專利名稱：：固定化微生物發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種固定化微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的方法。技術(shù)背景丙酸(propiornicacid以下簡(jiǎn)稱PA)及其鹽是理想的飼料抗真菌劑，在食品、醫(yī)藥、香料，除草劑以及可生物降解塑料等領(lǐng)域也具有重要用途。我國(guó)作為世界祠料生產(chǎn)大國(guó)，對(duì)丙酸的需求量很大，并且呈現(xiàn)逐年遞增的態(tài)勢(shì)。固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)70年代興起的一種生物技術(shù)。所謂固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復(fù)使用的方法。細(xì)胞被固定化后細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物分離容易、能實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢(shì)。丙酸的生產(chǎn)方法分為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法?，F(xiàn)有公開的化學(xué)合成法包括①輕質(zhì)烴氧化合成醋酸副產(chǎn)法，②乙烯碳基合成法(Reppe工藝)，③乙醇羰基化法，④丙烯酸加氫法，丙醛氧化法，化學(xué)合成法污染重、成本高、操作條件苛刻，不符合全球環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)的潮流，因此，人們逐漸把注意力投向了微生物發(fā)酵法。從上世紀(jì)20年代起，人們開展了大量發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸的研究，取得了不少進(jìn)展，但是發(fā)酵法卻始終未能完全替代化學(xué)合成法。主要原因由于丙酸菌的生長(zhǎng)會(huì)受到發(fā)酵終產(chǎn)物(丙酸、乙酸)的抑制，因此發(fā)酵液中丙酸濃度較低以及副產(chǎn)物乙酸的存在，增加了丙酸提取的難度;發(fā)酵法的總成本高于化學(xué)合成法。多年來，業(yè)界人士圍繞上述問題進(jìn)行了大量研究工作。固定化細(xì)胞方法按照固定化載體與作用方式的不同，可分為吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法。其中的吸附法又叫載體結(jié)合法，是依據(jù)帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用，而使微生物細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部形成生物膜的方法，可分為物理吸附法和離子吸附法兩種。此法較為簡(jiǎn)便，活力損失較小，但細(xì)胞與載體作用力小，易脫落。包埋法是將微生物細(xì)胞包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或埋于半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)。根據(jù)載體材料和方法的不同，包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。凝膠包埋法是將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中而使細(xì)胞固定的方法；半透膜包埋法是將細(xì)胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)而使細(xì)胞固定的方法。此法簡(jiǎn)單，條件溫和，穩(wěn)定性好，包埋細(xì)胞容量高。共價(jià)結(jié)合法是細(xì)胞表面上功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，從而成為固定化細(xì)胞。此法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞與載體結(jié)合緊密，不易脫落，但制備較難，且活力損失較大。交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)(如氨基酸、羥基、硫基、咪唑基)發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞，其結(jié)合力是共價(jià)鍵。此法制備麻煩，活力損失較大，但細(xì)胞與載體結(jié)合較緊。固定化細(xì)胞技術(shù)的關(guān)鍵在于所采用的固定化載體材料的性能。理想的固定化載體應(yīng)具有對(duì)微生物無毒性、傳質(zhì)性能好、性質(zhì)穩(wěn)定、壽命長(zhǎng)、價(jià)格低廉等特性。目前所采用的固定化載體材料主要包括有機(jī)高分子載體、無機(jī)載體和復(fù)合載體三類。有機(jī)高分子載體又可分為天然高分子載體(如瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠等)和合成有機(jī)高分子凝膠載體(如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化樹脂等)。天然高分子凝膠載體一般對(duì)生物無毒性，傳質(zhì)性能好，但強(qiáng)度低，厭氧下易被微生物分解，壽命短；合成高分子凝膠載體一般而言強(qiáng)度較大，但傳質(zhì)性能較差，進(jìn)行細(xì)胞固定時(shí)對(duì)細(xì)胞活性有影響。