專利名稱：一種動物細胞的低溫保存溶液及保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物保存技術(shù)，特別地，涉及一種動物細胞的低溫保存溶液及保存方法。
背景技術(shù)：
在低溫條件(0～4℃)下，大多數(shù)器官可以耐受30～60min的缺血狀態(tài)而維持其功能，這是因為低溫下細胞內(nèi)酶活性低、細胞代謝慢所造成的。因此就產(chǎn)生這么一個想法將分離的細胞、組織、器官保存于低溫條件下，延長保存時間，提高保存效果，有效提高這些生物資源的利用度，拓展其細胞、組織和人工器官的運輸與保存中的應(yīng)用。
隨著人工組織的研究與應(yīng)用，人們對低溫保存溶液產(chǎn)生越來越濃厚的興趣，這種保存操作步驟簡單易行、對環(huán)境要求低，適合于運輸和移植中所要求的短期保存要求，無需冷凍。低溫保存的一般方法是將已分離細胞、組織和器官等直接保存于4℃中，這種傳統(tǒng)的保存方法導(dǎo)致在低溫保存后細胞活率下降，細胞膜皺縮，細胞結(jié)構(gòu)遭到嚴重損傷，無法在復(fù)蘇后存活。
可見低溫會產(chǎn)生很強的副作用，其對細胞造成的傷害主要有以下幾個方面1)細胞膜流動性減小，細胞膜僵化將導(dǎo)致細胞的進一步損傷；2)抑制了Na/K ATP酶，引起細胞膨脹；3)導(dǎo)致細胞壞死和凋亡；4)產(chǎn)生氧自由基。
由此，人們使用特殊的低溫保存液來保存離體器官于0～4℃。也因此相繼出現(xiàn)許多低溫保存液，如UW液(威斯康星大學研制的低溫保存液)，EURO-COLLIN液、L-15液、HTS(HYPOTHERMOL)液、EPIDERM液和DME等。這些保存液都很好用于保存器官，使器官在低溫狀態(tài)下保存后仍維持一定的功能、活率，取得了很好的效果。隨后，科學家采用這些保存液用于保存離體動物細胞，其保存效果卻不理想，無法有效地抑制由低溫保存引起的細胞損傷。
可見，低溫保存液的成分尚需要進一步的改良與優(yōu)化。這對于采用離體細胞通過體外組裝成的人工器官尤其重要。Pahernik等就強調(diào)了大規(guī)模低溫保存方法對發(fā)展生物人工肝的重要性，這種方法能有效地延長細胞貯存、運輸?shù)臅r間，更拓寬這些細胞的應(yīng)用范圍，使細胞能有效地用于化妝品和藥品臨床前的體外安全性檢測，或者組裝成人工器官用于臨床使用。
因此，本專利針對低溫保存引起的細胞損傷現(xiàn)象，改良低溫保存液成分，提高低溫保存效果。
隨著中藥現(xiàn)代化，中藥有效成分具有抑制細胞凋亡、穩(wěn)定細胞膜和清除自由基等保護功能，可以通過各自機制保護細胞免于低溫狀態(tài)下的細胞受損。以下是文獻所報道的部分中藥有效成分的一些具體作用。甘草酸[1]對細胞有抑制凋亡、清除氧自由基的功效，苦參堿在0.2～10mg/L濃度范圍下能清除自由基，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，減輕細胞的損傷，且能明顯抑制由腫瘤壞死因子所誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞的凋亡，且對細胞功能有很強的促進作用。山莨菪堿[2]有穩(wěn)定細胞膜和抗氧自由基損傷的作用。五味子乙素[3]對兩種不同自由基產(chǎn)生系統(tǒng)所引起的肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷均有保護作用，使肝細胞存活串提高，并能保持細胞膜形態(tài)完整。有相關(guān)功效的中藥有效成分還有丹參素[4]、黃芪多糖[5]、柴胡皂甙[6]等。
但迄今為止，尚未有文獻報道將五味子乙素、山莨菪堿、甘草酸、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙等中藥的有效成分應(yīng)用于離體細胞的低溫保存。
史桂蘭，胡志浩，甘草酸藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展，天津藥學2001，13(1)10-12。
王火、張淑環(huán)、黃良生，樟柳堿和山莨菪堿預(yù)防急性肺損傷的實驗研究，中國急救醫(yī)學，1999，19(11)19-20。
劉耕陶，五味子乙素對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞脂質(zhì)過氧化的抗氧化作用，中國藥理學報，1989，10(4)353[4]張文生朱陵群張麗慧牛福玲，丹參素對缺氧/缺糖損傷神經(jīng)細胞線粒體的保護作用，北京中醫(yī)藥大學學報，2004，27(3)53-56[5]李汶霞，孫圣剛，袁慧，王海濤，張顏波，孫保亮，黃芪多糖對星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中自由基系統(tǒng)損傷保護作用的時間依賴性，中國臨床康復(fù)，200610(11)59-61[6]周世文，周寧，徐傳福。中草藥抗肝細胞損傷有效成分研究進展，中國藥學雜志，1995，30(2)67-69。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種動物細胞的低溫保存溶液，同時，也提供一種應(yīng)用此保存溶液進行低溫保存的方法。
