專利名稱：一種高效分離純化10－去乙酰基巴卡亭ⅲ(10－dabⅲ)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于從紅豆杉中提取藥用物質(zhì)的技術(shù)，特別是對紅豆杉中提取的半成品10-去乙?；涂ㄍII(解寫為10-DAB III)再進(jìn)行分離純化成為高純度精品的方法。
背景技術(shù)：
10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB III)作為紅豆杉樹種中主要存在的一個結(jié)構(gòu)單體，可以作為半合成抗腫瘤藥物紫杉醇和多西紫杉醇的前體。紫杉醇和多西紫杉醇在臨床上已經(jīng)被用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治療，其療效好，毒副作用小，逐步成為抗腫瘤一線藥物。隨著癌癥病人的逐年增多，對紫杉醇和多西紫杉醇的需求日益加劇，對其原料的需求更甚。以往獲得紫杉醇都是采用天然紅豆杉的木質(zhì)中提取分離，而用木質(zhì)提取需要砍伐紅豆杉，由于紅豆杉樹資源的局限性和提取成本偏高等不利因素嚴(yán)重阻礙行業(yè)的發(fā)展。為了更好的滿足市場，目前，半合成獲取紫杉醇和多西紫杉醇已經(jīng)成為大部分制藥企業(yè)獲得原料的首選模式，而半合成最重要的前體物就是10-DAB III，它廣泛分布于多種類型的紅豆杉枝葉中，枝葉本身就是可再生資源，所以如何高效快捷低成本的從紅豆杉枝葉中提取分離出高純度的10-DAB III中間體成為行業(yè)焦點。
目前，針對10-DAB III提取分離的文獻(xiàn)和專利有很多，基本上都是采用提取、分離、結(jié)晶三個步驟，而真正影響產(chǎn)品得率和純度的主要還是分離和結(jié)晶這兩個步驟。常規(guī)都采用甲醇或酒精進(jìn)行浸泡提取，然后萃取濃縮，將初步得到的10-DAB III粗品進(jìn)行硅膠柱層析分離，最后重結(jié)晶得到一定純度的合格品。通常，各個廠家提取得率都能達(dá)到95％左右，而影響純品10-DAB III最終得率的主要還是分離和結(jié)晶步驟。隨著市場的競爭和溶劑成本的增加，如何簡化分離純化工藝，快捷的得到高質(zhì)量的10-DAB III，并盡可能少的利用有機(jī)溶劑成為控制成本的主要思路。
中國專利申請?zhí)?2136678公開了從乙醇提取過的紅豆杉枝葉殘渣中提取10-DABIII的方法，并采用了正相制備色譜進(jìn)行分離得到純品10-DAB III，該分離純化方法中雖然提到了的制備液相色譜分離過程，但所采用的溶劑體系和梯度洗脫手段在規(guī)?；a(chǎn)中顯得工藝復(fù)雜，分離效率無法在生產(chǎn)實際中真正提高，且有溶劑消耗大等缺點。因為10-DAB III被提取到一定純度的情況下，在常規(guī)溶劑里的溶解能力降低，該專利中提到的用乙酸乙酯實際不能很好的溶解半成品10-DAB III，因為要產(chǎn)業(yè)化利用制備液相色譜進(jìn)行分離必須要找到更適合的洗脫劑體系。
此外，中國專利公開號CN1473821A公開了一種提取10-DAB III的方法，該項專利里面采用常規(guī)的硅膠層析分離提取處理出的半成品10-DAB III，該方法耗費時間，溶劑消耗量大，因為常規(guī)硅膠的不可逆吸附，硅膠循環(huán)利用率低下，廢物排放多，也很容易造成得率的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效分離純化半成品10-DAB III，從而得到高純度的10-DAB III的方法。
該方法利用先進(jìn)的直徑超過100mm的制備液相色譜高效分離系統(tǒng)，在球形硅膠作為固定相的情況下，通過獨特的用四氫呋喃溶解和四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作為洗脫溶劑體系，進(jìn)行精確分離含量范圍在20％-60％之間的半成品10-DAB III，得到的10-DAB III純品含量超過99％。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)四氫呋喃對10-DAB III獨特的溶解性能，并應(yīng)用到高效制備液相色譜分離中，因為四氫呋喃良好的溶解性能，改善了10-DAB III在制備液相色譜中得分離度和分離峰型，提高了產(chǎn)品得率和純度，整體溶液需求量大大減少。整體分離過程真正實現(xiàn)了高效、低成本、環(huán)保，是產(chǎn)業(yè)化的最佳工藝路線。
