專利名稱：一種合成聚羥基烷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用富含聚糖菌(GAO)的 活性污泥在厭氧條件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，化學(xué)合成塑料所造成的"白色污染" 變得越來越為嚴(yán)重。目前，塑料垃圾以每年2.5X10、的速度在自然界中積累， 其填埋、焚燒等處理過程中表現(xiàn)出了許多影響環(huán)境的弊端。因此，加強(qiáng)可降解 塑料的研究與開發(fā)，爭(zhēng)取在工藝上取得突破并應(yīng)用于實(shí)際，生產(chǎn)出具有生物可 降解性且價(jià)格合理的塑料制品，對(duì)于環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展都具有重要的現(xiàn)實(shí) 意義。聚羥基垸酸(PHA)是許多原核微生物在不平衡生長條件下，作為胞內(nèi)能 量和碳源貯藏性物質(zhì)而合成的聚酯，是一類可生物降解塑料，不僅具有與化學(xué) 合成高分子材料(如聚丙烯)相似的性質(zhì)，而且還有一般化學(xué)合成高分子材料 所不具有的性質(zhì)，如可完全生物降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性等特 殊性質(zhì)。因此，PHA是合成塑料的理想替代品，具有廣闊的應(yīng)用前景，也引起 了眾多學(xué)者的研究興趣。目前，對(duì)PHA合成方法的研究主要有以下兩個(gè)方向研究最多的一類是通 過野生菌種的篩選、利用基因工程技術(shù)獲得能夠高效合成PHA的菌種以及開發(fā) 有效的發(fā)酵技術(shù)，并通過單一菌株的純培養(yǎng)來收獲PHA，采用此方法，其PHA 最高合成率可達(dá)到細(xì)胞干重的70%以上(例如，文獻(xiàn)Applied and Environment Microbiology, 1998， 64: 4897—4卯3.)。現(xiàn)階段采用此種方法合成PHA在工業(yè) 生產(chǎn)中已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)，如美國Monsanto公司以微生物發(fā)酵方式生產(chǎn)生物可降解 塑料。其生產(chǎn)工藝大多是利用純種微生物，生產(chǎn)原料主要是葡萄糖等價(jià)格昂貴 的有機(jī)底物，在工藝運(yùn)行過程中，要求滅菌消毒，保證發(fā)酵系統(tǒng)無雜菌存在。 因此，這種PHA生產(chǎn)方式與以石油為原料的傳統(tǒng)塑料生產(chǎn)工藝相比成本較高 每公斤PHA生產(chǎn)成本約為9歐元，而每公斤合成塑料僅為1歐元，因而，目前 采用此方法合成的PHA大多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(如，骨骼替代品等)，在日常生 活中的大量使用還不太現(xiàn)實(shí)。為了降低PHA的生產(chǎn)成本，近幾年來國內(nèi)外開始利用混合菌種和多種底物 合成PHA的活性污泥法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究?；钚晕勰嗍菑U水處理系統(tǒng)中自然形成的3微生物與有機(jī)物的聚集體，1974年有人從活性污泥中提取到PHA，為利用活性 污泥生產(chǎn)PHA奠定了基礎(chǔ)(例如，文獻(xiàn)Environmental Science & Technology, 1974， 8: 576 — 583.)。最初對(duì)于胞內(nèi)儲(chǔ)存物質(zhì)的研究僅僅局限在生物除磷范圍 內(nèi)，直到Cech等1993年首次發(fā)現(xiàn)同樣能累積PHA和糖原的聚糖菌(GAO)， 研究者開始意識(shí)到微生物胞內(nèi)儲(chǔ)存代謝的特殊性與重要性(例如，文獻(xiàn)Water Research, 1993， 27 (7): 1219—1225)?；旌暇N多種底物活性污泥法生產(chǎn)PHA 比純菌種單底物的方法更具有現(xiàn)實(shí)可行性?；旌暇N使工藝運(yùn)行簡(jiǎn)單易于操控， 不需要嚴(yán)格的滅菌消毒環(huán)境，節(jié)省了工藝消耗費(fèi)用。