專利名稱：硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對硫酸鹽還原菌這種非嚴格厭氧菌進行分離及提純的一種新方法，本方法定名為平板噴霧分離法。此方法采用API固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，主要用于提取硫酸鹽還原菌純菌種，并從多個純菌種菌株中挑選出生物活性最強的菌株。此法也可推廣到其它耐氧型、兼氧型和非嚴格厭氧型細菌純菌種的提取，但不適合嚴格厭氧菌。
背景技術(shù)：
細菌純菌種的分離及純化是指將混雜在一起的不同種類的微生物分離開來以得到生產(chǎn)和研究所需要的單一菌種，這需要特殊的分離方法。微生物純菌種的提取是微生物工業(yè)應(yīng)用和研究的關(guān)鍵技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于微生物防腐、污水處理、礦物提冶、食品工業(yè)、醫(yī)藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域。傳統(tǒng)上，細菌純菌種的分離及純化主要采用十倍稀釋分離法、平板劃線法、倒平板和平板涂布法、穿刺分離法、單細胞分離法和超微膜分離法等。但是這些方法往往涉及工藝精細、程序繁瑣、尤其要求操作人員有相當高的、熟練的操作水平，給微生物純菌種的提取造成很大的困難和不便。目前，針對硫酸鹽還原菌分離和純化的通用方法采用的是穿刺分離法即用注射器抽取雜菌菌液，將針頭刺入固體培養(yǎng)基中一定深度，注射菌液，然后延原路拔出針頭，然后加液體石蠟對培養(yǎng)基進行厭氧密封，固體培養(yǎng)基在厭氧環(huán)境中進行恒溫培養(yǎng)，最終在沿針頭的部位長出單個的純培養(yǎng)菌落。這種方法操作難度大，往往需要控制好固體培養(yǎng)基中的瓊脂含量、注射菌液數(shù)量，還要創(chuàng)造厭氧環(huán)境，且挑取單個菌落非常困難，提取成功率極低。此種方法是基于傳統(tǒng)上對硫酸鹽還原菌的生理特性的誤解而產(chǎn)生的，早期通常認為硫酸鹽還原菌是嚴格厭氧菌，但近期的文獻表明，硫酸鹽還原菌有較強的耐氧能力，能夠在空氣中進行正常的生命活動。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種菌種提取準確、方法簡便易行、成功率高的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法。
本項發(fā)明的技術(shù)路線是在保證快速、準確、簡便地獲得硫酸樣還原菌的單個純培養(yǎng)菌落的前提下，采用平皿固體培養(yǎng)基作為細菌生長的載體，用帶針頭的注射器將菌液以霧狀噴濺在培養(yǎng)基的表面，以獲得單個的細菌附著在培養(yǎng)基表面，經(jīng)恒溫恒濕無菌環(huán)境下培養(yǎng)，獲得有單個細菌繁殖的菌落，然后挑取單個菌落放入液體培養(yǎng)基中繁殖，最終獲得大量的、生物活性良好的，單一硫酸鹽還原菌的純菌種。具體技術(shù)方按是一種硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，是在有氧環(huán)境下提取和培養(yǎng)出硫酸鹽還原菌純菌種并以挑選出生命活性最強的純化菌種作為二次分離及純化的菌種，具體工藝步驟如下
a)將選用的硫酸鹽還原菌專性液體培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境中加熱至即將沸騰時，加入適量瓊脂后攪拌均勻，然后冷凝為固態(tài)；b)在無菌環(huán)境中，首先將裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理后抽取一段空氣，然后將含菌空氣以霧狀均勻噴射到固體培養(yǎng)基的表面，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)出菌落，在其中挑取單個菌落，放入滅菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出活性最好的硫酸還原菌純化菌種；c)以硫酸還原菌純化菌種為菌種，再按菌種的一次分離及純化步驟重復進行一次分離及純化，所得的液體培養(yǎng)基即是所要獲得的硫酸還原菌的純菌種。
