專利名稱：高純度甘露聚糖肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度甘露聚糖肽的制備方法。
背景技術(shù)：
甘露聚糖肽是從a-溶血鏈球菌(Str印tococcus hemolyticus-a -Hemolysis) H,S-33號菌經(jīng)深層發(fā)酵、分離提取的糖肽類物質(zhì)。在哺乳動物體內(nèi) 能提升外周白細胞，增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，活化吞噬細胞及淋巴細胞， 誘導胸腺淋巴細胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，改善和增強機體免疫功能和應激能力。臨床 上主要用于惡性腫瘤放、化療中改善免疫功能低下的輔助治療。
甘露聚糖肽是一種高分子生物聚合物，其聚合程度和鏈長的不同使得其分 子大小也不相同，通常a-溶血鏈球菌仏S-33號菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，甘露聚糖肽 的重均分子量分布在1萬至100萬之間。研究表明，甘露聚糖肽的重均分子量 太小，其免疫活性較低，太大則作為外源性生物大分子異物，能引起機體產(chǎn)生 過敏等諸多不良反應。因此，作為藥用甘露聚糖肽，國家藥品標準規(guī)定甘露 聚糖肽原料藥的重均分子量應為40000 90000，注射用甘露聚糖肽用的重均分 子量應為40000 65000。以此在確保療效的前提下，保證其異常毒性、過敏試 驗、細菌內(nèi)毒素等指標符合規(guī)定，確保用藥安全。
中國專利CN1172952C公開了一種"甘露聚糖肽組合物及其制備工藝和用 途"，在其說明書3 4頁公開了甘露聚糖肽的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種甘露聚糖肽產(chǎn)品純度高的制備方法。
本發(fā)明高純度甘露聚糖肽的制備方法包括如下步驟
(1) 制備發(fā)酵產(chǎn)物a-溶血鏈球菌仏S-33號菌的深層發(fā)酵液，經(jīng)滅活、濃 縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物；
(2) 提取及粗品的制備發(fā)酵產(chǎn)物加3 10倍量(W/V)的純化水，在攪拌 下進行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH1.5 3.5，靜置、除去沉淀物， 清液在攪拌下加濃度90%以上乙醇至40% 80%乙醇濃度，靜置，分離沉
淀；沉淀物加純化水按步驟(2)反復溶解、沉淀，干燥得甘露聚糖肽 粗品；
(3) 大分子甘露聚糖肽的分離用截留10 30萬分子量的濾膜濾除甘露聚 糖肽粗品中的大分子甘露聚糖肽，濾液用截留1 5萬分子量的濾膜進 行濃縮處理，得甘露聚糖肽水溶液；
(4) 大分子甘露聚糖肽的水解將大分子甘露聚糖肽用溶菌酶、淀粉酶和纖 維素酶中任意一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進行水 解。
上述步驟(4)中酶水解的步驟如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V) 的純化水溶解，調(diào)整pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀 粉酶和纖維素酶中任意一種，20 6(TC保溫4 20小時，加熱至沸，冷卻至室溫， 調(diào)整pH2.0 3.0，濾過，得甘露聚糖肽水溶液。
上述步驟(4)中酸水解的步驟如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V) 辨度0.5 5%鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60 105。C 并保溫0.5 8小時，冷卻，調(diào)整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
口服用甘露聚糖肽原料的精制，將上述步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖 肽水溶液混合，過濾至清，取樣測定重均分子量和分布寬度，合格者用濃度50 80%乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，干燥得甘露聚糖肽原料；不合格 者，用超濾的方法去除小分子和大分子甘露聚糖肽，再用乙醇沉淀，靜置、離心 或濾過分離沉淀物，干燥得口服用甘露聚糖肽原料。
注射用甘露聚糖肽原料的精制，將上述步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖 肽水溶液混合，用5 20倍量(W/V)的蒸餾水溶解，按O. 1 5% (重量)的比 例加入活性炭，70 10(TC保溫10 60分鐘，冷卻、濾過，清液用濃度50 80% 乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，無水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射用 甘露聚糖肽原料。
本發(fā)明是將a -溶血鏈球菌H,S-33號菌的深層發(fā)酵產(chǎn)物用純化水在攪拌下 進行提取，用三氯乙酸沉除溶于水的蛋白雜質(zhì)，經(jīng)乙醇反復沉淀的方法得到甘 露聚糖肽粗品；粗品再用超濾的方法將符合與超過藥用分子量標準規(guī)定的甘露 聚糖肽分離出來，大分子甘露聚糖肽部分經(jīng)酶解或酸解后，與分子量符合規(guī)定 的甘露聚糖肽部分合并，再經(jīng)活性炭吸附、乙醇沉淀、脫水千燥，得到符合藥 用標準的甘露聚糖肽。經(jīng)過上述超濾、水解步驟，本發(fā)明制得的甘露聚糖肽純 度高，可達90 98%。
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
具體實施例方式
實施例1
