專利名稱：：一種基因打靶用中間載體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種基因打耙用中間載體及其制備方法和用途。技術(shù)背景基因敲除(geneknockout)是利用同源重組(homologousrecombination)技術(shù)原理，按照研究者預(yù)先設(shè)計，在小鼠整體水平上進行的可以時空調(diào)控的滅活特定靶基因的理論和技術(shù)。其廣泛涉及分子生物學(xué)，分子遺傳學(xué)，胚胎學(xué)，實驗動物學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域，是目前研究基因功能最新最權(quán)威的技術(shù)平臺。目前基因敲除的工作大致可分為以下幾步1.設(shè)計并構(gòu)建預(yù)敲除的基因打靶載體(targetingvector);2.將線性化的打靶載體通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細胞(ES細胞)；3.轉(zhuǎn)染ES細胞的體外培養(yǎng)和篩選；4.將篩選出的中靶陽性克隆顯微注射入小鼠囊胚；5.假孕母鼠接受囊胚移植產(chǎn)生出嵌合體小鼠；6.嵌合體小鼠再與囊胚供體小鼠雜交，即可得到雜合型的基因敲除小鼠。從以上實驗步驟不難看出獲得基因敲除小鼠的關(guān)鍵與基礎(chǔ)環(huán)節(jié)是打耙載體的設(shè)計與構(gòu)建，因其是否成功將直接決定基因敲除工作的進行。打靶載體是用于基因組DNA上特定位點的基因重組和突變的DNA分子構(gòu)件。其基本組分是載體骨架；以及基因組DNA上打靶位點兩側(cè)的同源序列，分別稱為左、右兩個同源臂?？紤]到DNA轉(zhuǎn)染和基因打耙都是小概率事件，往往需在載體中組裝正性選擇標(biāo)志(positiveselectionmarker)來選出符合設(shè)計要求的打靶產(chǎn)物。正性選擇標(biāo)志(如對G418有抗性的Neo基因)可選擇出現(xiàn)概率低于萬分之一的穩(wěn)定整合了打靶載體的轉(zhuǎn)染細胞。目前本領(lǐng)域主要采用的是分步法逐步構(gòu)建基因敲除打靶載體。此類方法步驟繁瑣、周期長，并且在構(gòu)建過程中極易出錯，導(dǎo)致了很大的人力、物力的消耗。其大致實驗步驟舉例如下第一步采用PCR方法分別得到左右各3-5kb的同源臂，以及要敲除的位于兩個同源臂之間的待錨定基因外顯子，然后通過TA克隆方法分別將PCR產(chǎn)物裝入TA克隆載體從而獲得待敲除目的基因組片段，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序最終驗證擴增序列的正確性(參見圖1)。第二步將克隆得到的左右同源臂依次裝入pDNR-lr載體中兩個loxp位點兩側(cè)，然后將要敲除的基因或基因外顯子裝入兩個loxp位點之間(如下圖)。由于兩個loxp位點之間含有一個四環(huán)素抗性基因，兩個loxp位點外側(cè)多克隆位點很少，所以，這一步是該種方法的關(guān)鍵，也是最困難的一部分，往往需要花費很長的時間。如果找不到合適的多克隆位點，構(gòu)建打靶載體以及后面的同源重組將無法實現(xiàn)(參見圖2)。第三步將pk-ll載體中的陽性篩選基因裝入第二步中構(gòu)建的帶左右同源臂的載體，并最終獲得帶陽性篩選標(biāo)記，敲除基因外顯子和兩端同源臂的打靶載體(參見圖3)。通過以上介紹，可知因為載體以及載體的多克隆位點的限制加上PCR的不確定性，采用現(xiàn)有方法構(gòu)建基因敲除打靶載體步驟復(fù)雜，耗時長。一般情況下，采用現(xiàn)有方法構(gòu)建打靶載體需要進行反復(fù)的擴增、TA克隆、限制性內(nèi)切酶酶切驗證和測序，花費大量的時間和經(jīng)費。因為構(gòu)建打靶載體成功與否將直接關(guān)系到建立基因敲除小鼠工作的順利進行，為了加快速度，節(jié)省更多的人力物力財力，進一步縮短獲得基因敲除老鼠的實驗周期，本領(lǐng)域需要建立能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷的新技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容為了使建立基因敲除打靶載體的工作速度更快，成本更低，成功率更高，本發(fā)明提供了一種的基因打耙用中間載體。本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供了一種基因打靶用中間載體。該載體含有兩個loxp位點序列和兩端各連接一個frt位點序列的陽性篩選基因。兩端各連接了一個frt位點序列的陽性篩選基因既可以位于兩個loxp位點的上游，業(yè)可以位于其下游。其中，上述的兩個loxp位點序列之間還有一多克隆位點(MCS)。該多克隆位點可以根據(jù)需要打靶的基因序列在現(xiàn)有的多克隆位點中進行選擇。優(yōu)選的，該多克隆位點具有SEQIDNo.4所示的序列。其中，上述的陽性篩選基因也可以在現(xiàn)有的基因打靶常用的陽性篩選基因中選擇。優(yōu)選的，上述陽性篩選基因為pgkNEO基因。進一步的，上述的基因打靶用中間載體還含有抗性篩選基因的序列。上述的抗性篩選基因也可以在本領(lǐng)域常用的抗性篩選基因中選擇。優(yōu)選的，上述抗性篩選基因為AMPr、kan、chl、tet或neo中的至少一種。更進一步的，上述的基因打靶用載體含有SEQIDNo.1所示的序列。SEQIDNo.1所示的序列依次含有由loxp位點序列(SEQIDNo.3)、多克隆位點序列(SEQIDNo.4)、loxp位點序列(SEQIDNo.3)、frt位點序列(SEQIDNo.5)、陽性篩選基因序列(SEQIDNo.6)、frt位點序列(SEQIDNo.5)組成。優(yōu)選的，上述的基因打靶用載體具有SEQIDNo.2所示的序列。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種制備上述的基因打耙用中間載體的方法。該方法包括以下步驟a、利用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI，分步將一個loxp位點，一個frt位點從pk-11載體上切下并裝入pCDNA3.1(+)載體上，克隆獲得pCDNA3.1-frt-loxp;b、利用限制性內(nèi)切酶Sail和BstXI，分步將loxp位點從pCDNA3.1-frt-loxp載體上切下并裝入pGEM-Teasy載體上，克隆獲得pGEM-Teasy-loxp;c、利用限制性內(nèi)切酶Apal，將loxp位點從pGEM-Teasy-loxp載體上切下并裝入pk-11載體上，克隆獲得目標(biāo)載體。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供上述基因敲除用中間載體在制備基因打耙載體中的用途。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種制備上述基因打靶載體的方法。該方法包括以下步驟a、擴增得到待敲除基因或外顯子，通過多克隆位點將待敲除基因或外顯子裝入上述任一項所述的基因敲除用中間載體中，酶切驗證并測序。