專利名稱：一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用以及新材料、化工產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用生物法從蠶蛹、蠅蛆以及其它昆蟲的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，具體地說，是應(yīng)用以多種微生物酶共酶解和固定化全細(xì)胞生物反應(yīng)器生物轉(zhuǎn)化從昆蟲皮殼原料中制取甲殼素和/或殼聚糖。
背景技術(shù)：
甲殼素又名甲殼質(zhì)，學(xué)名幾丁質(zhì)(chitin)，是一種直鏈天然氨基多糖，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一帶有正電荷的可食性動物纖維。甲殼素在自然界的儲量僅次于纖維素，每年生物圈的生物合成量約有100億噸，是地球上第二大生物資源。作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)，甲殼素主要分布于真菌、原生生物和無脊椎動物，在高等動物則主要分布于關(guān)節(jié)、蹄、足等以及肌肉與骨的接合處。長期以來，由于甲殼素不溶于水、稀酸、稀堿和大多數(shù)有機(jī)溶劑的惰性特點(diǎn)，一直沒有受到應(yīng)有重視。但近幾十年來，隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的巨大進(jìn)步，甲殼素的理化特性、生物活性和功能特點(diǎn)逐漸被人們所認(rèn)識，特別是甲殼素及其衍生物作為一種新型原料和材料在制藥、組織工程、精細(xì)化工、材料與紡織工業(yè)、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境保護(hù)諸多方面的應(yīng)用價值，正在被快速地展現(xiàn)出來，受到人們的廣泛關(guān)注，其產(chǎn)業(yè)化的深度和廣度正在蓬勃推進(jìn)，而其對人體和環(huán)境有益無害的“綠色原料”特性，更是符合時代潮流，得到了人們的青睞，展示了非常美好的市場前景。
雖然甲殼素是一種優(yōu)良的生物原料，但其作為和蛋白質(zhì)以及某些無機(jī)物緊密結(jié)合的生物結(jié)構(gòu)成分，提取并不容易。目前全球范圍內(nèi)用于制取甲殼素、殼聚糖(甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物，可大大增加溶解度)及其衍生物的主流工藝是化學(xué)法，其制備過程中使用大量的酸堿和有害的化學(xué)試劑，產(chǎn)生大量的廢水廢料，嚴(yán)重污染環(huán)境特別是水體環(huán)境；高頻度、長時間的高溫處理過程帶來了巨大的能源消耗；頻繁的洗滌凈化程序和稀酸、稀堿的回收處理難度又導(dǎo)致寶貴的清潔淡水被大量消耗浪費(fèi)；凡此種種，為這一“綠色原料”的可持續(xù)開發(fā)生產(chǎn)和深一步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用蒙上了重重的陰影。正因如此，近年來，人們開始將目光轉(zhuǎn)向了生物方法，目前主要是生物發(fā)酵的方法，即通過對主要原料絲狀真菌的發(fā)酵，獲得足量的菌絲體，再以菌絲體為原料，采用微生物酶和化學(xué)法相結(jié)合的方法提取甲殼素和殼聚糖。該方法條件溫和，可減少人力、物力和能耗，質(zhì)量易控，也能大幅度地減輕環(huán)境污染，但由于微生物體內(nèi)甲殼素含量遠(yuǎn)不及節(jié)肢動物(尤其是目前大量使用的甲殼綱和昆蟲綱動物)以及真菌發(fā)酵時間漫長等原因，生物發(fā)酵法生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖在產(chǎn)量和效率上還不夠理想，其生產(chǎn)成本過高，真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還要假以時日。
目前制取甲殼素最常用的原料是工業(yè)廢棄的蝦、蟹殼，其化學(xué)組成為40％無機(jī)物，主要是CaCO3；30％有機(jī)物，主要是蛋白質(zhì)；甲殼素含量約占20-25％。因此，根據(jù)蝦、蟹殼化學(xué)組成特點(diǎn)采用的提取工藝路線是凈化處理-濃酸脫鈣-稀堿脫蛋白-氧化劑脫色(非必需)-濃堿脫乙酰基-殼聚糖。該工藝的缺點(diǎn)已如前述，而且，其原料來源還存在產(chǎn)地和運(yùn)輸成本的限制。另一類主要原料是絲狀真菌菌絲體，如發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)生的菌絲體廢渣，甲殼素含量可達(dá)20-22％。其提取工藝的優(yōu)點(diǎn)和局限性亦如前述。并且，生物發(fā)酵法目前只是獲得原料，后續(xù)制取甲殼素和殼聚糖，仍主要采用化學(xué)法，故仍然存在環(huán)境污染問題。
近年來，多種昆蟲綱動物皮殼中含有豐富甲殼素的事實(shí)，引起人們的極大關(guān)注。研究證實(shí)，家蠶蛹皮中所含甲殼素高達(dá)33％-44％，而干蛆皮所含甲殼素更高達(dá)35％-54.8％，而且此類昆蟲皮殼中幾乎不含鈣質(zhì)等無機(jī)物，有利于甲殼素的分離提取，是頗為理想的甲殼素生產(chǎn)原料。然而，盡管蠶蛹和蠅蛆皮殼具有上述優(yōu)點(diǎn)，但近期的實(shí)踐表明，用化學(xué)法從蠶蛹和蠅蛆制取甲殼素存在困難，主要表現(xiàn)為皮殼中脂肪太多，色素太多，脫乙?；щy，因而生產(chǎn)出的甲殼素產(chǎn)品質(zhì)量不高。此外，由于提取工藝中增加了化學(xué)脫脂步驟，強(qiáng)化了脫色和脫乙?；奈锢?化學(xué)處理力度，產(chǎn)生了更大的廢液、廢料污染和更多的能耗。