該發(fā)明的基本思路是在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種保護因子，抑制因為低溫保存所造成的細胞損傷，而且低溫保存中以及前后的預(yù)培養(yǎng)和復(fù)溫培養(yǎng)中都添加了保護因子，強化其對細胞的保護作用。該保護因子主要由中藥有效成分組成。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種動物細胞的低溫保存溶液，它包括動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、化學保護成分鈣離子Ca2+和中藥有效成分山莨菪堿、五味子乙素、甘草酸、苦參堿、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙。所述Ca2+和各中藥有效成分濃度分別為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
進一步地，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Williams’E培養(yǎng)基、HTS液、1640、L-15液或Ham’s F12。
一種應(yīng)用上述動物細胞的低溫保存溶液進行的低溫保存方法，用于保存動物細胞，它包括如下步驟(1)將已分離的動物細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0～24小時；(2)將預(yù)培養(yǎng)后的動物細胞在權(quán)利要求1所述的低溫保存溶液中低溫保存0～48小時；(3)低溫保存完畢后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)溫培養(yǎng)。
進一步地，所述動物細胞是從組織器官中分離得到的原代細胞。
進一步地，所述步驟(1)和(3)中，所述二氧化碳培養(yǎng)箱中，為防止細胞在逐漸升溫過程中受損，使用的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了各保護因子，其組成為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
進一步地，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。
本發(fā)明專利的有益效果是，五味子乙素、山莨菪堿、甘草酸、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙等中藥的有效成分均是離體細胞低溫保存的良好保護劑，根據(jù)低溫損傷機理，它們可以通過清除氧自由基、抑制鈣通道、增加細胞膜的穩(wěn)定性和抑制低溫引起的細胞凋亡等渠道來保護低溫保存中的離體細胞。本發(fā)明優(yōu)化了低溫保存液配方，較好地通過低溫保存方法維持細胞的生物學活性及特異性功能。同時，在0～4℃下低溫保存情況下，細胞運輸和保存過程中不需要任何營養(yǎng)和氧氣供給，操作簡單可行，為離體細胞的保存和運輸帶來便利，具有很強的現(xiàn)實意義。
具體實施例方式
下面根據(jù)具體實施例詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。
為了克服現(xiàn)有的低溫保存過程中保存細胞效果差的嚴重不足，本發(fā)明以基于添加各種不同功能的中藥保護成分為主要發(fā)明創(chuàng)造點，此外結(jié)合廉價的化學保護劑來研制一種有效的用于低溫保存離體細胞的溶液，同時也提供相應(yīng)的便于操作的低溫保存方法。
本發(fā)明用于保存動物細胞的低溫保存方法，其具體步驟為將已分離的動物細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0～24小時；將預(yù)培養(yǎng)后的動物細胞在本發(fā)明的低溫保存溶液中低溫保存0～48小時；低溫保存完畢后在二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)溫培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞的方式有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、凝膠包埋培養(yǎng)、聚球體培養(yǎng)等。這樣所得到的高活率細胞可用于人工器官。
在預(yù)培養(yǎng)和復(fù)溫過程中，為了防止細胞在逐漸升溫時受到損傷，在現(xiàn)有的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入了Ca2+0～10mol/L的鈣離子、0～500mg/L的山莨菪堿、0～100mg/L的五味子乙素、0～100mg/L的甘草酸、0～100mg/L的苦參堿、0～100mg/L的丹參素、0～100mg/L的黃芪多糖、0～100mg/L的柴胡皂甙，pH調(diào)節(jié)至7.4；二氧化碳培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37℃，內(nèi)含5％的二氧化碳。
現(xiàn)有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為Eagle’s MEM，DMEM，Ham’s F10或12，DMEM/F12，PRMI 1640，L-15，M199，Williams’E等培養(yǎng)基。