b、擴增含有待敲除基因或外顯子及其兩端同源臂的基因組DNA片段，通過TA克隆方法將其克隆到TA克隆載體中，并測序驗證。c、利用待敲除基因所選定外顯子兩端的限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過PCR擴增，將步驟a所得載體中含雙loxp位點、待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有步驟b所得的TA載體中，獲得打靶載體。通過對現(xiàn)有技術(shù)的缺點的分析，本發(fā)明首次提出使同時具有雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因的中間載體，以克服上述缺點。只要使用本發(fā)明載體，構(gòu)建基因敲除打靶載體就可以通過簡單的兩步方法完成，而且速度快，簡易，節(jié)約，減少了出錯的可能。本發(fā)明基因敲除用中間載體可以在現(xiàn)有的眾多載體(如pk-ll、pdnr-lr)上進行改建或重頭設(shè)計，其中的各項拼接操作都可以根據(jù)現(xiàn)有的本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)。因打靶用中間載體主要是基因敲除打靶載體本發(fā)明基因打靶用中間載體中起重要作用的幾個元件的序列如下loxp位點(SEQIDNo.3):5，-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3，；frt位點(SEQIDNo.4):5，-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；多克隆位點(SEQIDNo.5):5'-TCGAGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCCCCTCGA-3，。顯然，根據(jù)本發(fā)明提出的構(gòu)建具有雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因的中間載體的思想，是可以用眾多的現(xiàn)有載體為基礎(chǔ)，進行從頭設(shè)計或改建獲得本發(fā)明基因打靶用中間載體，根據(jù)本領(lǐng)域常識，可以選用不同的陽性篩選基因和抗性篩選基因，載體上也可以再連接其它的功能單元，但是只要基因打靶用中間載體上同時具有了雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因，那么都應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的有益效果在于從構(gòu)建打靶載體的根本出發(fā)，在以往實驗方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明首次開發(fā)出了一種能用于基因打靶載體構(gòu)建的中間載體。由于pKDL-HZG載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現(xiàn)階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構(gòu)建系統(tǒng)，而且簡化構(gòu)建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的幾率；節(jié)約時間，降低成本，相對于現(xiàn)有技術(shù)都有很明顯的優(yōu)點，使用范圍廣，具有很好的應(yīng)用市場前景。圖1表示現(xiàn)有技術(shù)的第一階段流程。圖2表示現(xiàn)有技術(shù)的第二階段流程。圖3表示現(xiàn)有技術(shù)的第三階段流程。圖4表示本發(fā)明基因打耙中間載體pKDL-HZG的構(gòu)建示意圖。圖5表示本發(fā)明基因打耙中間載體pKDL-HZG的示意圖。圖6表示使用本發(fā)明基因打耙中間載體構(gòu)建基因打耙載體的第一階段流程。圖7表示使用本發(fā)明基因打耙中間載體構(gòu)建基因打耙載體的第二階段流程。以下結(jié)合具體實施方式進一步說明但并不限制本發(fā)明具體實施方式實施例一、本發(fā)明基因打靶用中間載體的制備因為loxp位點全長僅34bp，最好在兩個lo鄧位點之間插入常用的多克隆位點以便于使用。目前，同時具備兩個loxp位點和常用的多克隆位點的片段尚不存在，只有通過拼接或者直接設(shè)計合成，如直接合成，則費用高昂且不易抄作，現(xiàn)階段很少有公司能直接合成150bp以上的DNA序列。為了節(jié)約資金和減少克隆中帶來的突變，采用拼接的方式，簡要流程參見圖4?，F(xiàn)將方法細述如下l.利用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI，分步將一個loxp位點，一個frt位點從pk-11載體上切下并裝入pCDNA3.1(+)載體上，克隆獲得pCDNA3.1-frt-loxp。酶切體系如下(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xKpnlbuffer10ul10xKpnlbuffer5ulKpnl1ulKpnl1ulPlasmid—pk-1189ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37'C水浴反應(yīng)12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。采用promega公司膠回收試劑盒進行回收。lOxredbuffer10ullOxredbuffer5ulHindIII1ulHindIII1ulPlasmid—pk-ll89ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37。C水浴反應(yīng)12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。采用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4廳ligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(frt-loxp)5ul載體(pCDM3.1)_3ul10ul16'C水浴連接反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，挑取單菌落并酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致，從而獲得pCDNA3.1-frt-loxp克隆。2.利用限制性內(nèi)切酶SalI和BstXI，分步將loxp位點從pCDNA3.1-frt-loxp載體上切下并裝入pGEM-Teasy載體上，克隆獲得pGEM-Teasy-1oxp。酶切體系如下(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xorangebuffer10ul10xKpnlbuffer5ulSail1ulSail1ulPlasmid-pCDNA3.l-frt一loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul37'C水浴反應(yīng)12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。