本發(fā)明高效分離制備用的四氫呋喃和正己烷均為分析純，經(jīng)過一次重蒸并過濾。所用甲醇因為用量不大，分析純即可。
所采用的液相分析色譜儀來自北京創(chuàng)新通恒科技有限公司P3000型，分析柱采用kromasil品牌的C18(4.6mm×250mm，5um)，柱溫為37℃，流動相條件為乙腈+水(35+65)，流速為1ml/min；制備型液相色譜分離系統(tǒng)由北京創(chuàng)新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有限公司聯(lián)合提供，制備柱為動態(tài)軸向壓縮裝置。選用球形硅膠色譜填料來自日本Fuji公司，顆粒大小為25-40um，孔徑大小為70A。所裝填的分離柱有效分離長度為35-40公分，分離柱效理論塔板數(shù)超過1.5萬。
在上述技術(shù)方案中采用的原料為從紅豆杉枝葉中初步提取得到的半成品10-DAB III，含量范圍通常在20％-60％之間，該原料可以自己提取得到，也可以由市場購買。半成品10-DAB III原料主要雜質(zhì)都是和10-DAB III類似的大極性物質(zhì)，該含量范圍的原料通過本發(fā)明方法一次性分離純化，即可高效快捷的得到純度超過99％的10-DAB III純品。
在上述技術(shù)方案所提到的高效分離過程主要包括以下幾個步驟得以實現(xiàn)一、樣品溶解將含量范圍在20％-60％之間的半成品10-DAB III原料，用重蒸過的四氫呋喃溶解，1克半成品10-DAB III原料用5-8毫升四氫呋喃溶解。溶解過程采用50℃-60℃的水浴加溫攪拌，可以利用超聲波加速溶解過程。溶解完成后，選用0.45um孔徑的有機(jī)相過濾膜進(jìn)行過濾，過濾好的樣品液轉(zhuǎn)移到燒杯里，并擱置在40℃-50℃的水浴里進(jìn)行保溫，獲得原料與四氫呋喃溶液作為分離純化步驟的進(jìn)樣備用。
二、分離純化采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液，作為原料四氫呋喃溶液洗脫分離10-DAB III的流動相。流動相的洗脫分離能力與四氫呋喃和正己烷的比例有關(guān)。經(jīng)實驗分離洗脫劑中，甲醇、四氫呋喃、正己烷的體積比是，甲醇 1-----3％四氫呋喃 20-35％正己烷 64---78％通常需要保證10-DAB III在40-60分鐘由制備色譜柱里面被洗脫出來。同時，根據(jù)室溫的不同變化，產(chǎn)品被洗脫出來的時間也有變化，為了保證分離效果，流動相的洗脫極性都需要有所調(diào)整，在生產(chǎn)過程中，本發(fā)明采用了多種比例的的混合溶液，四氫呋喃占整個溶劑體系的比例為20％-35％不等，甲醇的比例始終控制在總體積的1％-3％左右，而甲醇的存在不影響產(chǎn)品洗脫出峰時間，僅僅是改善分離效果。
分離純化的具體操作1、樣品溶解先用四氫呋喃溶解粗原料10-DAB III，每克重量半成品10-去乙?；涂ㄍII用5-8毫升四氫呋喃溶液。獲得原料與四氫呋喃溶液作為分離純化步驟的“進(jìn)樣”備用。
2、泵入分離柱將溶解后的原料四氫呋喃溶液，用高壓輸液泵泵入高效制備分離柱，進(jìn)樣(原料與四氫呋喃溶液)的量根據(jù)色譜柱所填裝的介質(zhì)(如球形硅膠)總量為參照。通常，100克該類型的球形硅膠填料可以泵入含量25％粗原料10-DAB III2-10克，并且還應(yīng)根據(jù)粗原料的20％-35％含量不同而有所調(diào)整進(jìn)樣粗原料10-DAB III重量，最終目的都是保證最大效率的分離出合格的10-DAB III純品。
進(jìn)樣(原料與四氫呋喃溶液)量的多少以進(jìn)樣中實有10-DAB III的重量與球形硅膠的重量之比，根據(jù)實驗粗原料10-DAB III中實有0.50-2.50克10-DAB III，則配用100克球形硅膠填料，即重量比0.50-2.50％。也就是色譜柱所填裝的介質(zhì)(如球形硅膠)總量為100克，溶解在四氫呋喃中的粗原料10-DAB III中實有0.50-2.50克10-DAB III。