本發(fā)明的低溫保存溶液是在現(xiàn)有的每升動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各保護因子，使各濃度組分為Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
用于低溫保存的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為Williams’E培養(yǎng)基，HTS液，1640，L-15液，Ham’s F12等。
實施例1聚球體的低溫保存將人肝細胞聚球體凝膠包埋于聚砜中空纖維絲內(nèi)，5cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，加入含有保護劑的Williams’E培養(yǎng)基(添加成分5mg/L山莨菪堿、5mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，1mMCa2+，每個平行分別添加一種保護劑)，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置，預(yù)培養(yǎng)12h；將培養(yǎng)基換成添加有保護劑的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于4℃冰箱放置48h，復(fù)溫時，將保存液重新?lián)Q成含有保護劑的Williams’E培養(yǎng)基，復(fù)溫12h后檢測各項指標。
作為陽性對照組，用同樣的方法進行預(yù)培養(yǎng)、低溫保存和復(fù)溫，但所有培養(yǎng)基或保存液均不添加任何保護成分(包括中藥有效成分和化學保護劑)；作為陰性對照組，細胞一直培養(yǎng)在37℃下，但培養(yǎng)基中不含任何保護劑。評價各種情況下的細胞活率和功能。
各重復(fù)三組，測定肝細胞活率及肝細胞功能指標結(jié)果如下表所示。

根據(jù)表中數(shù)據(jù)，與陽性對照組相比，添加有各種中藥保護成分的實驗組其細胞活率提高約1.5～2.0倍。
實施例2凝膠包埋培養(yǎng)的低溫保存將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞凝膠包埋，注入中空纖維絲，細胞密度為1×106。將中空纖維絲裝入硅膠管，加入DMEM培養(yǎng)基(添加成分10mg/L苦參堿、10mg/L丹參素、10mg/L黃芪多糖、5mg/L柴胡皂甙，每個平行分別添加一種保護劑)，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置預(yù)培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)基換成分別添加各保護劑的L-15液，于4℃冰箱放置48h，復(fù)溫時，DMEM培養(yǎng)基中也添加了同樣成分的保護劑，培養(yǎng)時間為12h，復(fù)溫12h后檢測各項指標。
作為陽性對照組，用同樣的方法進行預(yù)培養(yǎng)、低溫保存和復(fù)溫，但低溫保存液中不添加任何中藥有效成分(保護劑)。而作為陰性對照組，細胞一直培養(yǎng)在37℃下，但培養(yǎng)基中不含任何保護劑。評價各種情況下的細胞活率和功能。
各重復(fù)三組，測定細胞細胞活率(MTT)和肝細胞功能指標之一(白蛋白分泌量)。

觀察細胞形態(tài)，可見培養(yǎng)于添加有保護成分的保存液中的細胞無論是存活率還是白蛋白分泌量均明顯優(yōu)于不添加任何成分的陽性對照組。
根據(jù)表中的實驗結(jié)果，在凝膠包埋的培養(yǎng)條件下，與不加任何保護細胞中藥成分的陽性對照組相比，添加有各種保護細胞成分的實驗組其細胞活率有所提高。
實施例3小型生物人工肝的低溫保存將豬肝細胞培養(yǎng)于小型生物人工肝模型中，總體積為50ml的豬肝細胞培養(yǎng)基在反應(yīng)器外腔以10ml/min的流速進行循環(huán)。DMEM/F12培養(yǎng)基中的添加成分100mg/L苦參堿、50mg/L山莨菪堿、100mg/L五味子乙素、100mg/L甘草酸，10mg/L丹參素、5mg/L黃芪多糖、5mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+，。預(yù)培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)基換成保護劑添加含量和成分均相同的的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行循環(huán)培養(yǎng)，于4℃冰箱放置48h，復(fù)溫時，DMEM/F12培養(yǎng)基中也添加了同樣成分的復(fù)合保護劑，復(fù)溫12h后檢測各項指標。
作為陽性對照組，用同樣的方法進行預(yù)培養(yǎng)、低溫保存和復(fù)溫，但低溫保存液中不添加任何成分的中藥有效成分(保護劑)。而作為陰性對照組，細胞一直培養(yǎng)在37℃下，但培養(yǎng)基中不含任何保護劑。評價各種情況下的細胞活率和功能。
各重復(fù)三組，測定細胞活率(MTT)和肝細胞功能指標(尿素分泌量和白蛋白)。

比較實施例2與3，可見將各種中藥保護成分混合后添加后，其對細胞的保護效果優(yōu)于單一中藥成分對肝細胞的保護作用。
