納濾膜進行納濾，得到酪蛋白非磷酸肽納濾濃縮液和回收乙醇；(6)大孔吸附樹脂脫鹽濃縮所得60～150mg/ml濃度的酪蛋白非磷酸肽以每小時1個床體積的流速上樣至DA201-C大孔吸附樹脂柱，水洗后用70％乙醇解吸；(7)噴霧干燥進出風溫度分別為160～180℃和70～80℃，噴霧干燥得到酪蛋白非磷酸肽粉末；(8)酪蛋白非磷酸肽中ACE抑制活性肽和抗氧化活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定依次利用體積排陰色譜SephadexG-25、離子交換色譜DTF-02、大孔吸附樹脂色譜DA201-C和半制備型RP-HPLC從酪蛋白非磷酸肽中分離得到兩種抑制ACE活性肽和一種抗氧化活性肽；再采用SE-HPLC、LC/MS以及氨基酸分析證明這三種肽的氨基酸序列分別為Tyr-Leu、Glu-Asp-Val-Pro和His-Ser。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是酪蛋白磷酸肽的氮/磷摩爾比為20 25: 1，含有原料酪蛋白中95%的磷，酪蛋白磷酸肽得率達到35%，脫鹽后酪蛋磷酸肽產(chǎn)品中灰分含量在6%以下。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酪蛋白非磷酸肽的脫鹽率達到98%，脫鹽過程酪蛋白非磷酸肽回收率達到90%，產(chǎn)品得率達到45%， 脫鹽后酪蛋白非磷酸肽產(chǎn)品中灰分含量在6%以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶法水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，主要以酪蛋白為原料，采用單一堿性蛋白酶Alcalase2.4L進行控制水解，采用三硝基苯磺酸法監(jiān)控DH值，用乙醇—鈣分離法從酪蛋白水解液中同時制備CPP和CNPP。CPP的氮/磷摩爾比為20～25比1，得率35％以上；CNPP得率達到45％；鑒定出CNPP產(chǎn)品中兩種ACE抑制活性肽和一種抗氧化活性肽的氨基酸序列為Tyr-Leu、Glu-Asp-Val-Pro和His-Ser。本發(fā)明酶水解效果好，價格適宜，工藝路線合理，原料利用率高，易于放大，產(chǎn)品CPP和CNPP可廣泛應用于功能性食品配料和保健食品。
文檔編號C12P21/02GK101289685SQ20071002160
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者季萬蘭, 健 蔡 申請人:江蘇梁豐食品集團有限公司