專利名稱：一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法。
背景技術(shù)：
病毒滅活的研究較多的是涉及動(dòng)物病毒的滅活。滅活的方法主要包括光化學(xué) 法、過(guò)氧化物、醇類、酚類、含氯消毒劑等化學(xué)滅活方法，以及Y射線、加熱法、 巴氏滅活法等物理滅活方法。e-丙內(nèi)酯(P-Propiolactotie)是一種雜環(huán)化合物， 其作用是通過(guò)與嘌呤堿基(主要是鳥(niǎo)嘌呤)反應(yīng)改變核酸結(jié)構(gòu)，達(dá)到滅活的目的。
而同時(shí)它對(duì)蛋白的影響或破壞作用很小。到目前為止，e-丙內(nèi)酯用于植物病毒
的滅活還未有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于該方法采用e-丙內(nèi)酯對(duì)重 組植物病毒進(jìn)行滅活。
上述的重組植物病毒粒子稀釋至濃度不大于1 Ug/Ul的病毒溶液；將所述的P
-丙內(nèi)酯和病毒溶液按1: 1000 1: 500的體積比混合，攪拌混勻，4。C放置72 時(shí)滅活；37°C水浴中放置至e-丙內(nèi)酯完全水解完畢； 上述的重組植物病毒為重組煙草花葉病毒。
上述的重組煙草花葉病毒是采用外源展示法，將外源蛋白插入到煙草花葉病 毒外殼蛋白CP的羧基末端，與CP形成融合蛋白，而形成的重組煙草花葉病毒。
上述的重組煙草花葉病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之間，插入外源 小肽。
上述的滅活方法，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對(duì)重組病毒外源多肽 的后續(xù)利用無(wú)影響。


圖1為不同處理的1 ug/ul病毒接種敏感煙草兩周后，對(duì)新葉總RNA進(jìn)行
RT-PCR檢測(cè)，弓l物分別為Pst(-)和Acc2(+)。若檢測(cè)不到重組病毒基因組條帶，
說(shuō)明病毒已滅活。
Lanel:負(fù)對(duì)照(以1120為模板)
Lane 2:正對(duì)照(以TMV為模板)
Lane 3:正對(duì)照(以TMVS1241為模板)
Lane 4: 1:8000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 5: 1:6000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 6: 1:4000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 7: 1:2000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 8: 1:1000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 9: 1:500 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
圖2.不同處理的lug/ul病毒接種敏感煙草兩周后，對(duì)新葉總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)。若檢測(cè)不到病毒CP特征性條帶，說(shuō)明病毒已滅活。 Lanel: Mock健康煙草 Lane 2:野生型TMV Lane 3:未處理的TMVS1241 Lane 4: 1:8000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 5: 1:6000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 6: 1:4000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 7: 1:2000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 8: 1:1000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 9: 1:500 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
圖3.為不同處理的1 ug/ul病毒接種敏感煙草，接種兩周后煙草新葉的癥狀。 花葉癥狀消失說(shuō)明病毒已滅活。
A: 1:500的e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
B: 1:1000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
C: l:2000e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
D: l:4000e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 E: 1:6000 0 -丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 F: 1:8000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 G:未處理的TMVS1241
圖4.為1:500和1:1000兩個(gè)處理濃度滅活后的TMVS1241盲傳三代，敏感煙草 癥狀圖。若無(wú)花葉癥狀，說(shuō)明病毒已徹底滅活。 A為l:500轉(zhuǎn)接第二代，兩周后癥狀 B為1:500轉(zhuǎn)接第三代，兩周后癥狀 C為1:1000轉(zhuǎn)接第二代，兩周后癥狀 D為1:1000轉(zhuǎn)接第三代，兩周后癥狀
圖5.滅活后的病毒粒子SDS-PAGE分析。融合CP未出現(xiàn)降解條帶，說(shuō)明 重組TMV病毒表達(dá)的外源小肽的完整性未受影響。 Lanel: Mock健康煙草總蛋白 Lane 2:未處理的TMVS1241 Lane 3: 1:500 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane4: 1:1000P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 5: 1:2000 P -丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 6: 1:4000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 7: 1:6000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241 Lane 8: 1:8000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