多種底物的使用可以從根 本上降低PHA的生產(chǎn)價(jià)格，使底物的選擇從昂貴的單一底物轉(zhuǎn)向了低廉的混合 底物，例如，使用碳源豐富的工業(yè)廢水、市政污水和有機(jī)廢料作為底物。上述 諸多優(yōu)勢(shì)使活性污泥微生物成為PHA合成方法研究中的新寵，國內(nèi)外很多學(xué)者 都對(duì)此方法進(jìn)行了探索和嘗試(例如，中國發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?00510015481.4; 中國發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?8126486.7;文獻(xiàn)Water Science and Technology, 1998， 38 (2): 103_109)。從目前的研究來看，采用這一方法，PHA占細(xì)胞干重的比 例不是很高，且工藝運(yùn)行的最優(yōu)條件也不十分明確，還難以解決PHA大規(guī)模商 業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性問題，所以此方法還有待改進(jìn)。同時(shí)，這些研究多局限于利 用活性污泥中的聚磷菌(PAO)作為合成PHA的微生物，卻忽視了活性污泥中 的GAO同樣具有這一能力。PAO和GAO都是活性污泥中存在的微生物，但到目前為止，還沒有文獻(xiàn)報(bào) 導(dǎo)能夠分離出純的GAO或PAO，但這并沒有影響人們對(duì)其進(jìn)行研究。在文獻(xiàn)中， PAO指的是活性污泥中具有在厭氧條件下釋放磷、合成PHA，好氧條件下過量 吸收磷、分解PHA的一類微生物的總稱；而GAO指的是活性污泥中具有在厭 氧條件下分解糖原、合成PHA、但不釋放磷，好氧條件下積累糖原、分解PHA、 但不過量吸收磷的一類微生物的總稱。GAO具有的微生物學(xué)特征是呈四分體 排列，主要來自于蛋白菌屬(Proteobacteria)的a亞綱以及y亞綱，35%的微生 物呈雜交陽性，Gram染色呈陰性。此外，不像PAO合成PHA時(shí)要求廢水中有 一定量的磷存在，利用GAO合成PHA的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以在污水中磷含量較低 的條件下進(jìn)行。本發(fā)明另辟蹊徑，依據(jù)GAO的代謝規(guī)律，建立了一種利用富集GAO的活 性污泥在厭氧條件下合成PHA的方法。該活性污泥為來源于A/0、 SBR等具除 磷功能的污水處理廠的剩余污泥，由于這些工藝多采用厭氧/好氧交替的方式運(yùn) 行，使其剩余污泥中不僅含有大量的PAO，而且含有GAO，便于從中富集培養(yǎng) GAO。該方法的基本原理是在厭氧條件下，富集GAO的活性污泥微生物利用 降解體內(nèi)糖原所獲得的能量吸收乙酸等揮發(fā)性脂肪酸，并以PHA的形式儲(chǔ)存在 體內(nèi)，能量也隨之轉(zhuǎn)移到PHA中。而在好氧條件下，由于此時(shí)在環(huán)境溶液中缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，但卻存在著氧氣這種電子受體，所以GAO就會(huì)降解體內(nèi)的PHA， 并將產(chǎn)生的電子通過電子傳遞鏈最終傳遞給氧氣，使其還原成H20，在這個(gè)過 程中產(chǎn)生大量的能量，這些能量一部分用于GAO的自身生長，而余下的則在 PHA重新轉(zhuǎn)化成糖原的過程中以糖原的形式儲(chǔ)存起來，以便下次在厭氧條件下 重新被利用。本發(fā)明利用了GAO能在厭氧條件下合成PHA的代謝特點(diǎn)，為解 決PHA的合成問題提供了一種有益的方法。到目前為止，有關(guān)利用富集GAO 的活性污泥在厭氧條件下合成PHA的研究尚未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用富含聚糖菌(GAO)的活性污泥在厭氧條 件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法。一種合成聚羥基烷酸的方法，其中利用污泥中的聚糖菌合成聚羥基烷酸， 步驟如下(a) 采用除磷污水處理廠的剩余污泥在一定條件下富集培養(yǎng)聚糖菌，得到富 含聚糖菌的活性污泥；(b) 富含聚糖菌的活性污泥在厭氧條件下經(jīng)處理合成聚羥基烷酸。(c) 收集、分離含有聚羥基烷酸的聚糖菌，經(jīng)溶劑抽提后處理得到聚羥基烷 酸產(chǎn)物。