無機(jī)載體(如陶珠、活性炭、沙粒等)大多具有多孔結(jié)構(gòu)，與微生物接觸時(shí)利用吸附和電荷效應(yīng)把微生物固定。具有機(jī)械強(qiáng)度大、對(duì)微生物無毒性、不易生物分解、耐酸堿、成本低等特性且制作簡(jiǎn)單易行，只需把載體放入含有微生物一定濃度的溶液中浸泡一段時(shí)間即可。復(fù)合載體是由有機(jī)載體材料和無機(jī)載體材料結(jié)合而成，使兩類材料在許多性能上互補(bǔ)。固定化細(xì)胞方式在有機(jī)酸發(fā)酵中應(yīng)用廣泛，用于生產(chǎn)丙氨酸，L(+)酒石酸等有機(jī)酸。首次獲得生產(chǎn)丙氨酸的細(xì)胞固定化工藝條為1.2%的聚乙烯亞胺和O.9y。的戊二醛分別處理20min和10min,在以CaC03為中和劑時(shí)，固定化細(xì)胞生產(chǎn)丙氨酸時(shí)比發(fā)酵過程產(chǎn)生更少的副產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化液的色度降低了75.6%，而糖酸轉(zhuǎn)化率從60.5%提高到76.4%，丙氨酸產(chǎn)量也從58.2g/L提高到68g/L。固定化細(xì)胞的半衰期約670h。進(jìn)行固定化細(xì)胞清潔生產(chǎn)丙氨酸的中試結(jié)果表明清潔生產(chǎn)不僅比化學(xué)合成法極大地減少了污染物的排放(每噸產(chǎn)品減少?gòu)U水40t,廢渣4.5t，而且比發(fā)酵法生產(chǎn)中減少了酸堿和溶劑的用量和廢水的產(chǎn)生(每噸產(chǎn)品至少減少?gòu)U水451).
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于采用吸附和包埋結(jié)合的固定化丙酸菌細(xì)胞發(fā)酵丙酸，解除產(chǎn)物反饋抑制，并提高菌體使用率，也用利于丙酸的提取，使發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的水平達(dá)到較大提高。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下固定化微生物發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟(l)菌種培養(yǎng)(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌(3)液體深層發(fā)酵(4)丙酸的提取工藝，其中(1)菌種培養(yǎng)以為生產(chǎn)菌種采用費(fèi)氏丙酸菌/Vo//。i7/6ac"/7a/>^^/,^力//試管斜面菌種，搖瓶放大培養(yǎng)，種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌將放大培養(yǎng)菌種，無菌管道輸入到連續(xù)離心機(jī)離心收集菌體，然后加入種子罐原種子發(fā)酵液體積1/20-1/15體積的無菌水制成菌懸液，再加入菌懸液體積(升)1/8-1/6的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:8-1:6的玉米芯粉，，，攪拌吸附時(shí)間1-2h;加入4%-6%濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的l.5-2.5倍，然后再加無菌3%-5%濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的O.5-1.5倍，攪拌1-2h;無菌輸入滴注器連續(xù)滴入菌懸液體積5-10倍的2%-4%濃度的氯化釣溶液中，無菌常溫靜置2-3h，放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發(fā)酵罐終。(3)液體深層發(fā)酵液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸銨2-6g，碳酸鉤4-8g，硝酸銨l-3g，乳酸鈉2-6ml，pH=7.2-7.4;控制罐內(nèi)溫度30-35。C,罐壓0.01-0.02MPa，連續(xù)攪拌，發(fā)酵時(shí)間36-48h，丙酸含量達(dá)20-40g/L發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液放出，進(jìn)入提取工序，再于發(fā)酵罐中再補(bǔ)充無菌新發(fā)酵液，液體發(fā)酵液體積為固定化菌體體積的10-50倍；(4)丙酸提取工序發(fā)酵液經(jīng)孔徑為1-2nm,膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質(zhì)，過濾操作壓力為O.02-0.03MPa，操作溫度25-30°C;濾液調(diào)節(jié)pH值到6.0-6.5，然后進(jìn)行陰離子交換樹脂靜態(tài)吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為10:1-15:1,攪拌速率為20-50轉(zhuǎn)/分鐘，吸附溫度25-30°C，吸附時(shí)間3.5-4.5小時(shí)；去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經(jīng)超濾膜超濾濃縮，采用截留分子量為5000-6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，超濾操作壓力為O.2-0.6MPa,溫度15-30°C，經(jīng)結(jié)晶得到無色透明的晶體粉末，丙酸純度>95%丙酸產(chǎn)品。