實施例4將無菌條件下收獲的軟骨細胞，置于37℃進行凝膠包埋，注入中空纖維絲，細胞密度為1×105。將中空纖維絲裝入硅膠管，加入F12(復(fù)合培養(yǎng)液中的添加成分10mg/L苦參堿、50mg/L山莨菪堿、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹參素、10mg/L黃芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+。)，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置預(yù)培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)基換成保護劑添加含量和成分均相同的的HTS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于4℃冰箱放置48h，復(fù)溫采用F12基，其中也添加了同樣成分的保護劑，培養(yǎng)時間為24h。復(fù)溫24h后檢測各項指標。
作為陽性對照組，用同樣的方法進行預(yù)培養(yǎng)、低溫保存和復(fù)溫，但低溫保存液中不添加任何中藥有效成分(保護劑)。而作為陰性對照組，細胞一直培養(yǎng)在37℃下，但培養(yǎng)基中不含任何保護劑。評價各種情況下的細胞活率和功能。

從數(shù)據(jù)中看出，將各種中藥保護成分混合后添加于低溫保存液中，其對軟骨細胞同樣具有明顯的保護效果，且優(yōu)于添加單一保護劑的保護作用。因此該保護劑有廣泛應(yīng)用于低溫保存各種細胞的價值。
上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種動物細胞的低溫保存溶液，其特征在于，它包括動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、化學保護成分鈣離子Ca2+和中藥有效成分山莨菪堿、五味子乙素、甘草酸、苦參堿、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙。所述Ca2+和各中藥有效成分濃度分別為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低溫保存溶液，其特征在于，所述的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Williams’E培養(yǎng)基、HTS液、1640、L-15液或Ham’s F12。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的低溫保存溶液進行的低溫保存方法，用于保存動物細胞，其特征在于，它包括如下步驟(1)將已分離的動物細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0～24小時。(2)將預(yù)培養(yǎng)后的動物細胞在權(quán)利要求1所述的低溫保存溶液中低溫保存0～48小時。(3)低溫保存完畢后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)溫培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低溫保存方法，其特征在于，所述動物細胞是從組織器官中分離得到的原代細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低溫保存方法，其特征在于，所述步驟(1)和(3)中，所述二氧化碳培養(yǎng)箱中，為防止細胞在逐漸升溫過程中受損，使用的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了各保護因子，其組成為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低溫保存方法，其特征在于，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細胞的低溫保存溶液及保存方法，用于低溫保存細胞，特別是新鮮分離的原代動物細胞，如肝細胞。它是通過將剛分離的動物細胞在37℃下培養(yǎng)0～24h后，將培養(yǎng)基切換成0～4℃的低溫保存溶液，然后在0～4℃下低溫保存0～48h。保存結(jié)束后，采用新鮮細胞培養(yǎng)基在37℃條件下進行復(fù)蘇培養(yǎng)0～24h，最后采用正常動物細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在保存過程以及前后的培養(yǎng)基中采用添加中藥有效成分以及其他化學保護劑，提高動物細胞經(jīng)過低溫保存后的存活率以及細胞功能。本發(fā)明提出的離體動物細胞短期低溫保存技術(shù)，可應(yīng)用于生物人工肝及其他由器官細胞構(gòu)成的生物型人工臟器的運輸和保存，同時也適用于動物細胞在其他醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
文檔編號C12N5/06GK101037666SQ200710067089
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者孟琴, 魯燕華, 沙如意 申請人:浙江大學