如上所述的方法，其中所述的GAO呈四分體排列，屬于蛋白菌屬 Proteobacteria的a亞綱以及Y亞綱，35%的微生物呈雜交陽性，Gram染色呈陰 性；其生理代謝特征是厭氧階段不釋放磷、但分解糖原和合成PHA，好氧階 段積累糖原并分解PHA、但不過量吸收磷。如上所述的方法，其中步驟(a)將除磷污水處理廠的活性污泥放入反應(yīng)器 中，加入磷濃度1.3-5mg/L、有機(jī)酸濃度216.7-350mg-COD/L、 pH6.8-8.0的廢水， 在厭氧條件下攪拌反應(yīng)0.5-4h，然后好氧曝氣2-5h，經(jīng)過沉淀和排水后，再加入 0.3-0.8體積新鮮廢水，如此進(jìn)行一天3-6個(gè)周期、每個(gè)周期4-8h的操作。經(jīng)過 l-5個(gè)月的培養(yǎng)后，測(cè)得每周期厭氧末，活性污泥微生物吸收單位有機(jī)酸的磷釋 放量小于0.25mol磷/C-mol乙酸，吸收單位有機(jī)酸的糖原降解量大于0.8C-mol 糖原/C-mol乙酸，據(jù)此可以判斷活性污泥中聚糖菌已成為優(yōu)勢(shì)種群，該污泥即 為富含聚糖菌的活性污泥。如上所述的方法，其中步驟(b)將步驟(a)得到的含有富集聚糖菌的活 性污泥經(jīng)l-5小時(shí)靜置沉淀，取出沉淀物稀釋至濃度1500-4500mg/L，置于反應(yīng) 器中在有機(jī)酸濃度216—2100mg-COD/L，控制進(jìn)水pH值6.4—8.0，氨氮濃度3 一21mg/L，在厭氧條件下攪拌0.5-3h，反應(yīng)結(jié)束后收集含有聚羥基烷酸的聚糖菌體。如上所述的方法，其中步驟(b)中控制進(jìn)水pH在7.6 — 8.0;氨氮濃度為 7mg/L;有機(jī)酸濃度為420-490 mg/L，采用的有機(jī)酸種類為乙酸、丙酸、丁酸 等短鏈脂肪酸；厭氧運(yùn)行時(shí)間為2h;所用的反應(yīng)器為SBR序批式反應(yīng)器。與純種微生物合成PHA相比，本發(fā)明的有益效果是無需滅菌消毒提供無 菌環(huán)境，可有效降低運(yùn)行成本，同時(shí)系統(tǒng)也較穩(wěn)定，為PHA的大規(guī)模工業(yè)化生 產(chǎn)提供了可能。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例作進(jìn)一步詳細(xì)說明，其中PHA的測(cè)定方法參照相關(guān)文獻(xiàn) (Applied Microbiology and Biotechnology, 1978， 6: 29—37)，具體步驟是將 污泥樣品于冷凍干燥機(jī)中干燥至粉末狀，稱取干燥后的污泥粉于裂解瓶中，依 次加入氯仿、硫酸一甲醇和苯甲酸一甲醇溶液，于102'C下裂解數(shù)小時(shí)，待冷卻 后，加蒸餾水離心，取有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜分析。實(shí)施例1GAO的富集培養(yǎng):按文獻(xiàn)(Biotechnology and Bioengineering， 2001， 76(1): 17-31)的培養(yǎng)方法并適當(dāng)改進(jìn)進(jìn)行，即將具除磷功能的城市污水處理廠的剩余 污泥放入有機(jī)玻璃制成的3.5L反應(yīng)器中，加入磷濃度1.3mg/L、乙酸濃度 216.7mg-COD/L、 pH6.8的廢水2.75L,在厭氧條件下攪拌反應(yīng)2h，然后好氧曝 氣3h，經(jīng)過沉淀和排水后，再加入2.75L新鮮廢水，如此進(jìn)行一天3個(gè)周期、 每個(gè)周期8h的操作。經(jīng)過近三個(gè)月的培養(yǎng)后，測(cè)得每周期厭氧末，活性污泥微 生物吸收單位有機(jī)酸的磷釋放量小于0.25mol磷/C-mol乙酸，吸收單位有機(jī)酸的 糖原降解量大于0.8C-mo1糖原/C-mol乙酸，據(jù)此可以判斷活性污泥中聚糖菌已 成為優(yōu)勢(shì)種群，該污泥即為富含GAO的活性污泥，其微生物學(xué)特征是呈四分 體排列，主要來自于蛋白菌屬(Proteobacteria)的a亞綱以及Y亞綱，35%的微 生物呈雜交陽性，Gmm染色呈陰性；其生理代謝特征是厭氧階段基本沒有磷 的釋放、但分解糖原和合成PHA，好氧階段積累糖原并分解PHA、但沒有磷的 過量吸收。