本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法中斜面菌種培養(yǎng)是將丙酸桿菌使用相應(yīng)培養(yǎng)基并加入15-25g瓊脂，在28-35。C條件下靜止培養(yǎng)20-48小時(shí)，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養(yǎng)條件溫度25-40X:，轉(zhuǎn)速80-180轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間19-30h;種子罐培養(yǎng)條件溫度25-40"C,通風(fēng)量9-13m7h，罐壓0.02-0.09MPa，時(shí)間19-60小時(shí)。本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法中玉米芯粉是經(jīng)過40目篩粉碎合高溫滅菌制得。本發(fā)明所采用的陰離子交換樹脂為弱堿性陰離子交換樹脂例如D301、D311、D330、D201等等。本發(fā)明所用菌種和菌種相應(yīng)使用的培養(yǎng)基見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明采用吸附和包埋結(jié)合的固定化丙酸菌細(xì)胞發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)發(fā)法的積極效果在于采用吸附-包埋聯(lián)合方法克服了丙酸菌生長(zhǎng)受到發(fā)酵終產(chǎn)物(丙酸、乙酸)抑制的不利因素，提高了發(fā)酵液中丙酸的濃度，減低了副產(chǎn)物乙酸的存在，增加了丙酸提取的效率。同時(shí)采用本發(fā)明的固定化細(xì)胞清潔生產(chǎn)丙氨酸不僅比化學(xué)合成法極大地減少了污染物的排放，而且減少了發(fā)酵法生產(chǎn)中酸堿和溶劑的用量，減少了廢水的排放，更適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。說明書附圖圖1為固定化微生物發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)工藝流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及工藝流程圖進(jìn)一步的說明本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)施例l菌種及所用培養(yǎng)基表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>固定化丙酸菌發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)菌種培養(yǎng)(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌(3)液體深層發(fā)酵(4)丙酸的提取工藝(l)其中菌種培養(yǎng)工序以為生產(chǎn)菌種采用費(fèi)氏丙酸菌戶ro/7/朋/6ac/er/a/Vew/e/re/c力/7試管斜面菌種，搖瓶放大培養(yǎng)，種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)方法。斜面菌種培養(yǎng)基本培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，蔗糖20,酵母膏10，磷酸銨5(pH=7.2-7.4)。上述菌種使用相應(yīng)培養(yǎng)基并加入15g瓊脂，在28。C條件下靜止培養(yǎng)20小時(shí)，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養(yǎng)條件溫度25。C，轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間19h;種子罐培養(yǎng)條件溫度25。C,通風(fēng)量9mVh，罐壓O.02MPa,時(shí)間19小時(shí)。(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌工序由種子罐放大培養(yǎng)，無菌管道輸入到連續(xù)離心機(jī)離心收集菌體。然后加入種子罐原種子發(fā)酵液體積l/20體積的無菌水制成菌懸液，加入菌懸液體積(升)l/8的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:8的玉米芯粉"，玉米芯粉經(jīng)過40目篩粉碎合高溫滅菌，然后進(jìn)行攪拌吸附時(shí)間lh。吸附完成后加入4%濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的L5倍，然后再加無菌3%的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的0.5倍，攪拌lh。無菌輸入滴注器連續(xù)滴入菌懸液體積S倍的2。/。濃度的氯化釣溶液中，無菌常溫靜置2h，然后放出氯化鉀溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發(fā)酵罐。(3)液體發(fā)酵工序液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2g，蔗糖5g，酵母膏2g，甘油5ml，磷酸銨2g，碳酸釣4g，硝酸銨lg，乳酸鈉2ml，pH=7.2?？刂乒迌?nèi)溫度30。