因此，如何改進(jìn)工藝，使之能夠利用昆蟲皮殼開發(fā)出高質(zhì)量的甲殼素及相關(guān)產(chǎn)品，同時又能有效控制能耗和環(huán)境污染，是甲殼素研發(fā)和生產(chǎn)人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于應(yīng)用發(fā)酵工程和酶工程的技術(shù)手段，結(jié)合部分物理和化學(xué)方法，設(shè)計并實(shí)施了一套以生物法為主的甲殼素/殼聚糖制取方法，用以從蠶蛹、蠅蛆及其它昆蟲皮殼中獲得甲殼素和殼聚糖，旨在克服傳統(tǒng)工藝的上述弊端，在明顯提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率的前提下，降低能耗，大幅減少酸、堿、氧化劑和其它有害化學(xué)品的使用量以及廢液、廢渣的排放，消除其對環(huán)境的污染和人體健康的威脅，并能夠同時生產(chǎn)出附加值高的副產(chǎn)品，綜合利用資源，提高生產(chǎn)效益，從而提供一種增效節(jié)耗、環(huán)境友好、資源節(jié)約的綠色制取工藝，達(dá)到有效、可持續(xù)地促進(jìn)甲殼素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的目的。
本發(fā)明還涉及將提取的甲殼素/殼聚糖，用生物學(xué)和/或化學(xué)方法進(jìn)一步加工成特種殼聚糖或殼聚糖衍生物。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過干法或濕法破碎細(xì)粉化處理；將得到的細(xì)粉體經(jīng)來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進(jìn)行共酶解反應(yīng)，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質(zhì)；用兩步法脫色，即先以H2O2初步脫色，再用富含過氧化氫合成-還原酶系的粗酶液進(jìn)行酶法脫色并還原H2O2；收集脫色后物料，洗滌、干燥后制成甲殼素產(chǎn)品；通過米根霉全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器進(jìn)行循環(huán)脫乙酰反應(yīng)，得到不同DD值的殼聚糖。還可進(jìn)一步應(yīng)用化學(xué)方法或者生物方法，將所得的甲殼素或殼聚糖制備成特種殼聚糖或改性殼聚糖。
所述細(xì)粉化處理，是指將鮮蠶蛹或鮮蠅蛆，清洗除雜、充分瀝水后先行機(jī)械破皮處理，用諸如液壓式或螺旋式壓榨機(jī)的壓榨法擠出內(nèi)容物(所述內(nèi)容物另行處理)，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍6小時，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體；如為干蛹或干蛆，則凈化后直接預(yù)凍、粉碎處理成細(xì)粉體。
所述微生物粗酶液，是指用不同出發(fā)菌株誘導(dǎo)馴化而得的高產(chǎn)脂肪酶活的產(chǎn)朊假絲酵母(保藏號CCTCC NO.M207053)，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年4月24日，分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母ODK-CC1(Candida utilis ODK-CC1)；高產(chǎn)蛋白酶活的枯草芽孢桿菌(保藏號CCTCC NO.M207028)，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年3月23日，分類命名枯草芽孢桿菌ODK-BK1(BacillussubtilisODK-BK1)；高產(chǎn)H2O2及其氧化-還原酶系的采絨革蓋菌(又名云芝)(保藏號CCTCC NO.M207024)，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年3月23日，分類命名云芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)，分別經(jīng)好氧液體深層發(fā)酵后，去除菌體而得到的胞外酶粗酶液。
所述共酶解反應(yīng)，是指將所獲細(xì)粉體以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃溫水浸泡30min，抑制雜菌及無關(guān)酶活，再加入與溫水容積等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液，在40℃恒溫下，于反應(yīng)釜內(nèi)將皮殼粉混懸液和粗酶液緩慢混合，充分?jǐn)嚢?，進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)終止后以2500r/min離心進(jìn)行固、液分離，溶于反應(yīng)液中的蛋白和脂肪及其分解產(chǎn)物另法提取收集。