PHA的合成方法如下將700ml經(jīng)3小時(shí)靜置沉淀的富含GAO的活性污 泥置于工作容積3.5L的有機(jī)玻璃反應(yīng)器中，并稀釋至污泥濃度約3000mg/L，以 丙酸為碳源(濃度280mg-COD/L)，控制進(jìn)水pH=6.4，氨氮濃度21mg/L，在 厭氧條件下攪拌2h，厭氧結(jié)束時(shí)收集菌體，測(cè)得每克菌體中含PHA35mg。實(shí)施例2GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下改變進(jìn)水pH二7.2，并在厭氧條件下攪拌3h，其余合成條件同實(shí)施例l，測(cè)得每 克菌體中含PHA44 mg。實(shí)施例3GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L，并控制進(jìn)水pH二7.6，在厭氧條件下攪拌0.5h， 其余合成條件同實(shí)施例1，測(cè)得每克菌體中含PHA31mg。實(shí)施例4GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變進(jìn)水pH二8.0，其余合成條件同實(shí)施例l，測(cè)得每克菌體中含PHA69mg。實(shí)施例5GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改為以乙酸和丙酸為碳源(濃度216 mg-COD/L，其中丙酸193mg-COD/L，乙 酸23mg-COD/L)，并控制進(jìn)水pH二6.8，其余合成條件同實(shí)施例1,測(cè)得每克菌 體中含PHA54mg。實(shí)施例6GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改為將GAO置于工作容積1L的燒杯中，并以乙酸和丙酸為碳源(濃度2100 mg-COD/L，其中乙酸1750mg -COD/L,丙酸350mg-COD/L)，控制進(jìn)水pH= 7.6，氨氮濃度7mg/L，其余合成條件同實(shí)施例1，測(cè)得每克菌體中含PHA30mg。實(shí)施例7GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L,并控制進(jìn)水pH二8.0，其余合成條件同實(shí)施例 1，測(cè)得每克菌體中含PHA90mg。實(shí)施例8GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L,并控制進(jìn)水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其余 合成條件同實(shí)施例1，測(cè)得每克菌體中含PHA161mg。實(shí)施例9GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變進(jìn)水pH二6.8，并控制進(jìn)水氨氮濃度3mg/L，其余合成條件同實(shí)施例1，測(cè) 得每克菌體中含PHA 132mg。實(shí)施例10GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下改變丙酸濃度為420 mg-COD/L，并控制進(jìn)水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其余 合成條件同實(shí)施例1，測(cè)得每克菌體中含PHA418mg。實(shí)施例11GAO的富集培養(yǎng)及污泥中PHA的測(cè)定方法見實(shí)施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為490 mg-COD/L，并控制進(jìn)水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其余 合成條件同實(shí)施例l，測(cè)得每克菌體中含PHA 589 mg，采用凝膠滲透色譜測(cè)得 該P(yáng)HA相對(duì)分子質(zhì)量約8X 105，采用差示掃描量熱儀測(cè)得結(jié)晶度約80%。