圖6.滅活后的病毒粒子Western blot分析結(jié)果。融合CP未出現(xiàn)降解條帶，說(shuō)明
重組TMV病毒表達(dá)的外源小肽抗原性未受影響。
Lanel:未處理的TMVS1241
Lane 2: 1:500 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 3: 1:1000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 4: 1:2000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 5: 1:4000 P-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 6: 1:6000 P -丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
Lane 7: 1:8000 e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241
與其他滅活方法相比，本方法體現(xiàn)如下的優(yōu)點(diǎn)(1)本方法不需要復(fù)雜的儀 器、設(shè)備或空間，操作簡(jiǎn)單方便。(2)本發(fā)明方法滅活效果明顯，滅活效率高。
(3) e-丙內(nèi)酯不直接作用于蛋白質(zhì)，對(duì)重組TMV表達(dá)的抗原多肽的完整性和免 疫原性沒(méi)有明顯影響。在不影響目的蛋白抗原活性的前提下，可高效滅活重組粒 子，不會(huì)影響對(duì)外源多肽的后續(xù)的操作。(4) e-丙內(nèi)酯在37。C水解可為高等動(dòng)
物體內(nèi)脂肪代謝產(chǎn)物e-羥基丙酸，對(duì)人體及環(huán)境均無(wú)害。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中所說(shuō)的敏感煙草為野生型TMV可系統(tǒng)感染的煙草品種Mco^ 朋 to6acww cv. Samsun nn。抗性煙草為野生型TMV接種后引起枯斑的煙草品種
to6flo/w cv. Samsun NN。下面實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。
實(shí)施例一
本實(shí)施例采用的外源蛋白S1241是一段長(zhǎng)為12個(gè)氨基酸的小肽，來(lái)自于S ARS病毒S蛋白中一段預(yù)測(cè)可能的抗原決定簇，即1241至1252位的12個(gè)氨基 酸。將其插入到TMV CP蛋白的第152 153位氨基酸之間，之后加入一個(gè)終止 密碼子TAG，與CP形成融合蛋白，而形成重組煙草花葉病毒TMVS1241。插入 的氨基酸序列及對(duì)其進(jìn)行編碼的核苷酸序列具體如下 氨基酸序列DDSEPVLKGVKL 核苷酸序列5，-GACGACTCTGAGCCTGTTCTAAAGGGTGTTAAATTA-3，。 一、重組病毒TMVS1241的制備
1.重組病毒TMVS1241的構(gòu)建按李巧麗等所述方法構(gòu)建(TMV recombinants encoding fUsed foreign transmembrane domains to the CP subunit caused local necrotic response on susceptible tobacco ， Qiaoli Li, Mangmang Li ， Lubin Jiang, Qingqi Zhang, Rentao Song, Zhengkai Xu (2006)， Virology 348:253 — 259)
2.重組病毒TMVS1241粒子的提取
重組病毒TMVS1241感染煙草2—4周后，收取葉片后低溫研磨，低速離心 去除雜質(zhì)，以PEG沉淀。沉淀溶解后再經(jīng)低速離心，去除沉淀雜質(zhì)，上清再以 PEG重復(fù)沉淀，即可獲得高純度的重組病毒粒子(參照D. NOORDAM(1973) Identification of plant virus.的方法)。
二、 P -丙內(nèi)酯對(duì)重組病毒TMVS1241病毒溶液的滅活處理-
1. 將提取的TMVS1241病毒溶液用水或病毒儲(chǔ)存液(10 mM磷酸緩沖液，1 mM EDTA， pH7.0)稀釋為lug/ul。
2. 分別加入終濃度為1:8000， 1:6000， 1:4000， 1:2000， 1:1000， 1:500的P-丙 內(nèi)酯，攪拌混勻，4'C放置72小時(shí)滅活。37°C水浴中放置3小時(shí)，水解P-丙內(nèi) 酯。
3. 重組病毒TMVS1241不同濃度P-丙內(nèi)酯處理后，病毒粒子4'C保存。
實(shí)施例二重組病毒TMVS1241安全檢測(cè)試驗(yàn)
1. 利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)重組病毒TMVS1241基因組。
滅活后TMVS1241接種敏感煙草兩到三周后，提取新生葉總RNA。以引物 Pst (-) : 5'ACGTCTGCAGACTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3，反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物為模板，以引物Pst(-)和引物Acc2(+): 5TAGAGTAGACGACGCAACGGTGGCCATAA3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度55 °C, 25個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物應(yīng)為517bp大小的片段。
RT-PCR的結(jié)果顯示1:1000， 1:500濃度的e-丙內(nèi)酯處理的TMV-S1241接 種的敏感煙草，新生葉中都未檢測(cè)到重組病毒基因組的存在。說(shuō)明重組病毒未感 染煙草，已成功滅活，見(jiàn)圖1。
2. 利用SDS-PAGE方法，檢測(cè)重組病毒的融合CP蛋白。