所述兩步法脫色，是指先將酶解反應(yīng)后的固體物料，加入少量稀堿(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更換堿液后重復(fù)，共3次，以徹底脫除少量殘余脂肪和蛋白質(zhì)以及殘余酶活，過濾收集濾渣，水洗3遍后，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，脫除原料中難解離色素并陸續(xù)將H2O2轉(zhuǎn)化為無毒無害的CO2和H2O，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢離心(2500r/min)，將沉淀洗滌、干燥，得白色粉末狀甲殼素。
所述脫乙酰反應(yīng)，是指將所得甲殼素用40℃溫水懸浮、充分混勻后，循環(huán)流加于米根霉(保藏號CCTCC NO.M207054)，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年4月24日，分類命名米根霉ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)，全細(xì)胞固定化反應(yīng)器中，進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，根據(jù)產(chǎn)品和用途對脫乙酰度的要求，用電位滴定法動態(tài)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的DD值(脫乙酰度)，直至達(dá)到所要求的DD值標(biāo)準(zhǔn)，終止反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，按1/3容積濃縮后，真空或冷凍干燥，得殼聚糖。
所述制備特種殼聚糖，本發(fā)明采用生物法，即用產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行液體深層發(fā)酵殼聚糖，獲得具有高度水溶性的甲殼寡糖。
所述制備改性殼聚糖，本發(fā)明采用化學(xué)法，即將甲殼素加工為堿性甲殼素膠體溶液后，分別用環(huán)氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈處理，可分別生成羥乙基甲殼素、羧甲基甲殼素或氰乙基甲殼素。
本發(fā)明的方法也適用于其它昆蟲皮殼甲殼素的制取，如蟬蛻、蜚蠊、撣子蟲等。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用蛹皮、蛆皮生產(chǎn)甲殼素，有助于治理環(huán)境，資源化利用，變廢為寶，并帶動蠶蛹和蠅蛆的深加工產(chǎn)業(yè)；本發(fā)明選用蠶蛹和蠅蛆皮殼制取甲殼素，除其含量高以外，還在于蛹皮甲殼素主要為α-型甲殼素，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，對于甲殼素的工業(yè)化應(yīng)用非常重要；而蠅蛆殼聚糖在低重金屬離子含量、低灰分含量方面明顯優(yōu)于蝦、蟹殼殼聚糖，兩者均為優(yōu)良的甲殼素制取原料；本發(fā)明采用了以酶法為主的脫除脂肪、蛋白和色素工藝，由于酶反應(yīng)的高選擇性，可以有效地克服昆蟲皮殼中的高脂肪、高色素對甲殼素提取造成的困難，明顯提高甲殼素的得率和質(zhì)量；本發(fā)明大大減少了酸、堿和有機(jī)溶劑在制取工藝中的應(yīng)用，而代之以溫和的微生物酶法作為核心工藝，不僅基本消除了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有害溶劑廢水和廢渣排放造成的環(huán)境污染，減少了相關(guān)設(shè)備和試劑成本，而且基本杜絕了強(qiáng)烈化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的質(zhì)量問題以及產(chǎn)品中化學(xué)溶劑的殘留帶來的潛在健康威脅；本發(fā)明采用全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器循環(huán)酶解反應(yīng)脫乙?；鹿に?，不僅過程簡單、沒有污染，而且可以準(zhǔn)確掌握脫乙酰度，按產(chǎn)品和用途需要生產(chǎn)不同DD值的殼聚糖，有益于產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及種類、用途的多元化；本發(fā)明的又一突出優(yōu)點(diǎn)是大部分的工作單元在常溫、中溫下進(jìn)行，大幅減少了熱能需要，降低了能耗；此外，化學(xué)品用量的減少也相應(yīng)減少了水的用量和廢水排放，節(jié)約了用水；本發(fā)明的另一個有益效果是能夠充分進(jìn)行資源綜合開發(fā)，得到一系列附加值高的副產(chǎn)物，提高綜合經(jīng)濟(jì)效益，包括1)通過脂肪酶的解離，可以獲得純度高的蠶蛹油脂，因其雜質(zhì)少，可進(jìn)行充分開發(fā)利用，如精制蠶蛹油、提取脂肪酸、制備表面活性劑和聚酰胺纖維(尼龍)、制造潤滑油和肥皂等。
2)通過蛋白酶的解離，可以獲得純度高的蠶蛹或蠅蛆蛋白，可制備食用或飼用蛋白質(zhì)、制取蛹酪素、制備蛋白水解物和氨基酸制品等。
3)在用發(fā)酵法制備粗酶液時，可獲得高生物量的有益微生物菌體，其中云芝(采絨革蓋菌)、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母均為極度安全的可食用微生物，可直接用作食用或飼用微生物菌劑或微生態(tài)制劑，也可制成相關(guān)產(chǎn)品。