所說的硫酸鹽還原菌專性液體培養(yǎng)基按成分稱量、配制、并調(diào)節(jié)PH值到中性略呈微堿性后，裝入經(jīng)滅菌處理的錐形瓶中加熱；所說的冷凝過程是在無菌環(huán)境中，將含瓊脂的培養(yǎng)基趁熱加入到平皿中，加入量不超過平皿深度的1/3，然后冷卻凝固為待用的固體培養(yǎng)基。
所說的裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理是用無菌注射器并裝上針頭，從含有雜菌的硫酸還原菌菌種中抽取適量菌液，然后再將菌液注射回菌種瓶中，排空菌液，使注射器和針管被硫酸還原菌污染。
所說的恒溫培養(yǎng)箱中溫度約37℃。
是所說的滅菌的液體培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基中加入滅菌的硫酸亞鐵銨和抗壞血酸。
本發(fā)明提供方法直接對固體培養(yǎng)基表面進行菌液噴霧附著，直接在有氧環(huán)境中進行操作和培養(yǎng)，結(jié)果表明此方法菌種提取準確、方法簡便易行、成功率極高。


圖1采用平板噴霧分離法和傳統(tǒng)的穿刺分離法獲得的菌落的對比。
圖2透射電鏡下的硫酸鹽還原菌的形貌。
具體實施例方式
下面結(jié)合實例進一步說明本發(fā)明的具體內(nèi)容及其實施方式。
1.分離及純化所需的設(shè)備和原材料設(shè)備及器皿潔凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高溫高壓滅菌鍋、電爐、加熱用石棉墊、培養(yǎng)皿、接種針，玻璃棒，酒精燈，2ml注射器及針頭。
材料美國石油協(xié)會(API)推薦的SRB專用培養(yǎng)基，瓊脂粉，含雜菌的硫酸還原菌菌種。
2.分離和純化的技術(shù)要點(1)API液體培養(yǎng)基的配制將API液體培養(yǎng)基按成分稱量、配制、并調(diào)節(jié)PH值到中性略呈微堿性后，將API液體培養(yǎng)基裝到一個錐形瓶中，然后利用電爐(上加石棉墊)加熱，待到即將沸騰時，加入適量瓊脂粉，用玻璃棒攪拌均勻，然后用棉塞塞好，包上牛皮紙后放入到高溫高壓滅菌鍋中準備滅菌。
(2)玻璃器皿滅菌將培養(yǎng)皿、注射器和針頭分別用牛皮紙包好放入到高溫高壓滅菌鍋中準備滅菌。
(3)滅菌采用美國石油協(xié)會推薦的標準滅菌方法。
(4)API固體培養(yǎng)基的配制打開潔凈工作臺的紫外線滅菌燈將工作臺滅菌一定時間，點燃酒精燈，將滅菌鍋內(nèi)的物品取出放入工作臺中，趁熱將瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，加入量不超過平皿深度的適當位置，然后冷卻，培養(yǎng)基凝固后待用。
(5)純菌種的分離和純化操作在潔凈工作臺中進行，并點燃酒精燈a.取出注射器并裝上針頭，從活化后含有雜菌的硫酸還原菌菌種中抽取適量的菌液，然后再將菌液注射回菌種瓶中，排空菌液。其目的是使注射器和針管被硫酸還原菌污染。
b.用針管抽取一段空氣，然后將針頭對準平皿培養(yǎng)基的上方，針頭距培養(yǎng)基表面一定的距離，然后推動針管，將含菌空氣以霧狀噴射倒固體培養(yǎng)基的表面。
c.反復重復步b，在固體培養(yǎng)基的其它表面上噴射，以獲得個體特征明顯的純菌種菌落。
d.蓋上培養(yǎng)皿皿蓋，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出單個菌落。
(6)待長出單個菌落后，在潔凈工作臺中用無菌接種環(huán)分別挑取單個菌落，放入滅菌液體API培養(yǎng)基中，分別進行37℃恒溫培養(yǎng)。
(7)挑選出生命活性最強的純化菌種液體培養(yǎng)基最先完全變黑的即為生命活性最強的硫酸還原菌純化菌種。
(8)然后以活性最強的硫酸還原菌純化菌種為菌種，重復步驟(1)～(6)，再進行一次純化，所得的液體培養(yǎng)基即是所要獲得的硫酸還原菌的純菌種。
實例1采用平板噴霧分離法，對含有雜菌的硫酸鹽還原菌菌種進行分離及純化。另外采用穿刺法進行對比(參閱圖1)。結(jié)果表明用平板噴霧分離法這種新方法進行分離及純化的菌落分散，菌落呈單個分布，容易識別，容易提??；而采用傳統(tǒng)的穿刺分離法獲得的菌落連成一體，很難挑選單個的純培養(yǎng)菌落。小菌落個體較大，很難說明是由單個細菌繁殖而成的。因此使用新的方法的進行菌種的分離和純化的準確率、效率和成功率遠遠高于傳統(tǒng)的穿刺分離法。用新方法分離和純化的硫酸鹽還原菌純菌種，經(jīng)硫酸亞鐵銨鑒別、H2S氣體鑒別，普通染色法鑒定，革蘭氏陰性菌鑒定，透射電鏡下形貌鑒定(參閱圖2)等多種方法綜合鑒定，結(jié)果表明用新方法分離和純化的菌種確系硫酸鹽還原菌的純菌種。