C，罐壓0.01MPa，連續(xù)攪拌，發(fā)酵時(shí)間36h，丙酸含量達(dá)20g/L發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液放出，進(jìn)入提取工序，再于發(fā)酵罐中在補(bǔ)充無菌新發(fā)酵液。液體發(fā)酵液體積為固定化菌體體積的10倍。(4)丙酸提取工序發(fā)酵液經(jīng)膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質(zhì)，濾膜孔徑為l2fim,過濾操作壓力為0.02MPa，操作溫度25。C。濾液調(diào)節(jié)pH值到6.0，然后進(jìn)行陰離子交換樹脂(D301或I)3U)靜態(tài)吸附，濾液與陰離于樹脂體積重量比為10:1，攪拌速率為20轉(zhuǎn)/分鐘，吸附溫度25。C，吸附時(shí)間3.5小時(shí)。去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經(jīng)超濾膜超濾濃縮，采用截留分子量為50006000道爾頓的超濾膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，超濾操作壓力為O.2MPa，溫度15。C。經(jīng)結(jié)晶得到丙酸產(chǎn)品。丙酸產(chǎn)品無色透明的晶體粉末，丙酸純度》95%(HPLC方法檢測(cè))。實(shí)施例2菌種及所用培養(yǎng)基表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1費(fèi)氏丙酸桿菌，"基本培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,蔗糖20,酵母膏10,磷酸銨5/Veytfenre/.c力//(pH=7.2-7.4)(1)菌種培養(yǎng)工序以為生產(chǎn)菌種采用費(fèi)氏丙酸菌戶r/朋/》""Wa/>e"de/7re/c//i試管斜面菌種—搖瓶》丈大培養(yǎng)—種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)方法。斜面菌種培養(yǎng)上述菌種使用相應(yīng)培養(yǎng)基并加入25g瓊脂，在35。C條件下靜止培養(yǎng)48小時(shí)，放入4。C水箱保存；其中搖瓶培養(yǎng)條件溫度4(TC，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間30h;種子罐培養(yǎng)條件溫度40X:，通風(fēng)量13m7h,罐壓O.09MPa,時(shí)間60小時(shí)。(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌工序由種子罐放大培養(yǎng)，無菌管道輸入到連續(xù)離心機(jī)離心收集菌體。然后加入種子罐原種子發(fā)酵液體積1/15體積的無菌水制成菌懸液，加入菌懸液體積(升)l/6的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:6的玉米芯粉，，，玉米芯粉經(jīng)過40目篩粉碎合高溫滅菌，然后進(jìn)行攪拌吸附時(shí)間2h。吸附完成后加入6%無菌海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的2.5倍，然后再加無菌5%濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的1.5倍，攪拌2h。無菌輸入滴注器連續(xù)滴入菌懸液體積10倍的4%濃度的氯化鈣溶液中，無菌常溫靜置3h，然后放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入到液體發(fā)酵罐。(3)液體發(fā)酵工序液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨4g，蔗糖15g,酵母膏4g，甘油15ml,磷酸銨6g，碳酸鈣8g，硝酸銨3g,乳酸鈉6ml，pH-7.4?？刂乒迌?nèi)溫度3S。C,罐壓O.02MPa，連續(xù)攪拌，發(fā)酵時(shí)間48h，丙酸含量達(dá)40g/L發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液放出，進(jìn)入提取工序，再于發(fā)酵罐中在補(bǔ)充無菌新發(fā)酵液。液體發(fā)酵液體積為固定化菌體體積的50倍。(4)丙酸提取工序發(fā)酵液經(jīng)膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質(zhì)，濾膜孔徑為l2nm，過濾操作壓力為0.03MPa，操作溫度30。C。濾液調(diào)節(jié)pH值到6.5，然后進(jìn)行陰離子交換樹脂(1)330或D201)靜態(tài)吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為15:1，攪拌速率為50轉(zhuǎn)/分鐘，吸附溫度3(TC,吸附時(shí)間4.5小時(shí)。去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經(jīng)超濾膜超濾濃縮，采用截留分子量為5000~6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度30。C。經(jīng)結(jié)晶得到丙酸產(chǎn)品。丙酸產(chǎn)品無色透明的晶體粉末，丙酸純度》95°/。(HPLC方法檢測(cè))。