水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的制作方法
【專利說明】
[0001]本申請是基于申請日為2010年9月29日，優(yōu)先權日為2009年9月29日，申請?zhí)?為201080054049. 5 (PCT/IB2010/002589)，發(fā)明名稱為"水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連 接為磷酸-6-甘露糖"的專利申請的分案申請。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2009年9月29日提交的美國系列申請?zhí)?1/246, 847的優(yōu)先權。在 先申請的公開內(nèi)容通過引用全文整合到本文中。
技術領域
[0004] 本申請涉及水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接（linkage)的方法， 更特別的涉及使用甘露糖苷酶水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接，脫帽糖蛋白上的磷 酸-6-甘露糖殘基。
[0005] 背景
[0006]目前研發(fā)中的大部分生物藥（例如，重組蛋白）的生產(chǎn)需要高性能的表達系統(tǒng)。許 多這類生物藥的生物學活性依賴于它們的翻譯后修飾（例如，磷酸化或糖基化）?；诮湍?的表達系統(tǒng)組合了遺傳操作的簡便與能夠分泌和修飾蛋白質的微生物發(fā)酵組合。然而，在 酵母細胞中生產(chǎn)的重組糖蛋白主要表現(xiàn)出異質的高甘露糖和超甘露糖聚糖結構，對蛋白質 功能、下游加工和后續(xù)的治療用途是有害的，特別是當糖基化作用發(fā)揮重要的生物學作用 時。
[0007] 美國系列申請?zhí)?2/062, 469通過引用全文整合。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明至少部分的基于發(fā)現(xiàn)了能夠水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連 接的甘露糖苷酶。藉此，甘露糖苷酶可用于獲得還有脫帽末端甘露糖-6-磷酸殘基的糖蛋 白。本文中描述了獲得此類糖蛋白的體外和體內(nèi)方法。遺傳改造過的細胞可用于方法中， 生產(chǎn)具有脫帽末端甘露糖-6-磷酸殘基的靶分子。
[0010] 在一個方面，本文件的特征是脫帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸殘基的方法。方法包 括提供具有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的寡糖；和將寡糖與能夠水解甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接觸。接觸步驟可以使用純化的甘露糖 苷酶、重組的甘露糖苷酶、含有所述重組的甘露糖苷酶的細胞裂解物，或者含有所述重組的 甘露糖苷酶的真菌細胞來實施。甘露糖苷酶可以包括靶向序列。寡糖可以與蛋白質（例如， 在真菌生物中表達的人蛋白）連接。
[0011] 在另一個方面，本文件的特征是生產(chǎn)具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方 法。方法包括提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸， 所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖；和向所述細 胞導入編碼靶蛋白的核酸，其中所述細胞生產(chǎn)包括所述末端的磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋 白。
[0012] 本文件的特征還是在真菌生物中生產(chǎn)具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的 方法。方法包括：提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核 酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖，且所述 真菌細胞進一步包括編碼靶蛋白的核酸；和分離具有所述末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋 白。真菌細胞進一步包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，和/或經(jīng)過遺傳改 造缺少0CH1活性。
[0013] 本文件的特征還是經(jīng)過遺傳改造生產(chǎn)包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白的 分離的真菌細胞。所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，其中甘露糖苷酶在真菌細胞 中的表達產(chǎn)生了包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白。真菌細胞還可以包括編碼靶糖蛋 白的核酸。
[0014] 在另一個方面，本文件的特征是解脂耶氏酵母、畢赤酵母、多形漢遜酵母、Arxula adeninivorans、甲醇畢赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉細胞的基本純的培養(yǎng)物，其大部 分被遺傳改造為生產(chǎn)包括末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白，所述細胞包括編碼能夠水解 甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。