3、分離純化采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作為流動相，分離過程中，用紫外檢測器以254nm的波長進(jìn)行在先跟蹤監(jiān)測，用收集瓶接收不同時間出來的10-DAB III餾份，取樣后用液相色譜分析，將合格的餾份合并在一起，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50-60℃的溫度下抽真空回收溶劑、獲得純度為99％的10-DAB III產(chǎn)品?；厥蘸蟮娜軇┛梢栽俅握{(diào)配循環(huán)使用，得到的純度為99％的10-DAB III產(chǎn)品通過真空干燥器進(jìn)一步烘干即可成最終產(chǎn)品。對于不合格的餾份產(chǎn)品，可以重新富集蒸干，再次制備分離。如此操作過程，保證了產(chǎn)品的有效得率和回收率，循環(huán)使用溶劑，節(jié)約了成本。
本發(fā)明所指的粗原料10-DAB III、10-DAB III原料、半成品10-DAB III、10-去乙?；涂ㄍII、半成品10-去乙酰基巴卡亭III、10-DAB III為同一概念。
本說明書指的四氫呋喃、正己烷和甲醇三種材料為分折純，但本發(fā)明不限止僅用分折純。
本發(fā)明優(yōu)越性在于經(jīng)多次實驗測定，用本四氫呋喃先溶解粗原料10-DAB III，和用四氫呋喃、正己烷和甲醇的混和溶劑作為分離洗脫劑的提純方法可獲得99％純度的10-DAB III。而現(xiàn)有用甲醇或酒精溶解、乙酸乙酯洗脫劑的提純方法只能獲得最高94-96％純度的10-DAB III。
本發(fā)明的優(yōu)點該方法利用四氫呋喃溶解半成品10-去乙?；涂ㄍII，再放入動態(tài)軸向壓縮液相制備色譜柱，采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混和溶劑作為洗脫流動相，通過一至兩次的分離制備就可以得到的含量達(dá)到99％的10-DAB III純品。該方法高效、成本低、環(huán)保，產(chǎn)品回收率高等優(yōu)點，具有進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用價值。
在洗脫過程中，利用高效的制備液相色譜分離系統(tǒng)分離10-DAB III，并利用100mm的大規(guī)模制備液相柱實現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)分離，整過分離工藝過程穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，環(huán)保、高效，分離總得率高，為使用更大型的制備液相色譜分離10-DAB III收集到充分的數(shù)據(jù)。


圖一，含量為23％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖二，含量為53％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
具體實施例實施例1、半成品10-去乙?；涂ㄍII原料是低含量，樣品溶解和分離純化都有四氫呋喃的方法稱取含量為23％的10-DAB III原料粉末100克，用100mm的動態(tài)軸向壓縮液相制備色譜柱，填料為20-45um的球形硅膠，孔徑為70A，總共填裝了1650克填料(10-DABIII填料的重量比1.40％左右)，分離色譜柱長40cm，流動相為22∶77∶1＝四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)。
稱好含量為23％的10-DAB III原料粉末100克樣品，用四氫呋喃在50℃下用超聲波促溶解，過濾，每次向壓縮液相制備色譜柱進(jìn)樣50克。采用四氫呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作為流動相，分離時間為60分鐘，分離過程用254nm的紫外檢測器監(jiān)測，流動相洗脫流速為300ml/min，用幾個容積為一升的收集瓶收集10-DABIII的不同時間段的餾份峰。分離完畢后，用分析液相色譜檢測個部分餾分，富集合格餾分50℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收產(chǎn)品，烘干，得到17克產(chǎn)品。不合格的餾份再次蒸干溶樣制備分離，如法收集，蒸干，合并合格產(chǎn)品，稱重為4克，計算總得率為91％。測定17克產(chǎn)品10-DAB III的純度為99％。
圖1為含量為23％的10-DAB III原料高效分離制備液相色譜圖，圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