采用promega公司膠回收試劑盒進行回收。10xorangebuffer10ullOxKpnlbuffer5ulBstXI1ulBstXI1ulPlasmid-pCDM3.1-frt-loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul55。C水浴反應(yīng)6小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。采用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(loxp)5ul載體(pGEM-Teasy)_3ul10ul16'C水浴連接反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，挑取單菌落并酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致，從而獲得pGEM-Teasy-loxp克隆。3.利用限制性內(nèi)切酶ApaI，將loxp位點從pGEM-Teasy-loxp載體上切下并裝入pk-ll載體上，最終克隆獲得pKDL-HZG。酶切體系(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xbluebuffer10ul10xbluebuffer5ulApal1ulApal1ulPlasmid-pGEM-Teasy-loxp89ulPlasmid-pk-ll44ullOOul~^Tl37。C水洛反應(yīng)12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。采用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4腿ligase1ul插入片段(loxp)5ul載體(pk-11)_^10ul16'C水浴連接反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，挑取單菌落并酶切驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致，獲得了這一關(guān)鍵的基因敲除用中間載體，將其命名為pKDL-HZG(具有SEQIDNo.l所示的序列)，其結(jié)構(gòu)見圖5。該載體具有雙loxp和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因pgkNEO，而且在雙loxp位點之間插入了多達15個多克隆位點，這更加簡化了插入敲除外顯子的實驗過程。實施例二、使用本發(fā)明基因打靶用中間載體構(gòu)建打靶載體使用實施例一制備的基因敲除用中間載體構(gòu)建小鼠PNAS-4(GENEBANK登錄號NC—000067,位置Chrl:180074587-180086143bp，+strand，全長11.3kb)基因敲除載體以用于敲除小鼠PNAS-4基因。1.采用primer5軟件設(shè)計擴增長鏈基因組DNA以及待敲除外顯子的引物，并遞交invitrogen(上海)公司合成。2.PCR擴增獲得小鼠PNAS-4基因外顯子2(exon2，序列見SEQIDNo.12)，利用引物兩端設(shè)計的酶切位點EcoRI將外顯子2裝入PKDL-HZG載體，酶切所得用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序。獲得片段frt-pgkNE0-frt_1oxp-exon2-1oxp。2.1擴增外顯子2(exon2)片段2.1.1引物上游弓I物A(SEQIDNo-6):5，-gaattcaagtgatagag"cacctgact-3，下游弓I物A(SEQIDNo.7):5，-gaattcaccctgggcaaaetaga-3，2.1.2擴增條件94°C2分鐘94°C30秒；52°C30秒；72°C1分鐘；循環(huán)30次72°C7分鐘4°C°°2.2TA克隆獲得TA-exon22Xr印idligasebuffer5ulPCR產(chǎn)物2ulTA載體0.5ulT4■ligase1ulMilliqH20_1.5ul10ul2.3酶切與連接酶切體系如下(限制性內(nèi)切酶購自fennentas公司)10xEcoRIbuffer5ul10xEcoRIbuffer5ulEcoRI1ulEcoRI1ulPlasmid-TA-exon244ulPlasmid-pkd卜HZG44ul50ul50ul連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4薩ligasebuffer1ulT4DNAligase1ul插入片段(exon2)5ul載體(pkdl-HZG)_3ul10ul2.4酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果正確；陽性克隆送到irwitrogen(上海)公司進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致，驗證正確。酶切驗證體系如下(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul3.PCR擴增獲得11.3KB的長鏈基因組DNA片段，裝入TA克隆載體，釆用酶切，PCR，測序等手段進行驗證。3.1擴增長鏈基因組DNA片段3.1.1引物上游引物B(SEQIDNo.8):5，-gcttactgtcttgetcgtcatg-3，下游引物B(SEQIDNo.9):5，-tcagatggtaggcgttgc-3，3.1.2擴增條件94°C2分鐘94°C30秒；55°C30秒；68°C11分鐘；循環(huán)30次72°C7分鐘4°C°°1.4酶切驗證，結(jié)果正確。酶切驗證體系如下(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul4.利用待敲除外顯子兩端的可以利用的酶切位點BsaBI和SanDI，設(shè)計兩端帶BsaBI和SanDI的引物擴增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段，然后將frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段返裝回TA-長鏈，置換掉長鏈的外顯子2，最終獲得打靶載體。4.1擴增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段4.1.1引物上游弓I物C(SEQIDNo.10):5，-gatacacatcgaattgccgcggtaccg-3，下游弓I物C(SEQIDNo.11):5，-tacgtaggagetccaccgeggt-3，4.1.2擴增條件94°C2分鐘94'C30秒；56°C30秒；72°C3分鐘；循環(huán)30次72°C7分鐘4。