滅活后TMVS1241接種敏感煙草兩到三周后，提取新生葉片總蛋白，進(jìn)行變 性蛋白電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果如圖2所 示1:1000， l:500濃度的e-丙內(nèi)酯處理的TMVS1241接種的敏感煙草新生葉中，
都未檢測(cè)到重組病毒CP蛋白的存在。說(shuō)明重組病毒未感染煙草，已成功滅活。
實(shí)施例三重組病毒SDS-PAGE及Western blot分析
TMVS1241的總蛋白SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，P -丙內(nèi)酯滅活后，重組 病毒的融合CP未出現(xiàn)降解條帶，說(shuō)明重組TMV病毒表達(dá)的外源小肽的穩(wěn)定性 與完整性未受影響，有利于外源多肽的后期利用。
以抗外源小肽S1241的兔血清為一抗，堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG為 二抗，進(jìn)行蛋白免疫雜交(Westernblot)。結(jié)果見(jiàn)圖6，特異抗S1241小肽的抗 體與各濃度e -丙內(nèi)酯處理后的TMVS1241的CP蛋白都有雜交信號(hào)。Western blot 免疫雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P-丙內(nèi)酯處理后的外源多肽不但結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)仍具 有很好的抗原活性，這對(duì)用作疫苗生產(chǎn)之用的一些重組病毒來(lái)說(shuō)尤為重要。
從安全檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果可以得出，1:1000和l:500的P-丙內(nèi)酯處理的 TMVS1241以1 ug/ul濃度接種敏感煙草，兩周后煙草沒(méi)有出現(xiàn)花葉癥狀；而且在 對(duì)接種兩周后新生葉的RT-PCR檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)有重組病毒基因組的存在， SDS-PAGE膠也沒(méi)有檢測(cè)到重組病毒CP的存在。這說(shuō)明1:1000~1:500濃度范圍的 P -丙內(nèi)酯能夠?qū)χ亟M病毒TMVS1241達(dá)到高效滅活，使其不再具有侵染能力。 同時(shí)Westemblot雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，以外源小肽S1241特異性抗體與經(jīng)滅活處 理的TMVS1241粒子進(jìn)行免疫雜交后，外源小肽S1241不但結(jié)構(gòu)完整，而且仍具 有抗原活性，所以滅活后的重組病毒TMVS1241不僅可以安全的應(yīng)用于外源小肽 的生產(chǎn)，同時(shí)這使得利用外源小肽進(jìn)一步制備的疫苗，在生物工程方面能得到更 為安全的應(yīng)用。
這種方法可以廣泛應(yīng)用到以煙草花葉病毒TMV為載體生產(chǎn)外源小肽，以及 疫苗安全性生產(chǎn)中，有效解決其潛在的生物安全性隱患。
序列表 <110>上海大學(xué)
<120>—種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法 <160> 2 <210> 1 <211> 29 <212> DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221> misc—feature <223> 引物 <400> 1
TAGAGTAGAC GACGCAACGG TGGCCATAA 29
<210> 2
<211> 32
<212〉 DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221> misc一feature
<223> 引物
<400> 2
ACGTCTGCAG ACTGGGCCCC TACCGGGGGT AA 3權(quán)利要求
1.一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于該方法采用β-丙內(nèi)酯對(duì)重組植物病毒進(jìn)行滅活。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于所述的重組植物病毒粒子稀釋至濃度不大于1 Ug/Ul的病毒溶液；將所述的P-丙內(nèi)酯和病毒溶液按l: 1000 1: 500的體積比混合，攪拌混勻，4。C放置72時(shí)滅活；37°C水浴中放置至e -丙內(nèi)酯完全水解完畢。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于所述 的重組植物病毒為重組煙草花葉病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于所述的重組煙草花葉病毒是采用外源展示法，將外源蛋白插入到煙草花葉病毒外殼蛋白 CP的羧基末端，與CP形成融合蛋白，而形成的重組煙草花葉病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法，其特征在于所述的重 組煙草花葉病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之間，插入外源小肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的滅活方法，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對(duì)重組病 毒外源多肽的后續(xù)利用無(wú)影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組植物病毒的化學(xué)滅活方法。本發(fā)明方法采用β-丙內(nèi)酯對(duì)病毒進(jìn)行化學(xué)滅活。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)快捷，重復(fù)性好，滅活病毒的范圍廣，在高效滅活重組病毒粒子的前提下，對(duì)重組病毒外源多肽的后續(xù)利用無(wú)影響。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101096658SQ20071004119
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者宋任濤, 慈云青, 朱廣文, 平 李, 許政暟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)