上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用 本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改， 并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此， 本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對(duì)于本發(fā)明 做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種合成聚羥基烷酸的方法，其特征在于利用污泥中的聚糖菌合成聚羥基烷酸，步驟如下(a)采用具除磷功能的污水處理廠的剩余污泥在一定條件下培養(yǎng)富集聚糖菌，得到富含聚糖菌的活性污泥；(b)富含聚糖菌的活性污泥在厭氧條件下經(jīng)處理合成聚羥基烷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚糖菌呈四分體排列，屬 于蛋白菌屬Proteobacteria的oc亞綱以及y亞綱，35 %的微生物呈雜交陽性，Gram 染色呈陰性；其生理代謝特征是厭氧階段不釋放磷、但分解糖原和合成PHA， 好氧階段積累糖原并分解PHA、但不過量吸收磷。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)將除磷污水處理廠的活性污泥放入反應(yīng)器中，加入磷濃度1.3-5mg/L、 有機(jī)酸濃度216.7-350mg-COD/L、 pH6.8-8.0的廢水，在厭氧條件下攪拌反應(yīng) 0.5-4h,然后好氧曝氣2-5h，經(jīng)過沉淀和排水后，再加入0.3-0.8體積新鮮廢水， 如此進(jìn)行一天3-6個(gè)周期、每個(gè)周期4-8h的操作；經(jīng)過l-5個(gè)月培養(yǎng)，測(cè)得每周 期厭氧末，活性污泥微生物吸收單位有機(jī)酸的磷釋放量小于0.25mol磷/C-mol乙 酸，吸收單位有機(jī)酸的糖原降解量大于0.8C-mol糖原/C-mol乙酸，據(jù)此可以判 斷活性污泥中聚糖菌已成為優(yōu)勢(shì)種群，該污泥即為富含聚糖菌的活性污泥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)將步驟(a)得到的富含聚糖菌的活性污泥經(jīng)1-5小時(shí)靜置沉淀，取出 沉淀物稀釋至濃度1500-4500mg/L，置于反應(yīng)器中在有機(jī)酸濃度216 — 2100mg-COD/L，控制進(jìn)水pH值6.4—8.0，氨氮濃度3—21mg/L，在厭氧條件下 攪拌0.5-3h，反應(yīng)結(jié)束后收集含有聚羥基垸酸的聚糖菌體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中控制進(jìn)水pH在7.6-8.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中控制進(jìn)水氨氮濃度 為7mg/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中控制進(jìn)水有機(jī)酸濃 度為420-490 mg/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中采用的有機(jī)酸種類 為C2-C6短鏈脂肪酸，具體包括乙酸、丙酸、丁酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中厭氧運(yùn)行時(shí)間為2h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(b)中所用的反應(yīng)器為SBR 序批式反應(yīng)器。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用富含聚糖菌(GAO)的活性污泥在厭氧條件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法，即通過對(duì)污水處理廠的剩余污泥進(jìn)行培養(yǎng)馴化使GAO得到富集，在序批式反應(yīng)器(SBR)中，以短鏈脂肪酸為碳源，通過控制進(jìn)水pH和氨氮濃度，將富含GAO的活性污泥微生物在厭氧條件下攪拌一段時(shí)間，使其合成PHA。本發(fā)明提供了一種合成PHA的新方法，降低了PHA的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101323864SQ20071004187
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者櫻 姚, 姜亞敏, 陳銀廣, 顧國維 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)