實施例2、半成品10-去乙?；涂ㄍII原料是高含量，樣品溶解和分離純化都有四氫呋喃的方法稱取原料的10-DAB III粉末60克(含量為53％)，用100mm的動態(tài)軸向壓縮液相制備色譜柱，填料為20-45um的球形硅膠，孔徑為70A，總共填裝了1650克填料(10-DAB III填料的重量比1.92％左右)，分離色譜柱長35cm，流動相為26∶73∶1＝四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)。
稱好含量為53％的10-DAB III原料粉末60克樣品，用四氫呋喃在55℃下用超聲波促溶解，過濾，每次進(jìn)樣30克。采用四氫呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作為流動相，分離時間為55分鐘，分離過程用254nm的紫外檢測器監(jiān)測，流動相洗脫流速為300ml/min，用幾個容積為一升的收集瓶收集10-DAB III的不同時間段的餾份峰。分離完畢后，用分析液相色譜檢測個部分餾分，富集合格餾分50℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收產(chǎn)品，烘干，得到25克產(chǎn)品。不合格的餾份再次蒸干溶樣制備分離，如法收集，蒸干，合并合格產(chǎn)品，稱重為4.5克，計算總得率為93％。測定25克產(chǎn)品10-DAB III的純度為99％。
圖二，含量為53％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
實施例3本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝30∶68∶2。
實施例4本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝35∶64∶1。
實施例5本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝20∶77∶3。
權(quán)利要求
1.一種高效分離純化10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB III)的方法，包括樣品溶解和后分離純化步驟，其特征在于樣品溶解步驟是用四氫呋喃溶解半成品10-去乙?；涂ㄍII；分離純化步驟是用四氫呋喃、正己烷和甲醇的混和溶劑作為分離洗脫劑，用液相分離方法，對樣品溶解步驟獲得的過濾物洗脫分離，得到高純度半成品10-去乙?；涂ㄍII。
2.如權(quán)利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB III)的方法，其特征在于半成品10-去乙酰基巴卡亭III四氫呋喃的配比關(guān)系是，每克重量半成品10-去乙?；涂ㄍII用5-8毫升四氫呋喃溶液。
3.如權(quán)利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB III)的方法，其特征在于分離洗脫劑中，甲醇、四氫呋喃、正己烷的體積比是，甲醇 1-----3％四氫呋喃 20-35％正己烷64---78％。
4.如權(quán)利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB III)的方法，其特征在于分離純化步驟用的吸附劑為20-45um球形硅膠，孔徑為70A。
全文摘要
本發(fā)明一種高效分離純化10－去乙?；涂ㄍII(10－DAB III)的方法公開了一種可獲取高純度10－去乙?；涂ㄍII的方法，該方法利用四氫呋喃溶解半成品10－去乙酰基巴卡亭III，再放入動態(tài)軸向壓縮液相制備色譜柱中，采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混和溶劑作為洗脫流動相，通過一至兩次的分離制備就可以得到的含量純度達(dá)到99％的10－DAB III純品。該方法高效、成本低、環(huán)保，產(chǎn)品回收率高等優(yōu)點，具有進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用價值。
文檔編號C07D305/00GK101045719SQ20071004901
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者張黎, 劉丁, 董維珍 申請人:成都普思生物科技有限公司