[0015] 在本文描述的任何實施方案中，真菌生物可以是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)或Arxula adeninivorans。真菌生物可以是甲基營養(yǎng)型酵母，例如畢赤酵 母（Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母（Pichia methanolica)、Oogataea minuta 或多形 漢遜酵母（Hansenula polymorpha)。真菌生物可以是絲狀真菌（例如，選自淺藍灰曲霉 (Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉（Aspergillus candidus)、肉色曲霉（Aspergillus carneus)、棒曲霉（Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉（Aspergillus deflectus)、黃曲 霉（Aspergillus flavus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus)、構巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、赫曲霉 (Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、Aspergillus penicilloides、局限曲霉（Aspergillus restrictus)、醬油 曲霉（Aspergillus sojae)、聚多曲霉（Aspergillus sydowi) > Aspergillus tamari、土 曲霉（Aspergillus terreus)、焦曲霉（Aspergillus ustus)和花斑曲霉（Aspergillus versicolor)的絲狀真菌）。
[0016] 在本文描述的任何實施方案中，蛋白質可以是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因 子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。溶酶體蛋白可以是溶酶體 酶（例如，與溶酶體貯積癥（LSD)相關的溶酶體酶，如酸性a葡萄糖苷酶或a半乳糖 苷酶）。LSD可以是費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積 病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼 曼 -匹克病(FabryJ s disease, mucopolysaccharidosis I, Farber disease, Gaucher disease, GMl-gangliosidosis,Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick disease)、 V型粘多糖?。⊿cheie disease)、II型粘多糖?。℉unter disease)、IV型粘多糖病 (Sanfilippo disease)、莫奎歐氏癥（Morquio disease)、VI 型粘多糖?。∕aroteaux-Lamy disease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝病、甘露糖苷貯積癥、 辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質沉積癥、膽固醇酯沉積 病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積癥、胱氨酸病、唾液酸 1C積功能障礙、具有Marinesco-Sjdgren綜合征的乳糜微滴滯留病、Hermansky-Pudlak 綜合征、Chediak-Higashi綜合征、Danon氏病或Geleophysic發(fā)育不良。例如，LSD 可以是龐貝氏癥或費波瑞病（hyaluronidase deficiency，aspartylglucosaminu ria,fucosidosis, mannosidosis, Schindler disease, sialidosis type 1, Pompe disease,Pycnodysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, Multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucoli pidosis, cystinosis, sialic acid storage disorder, chylomicron retention disease with Marinesco- Sjogren syndrome,Hermansky-Pudlak syndrome, Chediak-Higashi syndrome, Danon disease, or Geleophysic dysplasia. For example, the LSD can be Pompe disease or FabryJ s disease)〇
[0017] 在本文描述的任何實施方案中，對于甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸 側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標丨.5A偏差以內(nèi)。
[0018] 在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以包括與SEQ ID N0:50的1至774 位殘基所述的氨基酸序列或SEQ ID N0:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性（例如， 至少95 %或98 %同一性）的氨基酸序列。
[0019] 在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以包括以下氨基酸序列，所述序列 Pro以外的任何氨基酸；（iiiJXJQGXj^基序，其中l(wèi)ie, Val, Ala, Phe, Tyr或Met,其 中父2是1111'，561'或Asn;或（iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
[0020] 在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以是C.cellulans、天藍色鏈霉菌 (Streptomyces coelicolor)或變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans)的甘露糖苷酶。 [0021] 在本文描述的任何實施方案中，真菌細胞可以進一步包括編碼促進甘露糖基磷酸 化的多肽的核酸（例如，MNN4多肽，如解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、畢赤酵母 或白色念珠菌的多肽）和/或可以經(jīng)過遺傳改造缺少0CH1活性。例如，能夠促進甘露糖基 磷酸化的多肽是畢赤酵母PN01多肽。