實例2采用平板噴霧分離法，對含有雜菌的干酪乳桿菌菌種進行分離及純化，準確地獲得了干酪乳桿菌的純菌種。與平板劃線法相比，使用平板噴霧分離法提取菌種的準確率、成功率及工作效率要優(yōu)于后者。
實例3采用平板噴霧分離法，對含有雜菌的米根霉菌菌種進行分離及純化，準確地獲得了米根霉菌的純菌種。與平板劃線法相比，使用平板噴霧分離法提取菌種的準確率、成功率及工作效率要優(yōu)于后者。
權(quán)利要求
1.一種硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，其特征是在有氧環(huán)境下提取和培養(yǎng)出硫酸鹽還原菌純菌種并以挑選出生命活性最強的純化菌種作為二次分離及純化的菌種，具體工藝步驟如下a)將選用的硫酸鹽還原菌專性液體培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境中加熱至即將沸騰時，加入適量瓊脂后攪拌均勻，然后冷凝為固態(tài)；b)在無菌環(huán)境中，首先將裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理后抽取一段空氣，然后將含菌空氣以霧狀均勻噴射到固體培養(yǎng)基的表面，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)出菌落，在其中挑取單個菌落，放入滅菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出活性最好的硫酸還原菌純化菌種；c)以硫酸還原菌純化菌種為菌種，再按菌種的一次分離及純化步驟重復進行一次分離及純化，所得的液體培養(yǎng)基即是所要獲得的硫酸還原菌的純菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，其特征是所說的硫酸鹽還原菌專性液體培養(yǎng)基按成分稱量、配制、并調(diào)節(jié)PH值到中性略呈微堿性后，裝入經(jīng)滅菌處理的錐形瓶中加熱；所說的冷凝過程是在無菌環(huán)境中，將含瓊脂的培養(yǎng)基趁熱加入到平皿中，加入量不超過平皿深度的1/3，然后冷卻凝固為待用的固體培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，其特征是所說的裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理是用無菌注射器并裝上針頭，從含有雜菌的硫酸還原菌菌種中抽取適量菌液，然后再將菌液注射回菌種瓶中，排空菌液，使注射器和針管被硫酸還原菌污染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，其特征是所說的恒溫培養(yǎng)箱中溫度約37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，其特征是所說的滅菌的液體培養(yǎng)基為在培養(yǎng)基中加入滅菌的硫酸亞鐵銨和抗壞血酸。
全文摘要
硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法涉及對硫酸鹽還原菌這種非嚴格厭氧菌進行分離及提純的一種新方法，本方法適用于微生物防腐、污水處理、礦物提冶、食品工業(yè)、醫(yī)藥品生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域和實驗研究領(lǐng)域。在保證快速、準確、簡便地獲得硫酸樣還原菌的單個純培養(yǎng)菌落的前提下，采用平皿固體培養(yǎng)基作為細菌生長的載體，用帶針頭的注射器將菌液以霧狀噴濺在培養(yǎng)基的表面，以獲得單個的細菌附著在培養(yǎng)基表面，經(jīng)恒溫恒濕無菌環(huán)境下培養(yǎng)，獲得有單個細菌繁殖的菌落，然后挑取單個菌落放入液體培養(yǎng)基中繁殖，最終獲得大量的、生物活性良好的，單一硫酸鹽還原菌的純菌種。本方法的分離及純化的準確率、效率要高于傳統(tǒng)的細菌分離及提純的方法。
文檔編號C12N1/02GK101050438SQ200710055389
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者方世杰, 劉耀輝, 王強, 蔣磊, 于思榮 申請人:吉林大學