發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，見中國專利CN1172952C說明書第3 4 頁所公開的內(nèi)容，即a -溶血鏈球菌H,S-33號菌的深層發(fā)酵液經(jīng)過滅活、濃縮、 乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物1000g加10000ml的純化 水，在攪拌下進行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH2.0 2.5，靜置、離心或濾過 除去沉淀物，清液在攪拌下加濃度95%乙醇至75%乙醇濃度，靜置，離心或濾過 分離沉淀；沉淀物再加純化水如上述步驟反復溶解、沉淀六次，干燥，得甘露 聚糖肽粗品115g;粗品加10倍量(W/V)的純化水溶解，過濾除去不溶物，清 液用300000分子量的濾膜超濾大分子甘露聚糖肽，濾液用截留10000分子量的 濾膜進行濃縮處理。大分子甘露聚糖肽水溶液調(diào)整pH值7. 5 8. 0，加50000U/g 的溶菌酶100ml，混勻，40。C保溫水解4小時，測定重均分子量在50000至80000 之間，加熱煮沸10分鐘，冷卻，調(diào)節(jié)pH值3.0左右，過濾至清，與上述濾液 的濃縮液合并，加濃度95%乙醇至75%乙醇濃度，靜置，離心分離沉淀，沉淀物 用無水乙醇、丙酮脫水后干燥即得口服用甘露聚糖肽原料。此法甘露聚糖肽得 量在92 98g，純度達95%，按發(fā)酵產(chǎn)物計收率為9. 2 9. 8%，按粗制品計收率 為80 85%。
實施例2
發(fā)酵產(chǎn)物的制備同實施例1。發(fā)酵產(chǎn)物1000g加10000ml的純化水，在攪拌 下進行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH2.5 3.5，靜置、離心或濾過除去沉淀物， 清液在攪拌下加濃度90%乙醇至80%乙醇濃度，靜置，離心或濾過分離沉淀；沉 淀物再加純化水如上述步驟反復溶解、沉淀六次，干燥，得甘露聚糖肽粗品115g; 粗品加10倍量(W/V)的純化水溶解，過濾除去不溶物，清液用300000分子量 的濾膜超濾大分子甘露聚糖肽，濾液用截留10000分子量的濾膜進行濃縮處理。 大分子甘露聚糖肽水溶液調(diào)整pH值7. 5 8. 0，加5%鹽酸使之鹽酸濃度為1%， 加熱6(TC，回流下水解40分鐘，測定重均分子量在50000至80000之間，冷 卻，用NaOH中和后與上述濾液的濃縮液合并，用20倍量(W/V)的蒸餾水溶解， 按重量5%的比例加入活性炭，10(TC保溫60分鐘，冷卻、濾過，清液用濃度50% 乙醇沉淀，靜置、離心或濾過分離沉淀物，無水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射 用甘露聚糖肽原料。此法甘露聚糖肽得量在80 92g，純度達96%，按發(fā)酵產(chǎn)物 計收率為8. 0 9. 2%，按粗制品計收率為69. 5 80%。
權(quán)利要求
1.一種高純度甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟(1)制備發(fā)酵產(chǎn)物α-溶血鏈球菌H1S-33號菌的深層發(fā)酵液，經(jīng)滅活、濃縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物；(2)提取及粗品的制備發(fā)酵產(chǎn)物加3～10倍量(W/V)的純化水，在攪拌下進行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH1.5～3.5，靜置、除去沉淀物，清液在攪拌下加濃度90％以上乙醇至40％～80％乙醇濃度，靜置，分離沉淀；沉淀物加純化水按步驟(2)反復溶解、沉淀，干燥得甘露聚糖肽粗品；(3)大分子甘露聚糖肽的分離用截留10～30萬分子量的濾膜濾除甘露聚糖肽粗品中的大分子甘露聚糖肽，濾液用截留1～5萬分子量的濾膜進行濃縮處理，得甘露聚糖肽水溶液；(4)大分子甘露聚糖肽的水解將大分子甘露聚糖肽用溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進行水解。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高純度甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于,所述步 驟(4)中酶水解的步驟如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V)的純 化水溶解，調(diào)整pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉'酶和纖維素酶中任意一種，20 6(TC保溫4 20小時，加熱至沸，冷卻至室 溫，調(diào)整pH2.0 3.0，濾過，得甘露聚糖肽水溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高純度甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，所述步 驟(4)中酸水解的步驟如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V)濃度 0.5 5%鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60 105i:并 保溫0.5 8小時，冷卻，調(diào)整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意所述一種高純度甘露聚糖肽的制備方法，其特征在 于，將步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，過濾至清，用濃度 50 80%乙醇沉淀，靜置、分離沉淀物，干燥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意所述一種高純度甘露聚糖肽的制備方法，其特征在-于，將步驟(3)和步驟(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，用5 20倍量(W/V) 的蒸餾水溶解，按O. 1 5%(重量)的比例加入活性炭，70 10(TC保溫10 60分鐘，冷卻、濾過，清液用濃度50 80%乙醇沉淀，靜置、分離沉淀物， 干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度甘露聚糖肽的制備方法。該方法包括如下步驟制備發(fā)酵產(chǎn)物，提取及粗品的制備，大分子甘露聚糖肽的分離，大分子甘露聚糖肽的水解。本發(fā)明經(jīng)過超濾、水解步驟，制備的甘露聚糖肽純度高，可達90～98％。
文檔編號C12P21/02GK101186941SQ20071009310
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者曾康芬, 麗 李, 泉 江, 王君山, 琳 艾, 郭才旺, 爽 陳, 馬宏偉 申請人:成都川抗萬樂藥業(yè)有限公司