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種固定化微生物發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟菌種培養(yǎng)、固定化費(fèi)氏丙酸菌、液體深層發(fā)酵、丙酸的提取工藝其中(1)菌種培養(yǎng)以為生產(chǎn)菌種采用費(fèi)氏丙酸菌Propionibacteriafreudenreichii試管斜面菌種，搖瓶放大培養(yǎng)，種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)固定化費(fèi)氏丙酸菌將放大得到的培養(yǎng)菌種，無菌管道輸入到連續(xù)離心機(jī)，離心收集菌體，然后加入種子罐原種子發(fā)酵液體積1/20-1/15體積的無菌水制成菌懸液，再加入菌懸液體積1/8-1/6公斤的玉米芯粉，攪拌吸附1-2h；加入4％-6％濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的1.5-2.5倍，然后再加3％-5％濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的0.5-1.5倍，攪拌1-2h；采用無菌輸入連續(xù)滴注器滴入菌懸液體積5-10倍的2％-4％濃度的氯化鈣溶液中，無菌常溫靜置2-3h，放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發(fā)酵罐中。(3)液體深層發(fā)酵液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸銨2-6g，碳酸鈣4-8g，硝酸銨1-3g，乳酸鈉2-6ml，pH＝7.2-7.4；控制罐內(nèi)溫度30-35℃，罐壓0.01-0.02MPa，連續(xù)攪拌，發(fā)酵時(shí)間36-48h，丙酸含量達(dá)20-40g/L發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液放出，進(jìn)入提取工序，再于發(fā)酵罐中再補(bǔ)充無菌新發(fā)酵液，液體發(fā)酵液體積為固定化菌體體積的10-50倍；(4)丙酸提取工序發(fā)酵液經(jīng)孔徑為1-2μm膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質(zhì)，過濾操作壓力為0.02-0.03MPa，操作溫度25-30℃；濾液調(diào)節(jié)pH值到6.0-6.5，然后進(jìn)行陰離子交換樹脂靜態(tài)吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為10∶1-15∶1，攪拌速率為20-50轉(zhuǎn)/分鐘，吸附溫度25-30℃，吸附時(shí)間3.5-4.5小時(shí)；去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經(jīng)超濾膜超濾濃縮，采用截留分子量為5000-6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，超濾操作壓力為0.2-0.6MPa，溫度15-30℃，經(jīng)結(jié)晶得到無色透明的晶體粉末，丙酸純度≥95％丙酸產(chǎn)品。2、如權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其中的斜面菌種培養(yǎng)是將丙酸桿菌使用相應(yīng)培養(yǎng)基并加入15-25g瓊脂，在28-351C條件下靜止培養(yǎng)20-48小時(shí)，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養(yǎng)條件溫度25-40t:，轉(zhuǎn)速80-180轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間19-30h;種子罐培養(yǎng)條件溫度25-4(TC，通風(fēng)量9-13mVh，罐壓0.02-0.09MPa，時(shí)間19-60小時(shí)。3、如權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其中的玉米芯粉是經(jīng)過40目篩粉碎合高溫滅菌制得。4、如權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其中的陰離子交換樹脂為大孔弱堿性陰離子交換樹脂。全文摘要本發(fā)明公開了固定化微生物發(fā)酵丙酸的生產(chǎn)方法，它是采用費(fèi)氏丙酸桿菌試管斜面菌種，搖瓶放大培養(yǎng)，種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)等步驟，離心收集菌體，制成菌懸液，加入玉米芯粉吸附，加入4％～6％海藻酸鈉溶液，再加3％～5％的聚乙烯醇，攪拌1～2h。隨后滴到2％～4％的氯化鈣溶液中固定化，發(fā)酵液經(jīng)孔徑為1～2μm膜過濾、陰離子交換樹脂靜態(tài)吸附、洗脫樹脂、濃縮結(jié)晶得到純度≥95％丙酸產(chǎn)品。本發(fā)明采用吸附-包埋結(jié)合的固定化丙酸菌細(xì)胞發(fā)酵丙酸，解除了產(chǎn)物反饋抑制，提高了菌體使用率，有利于丙酸的提取，使發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的水平得到較大提高，更適合丙酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12R1/01GK101130794SQ20071005862公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日發(fā)明者丁友昉,王德培,高年發(fā)申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)