[0022] 在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以進一步包括分泌信號和/或靶向 信號，將甘露糖苷酶靶向到胞內(nèi)區(qū)室。靶蛋白和甘露糖苷酶可以是共同分泌的。
[0023] 本文件的特征還是包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的分離的糖蛋白，其中蛋白是由 本文描述的方法生產(chǎn)的。
[0024] 在仍然另一個方面，本文件的特征是包含糖蛋白的組合物，其中糖蛋白上至少 47 %的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖殘基。例如，糖蛋白上至少50 %、75 %、80 %、85 % 或90 %的N-聚糖可具有末端磷酸-6-甘露糖殘基。
[0025] 本文件的特征還是分離的核酸，所述核酸包括SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或SEQ ID NO: 14所述核苷酸序列，或者與 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14至少90%相同的核苷酸序列。本文件的特 征還是這樣的載體，所述載體包括與上述核酸有效連接的啟動子，其中所述核酸編碼甘露 糖苷酶。核酸可以進一步包括分泌信號或靶向信號，將甘露糖苷酶靶向到胞內(nèi)區(qū)室。
[0026] 除非另外定義，則本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等價的方法和材料可用于實踐 或測試本發(fā)明，但下文仍描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、 專利、Genbank?登錄號和其他參考文獻都通過引用全文整合到本文中。在發(fā)生沖突的情 況下，由本申請，包括定義主導。材料、方法和實例都只是示例性的，并非意在限制。
[0027] 根據(jù)下列詳細的說明和權利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點是顯而易見的。
[0028] 本發(fā)明涉及如下項：
[0029] 1、脫帽（uncapping)寡糖上的甘露糖-6-磷酸殘基的方法，所述方法包括：
[0030] A)提供所述具有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的寡糖；和
[0031] B)將所述寡糖與能夠水解所述甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖殘基為磷酸-6-甘露糖 的甘露糖苷酶接觸，其中所述甘露糖苷酶是糖基水解酶家族的92成員。
[0032] 2、項1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQIDN0:50的1至774位殘基或 SEQIDN0:50具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0033] 3、項1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQIDN0:50的1至774位殘基或 SEQIDN0:50具有至少95%同一性的氨基酸序列。
[0034] 4、項1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQIDN0:50的1至774位殘基或 SEQIDN0:50具有至少98%同一性的氨基酸序列。
[0035] 5、項1的方法，其中所述氨基酸序列包括SEQIDN0:50的1至774位殘基或SEQ IDN0:50。
[0036] 6、項5的方法，其中所述氨基酸序列進一步包括，并位于SEQ ID NO: 50的1至774 位殘基或SEQ ID NO: 50的N端，SEQ ID NO: 15的1-15位殘基。
[0037] 7、項2-6任一項的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基 酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標丨.5A偏差以內(nèi)。
[0038] 8、項1-6中任一項的方法，其中所述甘露糖苷酶包括以下氨基酸序列，所述序列 Pro以外的任何氨基酸；（iiiJXJQGXj^基序，其中l(wèi)ie,Val,Ala,Phe,Tyr或Met,其 中父2是1111'，561'或Asn;或（iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
[0039] 9、項1-6的任一項的方法，其中所述接觸步驟是使用純化的甘露糖苷酶、重組的 甘露糖苷酶、含有所述重組的甘露糖苷酶的細胞裂解物，或者含有所述重組的甘露糖苷酶 的真菌細胞來實施的。
[0040] 10、項1-6的任一項的方法，其中所述寡糖與蛋白質連接。
[0041] 11、項10的方法，其中所述蛋白質是在酵母菌生物中表達的人蛋白。
[0042] 12、項11的方法，其中所述酵母菌生物是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica) 或Arxula adeninivorans。
[0043] 13、項11的方法，其中所述酵母菌生物是甲基營養(yǎng)型酵母。
[0044]14、項13的方法，其中所述甲基營養(yǎng)型酵母是畢赤酵母（Pichiapastoris)、 甲醇畢赤酵母（Pichiamethanolica)、0ogataeaminuta或多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)〇
[0045]15、項10的方法，其中所述蛋白質是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因 子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白，其中所述蛋白質在酵母菌或絲狀真菌 中表達。
[0046] 16、項15的方法，其中所述溶酶體蛋白是溶酶體酶。
[0047] 17、項16的方法，其中所述溶酶體蛋白與溶酶體貯積癥（LSD)相關。
[0048] 18、項17的方法，其中所述LSD是費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏 病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、 異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病（Scheie disease)、II型粘多糖 ?。℉unter disease)、IV型粘多糖?。⊿anfilippo disease)、莫奎歐氏癥、VI型粘多糖 ?。∕aroteaux-Lamy disease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝 病、甘露糖苷貯積癥、辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質 沉積癥、膽固醇酯沉積病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積 癥、胱氨酸病、唾液酸貯積功能障礙、具有Marinesco-Sjdgren綜合征的乳糜微滴滯留病、 Hermansky-Pudlak綜合征、Chediak-Higashi 綜合征、Danon 氏病或Geleophysic 發(fā)育不良。
[0049] 19、項17的方法，其中所述LSD是龐貝氏癥或費波瑞病。
[0050] 20、項1-6的任一項的方法，其中所述甘露糖苷酶包括靶向序列。
[0051] 21、生產(chǎn)具有脫帽磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法，所述方法包括：
[0052] 提供經(jīng)過遺傳改造的酵母菌細胞，所述酵母菌細胞包括并表達編碼甘露糖苷酶的 核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖殘基為磷酸-6-甘露糖；和
[0053] 向所述細胞導入編碼靶蛋白的核酸，其中所述細胞生產(chǎn)的所述靶蛋白中，靶上的 甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖殘基已被所述在細胞內(nèi)表達的甘露糖苷酶轉化為磷酸-6-甘露 糖。
[0054] 22、項21的方法，其中所述甘露糖苷酶包括a)與SEQ ID N0:50的1至774位氨 基酸或SEQ ID N0:50具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氨基 酸序列：i)GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala, Ser，Thr或Cys ;ii) VRXE基序，其中X是除 Pro以外的任何氨基酸；（iiiJXJQGXj^基序，其中l(wèi)ie, Val, Ala, Phe, Tyr或Met,其 中父2是1111'，561'或Asn;或（iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
[0055] 23、項22的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈 中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內(nèi)。
[0056] 24、項21-23的任一項的方法，其中所述酵母菌細胞進一步包括編碼能夠促進甘 露糖基磷酸化的多肽的核酸。
[0057] 25、項21-23的任一項的方法，其中所述酵母菌細胞是經(jīng)過改造而缺少0CH1活性 的。
[0058] 26、項21-23的任一項的方法，其中所述甘露糖苷酶是C. cellulans、天藍色鏈霉 菌（Streptomyces coelicolor)或變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans)的甘露糖苷 酶。
[0059] 27、在酵母菌生物中生產(chǎn)具有脫帽磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法，所述方 法包括：
[0060] a)提供經(jīng)過遺傳改造的酵母菌細胞，所述酵母菌細胞包括并表達編碼甘露糖苷酶 的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖為磷酸-6-甘露糖，且所述酵 母菌細胞進一步包括編碼靶蛋白的核酸；所述靶蛋白中的靶上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖殘基已被所述在細胞中表達的甘露糖苷酶轉化為磷酸-6-甘露糖殘基；和[0061]b)分離所述具有所述末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白。
[0062] 28、項27的方法，其中所述甘露糖苷酶包括（i)與SEQ ID N0:50的1至774位氨 基酸或SEQ ID N0:50具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氨基 酸序列：i)GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala, Ser，Thr或Cys ;ii) VRXE基序，其中X是除 Pro以外的任何氨基酸；（iiiJXJQGXj^基序，其中l(wèi)ie, Val, Ala, Phe, Tyr或Met,其 中父2是1111'，561'或Asn;或（iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
[0063] 29、項28的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈 中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5人偏差以內(nèi)。
[0064] 30、項27-29的任一項的方法，其中所述靶蛋白和所述甘露糖苷酶是共同分泌的。
[0065] 31、經(jīng)過遺傳改造生產(chǎn)包含脫帽磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白的分離的酵母菌細 胞，所述酵母菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，其中所述甘露糖苷酶在所述酵母菌細胞 中的表達產(chǎn)生了包含所述末端的磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白，其中所述甘露糖殘基是糖 基水解酶家族的成員92。
[0066] 32、項31的