C>4.1.3TA克隆10XligasebufferPCR產(chǎn)物TA載體T4DNAligeiseMilliqH20301ul5ul5ul1ul4ul1.4酶切與連接5ul1ul44ul50ul10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-長鏈基因組片段_44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-frt一pgkNE0-frt-loxp-exon2-loxp44ul50ul酶切體系(限制性內(nèi)切酶購自fermentas公司)10xorangebufferBsaBIPlasmid—TA—frt—pgkNE0—frt—loxp—exon2—loxp10xyellowbufferSnaBIPlasmid-TA-長鏈基因組片段5ul1ul44ul50ul連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4■ligasebufferT4DMligase插入片段(frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp)載體(TA-長鏈基因組片段)1ul1ul5ul3ul10ul4.1.5驗證10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-長鏈-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-長鏈-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul所得用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致，表明得到了預(yù)期的打靶載體。由上述實施例可以知道以該載體為基本工具，建立一個新的方法，可將打耙載體的構(gòu)建縮減為兩個主要步驟進行第一階段擴增獲得待敲除基因的外顯子，將待敲除外顯子裝入實施例一制備的的pKDL-HZG中間載體，酶切驗證并測序。同時擴增含有待敲除基因的外顯子兩端同源臂以及敲除外顯子本身的基因組DNA片段通過TA克隆方法分別將其克隆到TA克隆載體中，并測序驗證(參見圖6)。第二階段然后利用待敲除基因所選定外顯子兩端的限制性內(nèi)切酶酶切位點(下圖為A，B)，通過PCR擴增，將包含雙loxp位點，待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有左右同源臂的TA載體，最終獲得打靶載體(參見圖7)。以上實驗路線和實施例二的具體說明清楚的反映了運用該本發(fā)明中間載體來構(gòu)建基因打靶載體的簡易性。時間上，運用該載體大致需要15-30天(見表l)，這大大的縮短了整個基因敲除實驗的總時間，使實驗周期大大縮短。表1使用本發(fā)明中間載體pKDL-HZG構(gòu)建打靶載體的時間分析實驗步驟所用時間1.PCR分別擴增待敲除基因的外顯子；待敲除基因的外顯子兩端同源臂以及敲除外顯子本身的基因組DNA片段，通過TA克隆方法將其克隆到TA克隆載體中約l天2.TA克隆酶切驗證約l天3.送陽性克隆至測序公司測序約5-10天4.測序完畢后將敲除外顯子裝入pkdl-HZG約l天5.將包含雙loxp位點，待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有左右同源臂的TA載體，最終獲得打靶載體約2天6.最后將獲得的打耙載體送測序公司測序測序驗證約5-10天同時，由于pKDL-HZG載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現(xiàn)階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構(gòu)建系統(tǒng)，而且在時間，成本，出錯率上相對于現(xiàn)有技術(shù)都有很明顯的優(yōu)點(見表2)。目前，運用這一載體已經(jīng)成功順利的構(gòu)建了多個打靶載體。表2使用pKDL-HZG載體與使用現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建打耙載體優(yōu)劣比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從上述實例可知，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明首次公開了一種能用于基因敲除打靶載體構(gòu)建的關(guān)鍵中間載體。采用本發(fā)明中間載體能簡化構(gòu)建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的幾率；能從根本上縮短實驗周期減少實驗開支，為整個實驗進程的順利進行打下了堅實的基礎(chǔ)；且使用范圍廣，市場前景廣闊。序列表SEQUENCELISTING<110>四川大學(xué)華西醫(yī)院<120>—種基因打靶用中間載體及其制備方法和用途<130>A070200<160>12<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>2068<212>DNA<213>Artificial<220><223>Artificial<220><221>misc一feature<222>(361)..(361)<223>nisa,c，g,ort<220><221>misc—feature<222>(1384)..(1384)<223>nisa，c,g，ort<220><221>misc一feature<222>(1445)..(1445)<223>nisa，c,g,ort<400>1ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacctgcaggcggccgcg60aattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtc120gggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacga180agttcctatactttctagag肌taggaacttcctcgacggtatcgataagcttctgatgg240aattagaacttggcaaaacaatactgagaatgaagtgtatgtggaacagaggctgctgat300ctcgttcttcaggctatgaaactgacacatttgga肌ccacagtacttag肌ccacaaag360nggg犯tcaag3g肌a肌caatgatcccacgagagatctatagatctatagatcatgagt420gggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgtttaaattatgatatccaactat480gaaacattatcat肌agc肌tagt肌agagccttcagtaaagagcaggcatttatctaat540cccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaaatgtaggtactctgtt600ctcacccttctt肌caaagtatgacaggaaaaacttccattttagtggacatctttattg660tttaatagatcatcaatttctgcagacttacagcggatcccctcagaagaactcgtcaag720aaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgta肌gcacgagg肌780gcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtc840ctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccatt900ttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcatcgccgtc960gggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttc1020gtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcg1080atgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcat1140tgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagc肌ggtgggatgacaggagatcctg1200ccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgac肌cgtcgagcac1260agctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcag1320ttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctga1380cagncgg肌cacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaa1440tagcutttccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatggccga1500tcccatattggctgcaggtcg肌aggcccggagatgaggaagaggag肌cagcgcggcag1560acgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggaccttcgggcgcccgccc1620cgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagccc1680agaaagcgaaggagcaaagctgctattggccgctgccccaaaggcctacccgcttccatt1740gctcagcggtgctgtccatetgcacgagactagtgagacgtgctacttccatttgtcacg1800tcctgcacgacgcgagctgcggggcggggggg肌cttcctgactaggggaggagtagaag1860gtggcgcgaaggggccaccaaagaacggagecggttggcgcctaccggtggatgtggaat1920gtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgcc肌gtgcccagcggggctgcta肌gcgc1980atgctccagactgccttgggaaaagcgcctcccctacccggtagaattggccgcg肌gtt2040cctatactttctagagaataggaacttc2068<210>2<211>4967<212>DNA<213>Artificial<220><223>artificial<220><221>misc_feature<222>(1037)..(1037)<223>nisa，c，g，ort<220><221>misc_feature<222>(2060)..(2060)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc—feature<222>(2121)..(2121)<223>nisa，c，g，ort<400>2ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtt狄gcgcagcgtga60ccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcg120ccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgat180ttagtgctttacggcacctcgaccccaa肌肌cttgattagggtgatggttc狄gtagtg240ggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaata300gtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatt360tat肌gggattttgccgatttcggcctattggtta肌aaatgagctgattt肌caa通aat420ttaacgcgaa簡aacaaaatatt肌cgcttacaatttccattcgccattcaggctgcg480caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600t肌aacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcg肌ttgccgcggta660ccgggceecccctcgaat肌cttcgtat肌tgtatgctatacg肌gttattcgaggtega720cctgcaggcggccgcgaattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggcc780gggagcatgcgacgtcgggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagt840tattcgaggtcgacgaagttcctatactttctagagaataggaacttcctcgacggtatc900gataagcttctgatggaattagaacttggc肌aacaatactgagaatgaagtgtatgtgg960aacagaggctgctgatctcgttcttcaggctatgaaactgacaca付tggaaaccacagt1020acttagaaccacaaagnggg肌tcaagagaaaaacaatgatcccacgagagatctataga1080tctatagatcatgagtgggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgt"aaat1140tatgatatcc肌ctatga肌cattatcata肌gc肌tagtaaagagccttcagta肌gag1200caggcatttatctaatcccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaa1260atgtaggtactctgttctcacccttcttaacaaagtatgacaggaaaaacttccatttta1320gtggacatctttattgtttaatagatcatc肌tttctgcagacttacagcggatcccctc1380agaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgatac1440cgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacggg1500tagcc肌cgctatgtcctgatagcggtccgccac狄ccagccggccacagtcgatg肌tc1560cagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacga1620cgagatcatcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcga1680gcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtac1740gtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcg肌tgggcaggtagccggatc肌gcg1800tatgcagccgccgeattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtggg1860atgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtccctteccgcttcag1920tgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcg1980ctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgaca肌aag肌ccg2040ggcgcccctgcgctgacagncggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtg2100cccagtcatagccgaatagcntttccaccc肌gcggccggag肌cctgcgtgc肌tccat2160cttgttcaatggccgatcccatattggctgcaggtcgaaaggcccggagatgaggaagag2220gagaacagcgcggcagacgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggac2280cttcgggcgcccgccccgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagcccagaaagcg肌ggagc肌agctgctattggccgctgcccc肌agg2400cctacccgcttccattgctcagcggtgctgtccatctgcacgag狄tagtgagacgtgct2460acttccatttgtcacgtcctgcacgacgcgagctgcggggcgggggggaacttcctgact2520aggggaggagtag肌ggtggcgcg肌ggggccaccaaagaacggagccggttggcgccta2580ccggtggatgtgg肌tgtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgccaagtgcccagc2640ggggctgcta肌gcgcatgctccagactgccttggga肌agcgcctcccctacccggtag2700aattggccgcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggccgccaccgcggtg"60gagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtc2820atagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccgg2880aagcata肌gtgt肌agcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgtt2940gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcgg3000ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactga3060ctcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagetcaetcaaaggcggtaat3120acggttatccacagaatcaggggataacgcagg汪a級gaacatgtgagcaaaaggcc級gca3180肌aggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctcegcccccc3240tgacgagcatcacaaa級atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactata3300aagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgcc3360gcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctc3420acgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacga3480accccccg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技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種基因打靶用中間載體及其制備方法和用途。基因打靶用中間載體含有兩個loxp位點序列和兩端各連接一個frt位點序列的陽性篩選基因。本發(fā)明從構(gòu)建打靶載體的根本出發(fā)，在以往實驗方法的基礎(chǔ)上，首次開發(fā)出了一種能用于基因敲除打靶載體構(gòu)建的中間載體。由于該載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現(xiàn)階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構(gòu)建系統(tǒng)，而且簡化構(gòu)建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的幾率；節(jié)約時間，降低成本，相對于現(xiàn)有技術(shù)都有很明顯的優(yōu)點，使用范圍廣，具有很好的應(yīng)用市場前景。文檔編號C12N15/63GK101397570SQ20071005016公開日2009年4月1日申請日期2007年9月29日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者呂小巖,欽周,錚張,胡忠國,魏于全申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院