圖1表示蛹?xì)ぜ?xì)粉體共酶解前后脂肪含量和蛋白質(zhì)含量比較；圖2表示蠅殼細(xì)粉體共酶解前后脂肪含量和蛋白質(zhì)含量比較；圖3表示固定化細(xì)胞流程；圖4表示上流式米根霉全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器脫乙酰流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
為了有效實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，發(fā)明人進(jìn)行了如下工作1.確定發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母制取脂肪酶粗酶液工藝產(chǎn)朊假絲酵母出發(fā)菌株分離自釀酒酒糟，由本發(fā)明人反復(fù)誘導(dǎo)馴化為高產(chǎn)脂肪酶活菌株后，送武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號CCTCC NO.M207053)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年4月24日，分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母ODK-CC1(Candida utilisODK-CC1)。
粗酶液制備過程產(chǎn)朊假絲酵母接種于PDA斜面培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)(復(fù)壯)5天，轉(zhuǎn)種于裝有300mlPDA液體培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，25℃，100r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3天，再以5％的接種量，將此菌種培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至裝有6LPDA液體培養(yǎng)基的10L不銹鋼氣升式發(fā)酵罐中，25℃，100r/min好氧深層液體培養(yǎng)約5天，測得脂肪酶活達(dá)到高峰時，終止發(fā)酵，用管式菌體離心機(jī)去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用于本工藝的共酶解步驟。
2.確定發(fā)酵枯草桿菌制取蛋白酶粗酶液工藝枯草桿菌出發(fā)菌株分離自日本產(chǎn)有機(jī)小粒納豆，由本發(fā)明人反復(fù)誘導(dǎo)馴化為高產(chǎn)蛋白酶活菌株后，保藏編號CCTCC NO.M207028，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年3月23日，分類命名枯草芽孢桿菌ODK-BK1(BacillussubtilisODK-BK1)。
粗酶液制備過程枯草桿菌菌株接種于普通固體培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)(復(fù)壯)2天，轉(zhuǎn)種于裝有300ml的去瓊脂液體培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，25℃，100r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3天，再以5％的接種量，將此菌種培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至裝有6L液體培養(yǎng)基的10L不銹鋼氣升式發(fā)酵罐中，25℃，100r/min好氧深層液體培養(yǎng)約3天，測得脂肪酶活達(dá)到高峰時，終止發(fā)酵，用管式菌體離心機(jī)去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用于本工藝的共酶解步驟。
3.確定發(fā)酵采絨革蓋菌制取過氧化氫合成酶-還原酶粗酶液工藝采絨革蓋菌(云芝)出發(fā)菌株購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心(菌株編號GIM5.178)，由本發(fā)明人反復(fù)馴化誘導(dǎo)為H2O2氧化-還原酶系高產(chǎn)菌株后，保藏編號CCTCC NO.M207024，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年3月23日，分類命名云芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)。
粗酶液制備過程云芝菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)(復(fù)壯)7天，轉(zhuǎn)種于裝有300mlPDA液體培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，28℃，150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5天，再以5％的接種量，將此菌種培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至裝有6L液體PDA培養(yǎng)基的不銹鋼氣升式發(fā)酵罐中，30℃，100r/min好氧深層液體培養(yǎng)約7天，測多酚過氧化物酶活達(dá)到高峰時，終止發(fā)酵，用管式菌體離心機(jī)去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用于本工藝的脫色步驟。
4.考察粗酶液共酶解反應(yīng)的效果1)粗酶液共酶解去除蛹?xì)ぜ跋墯ぶ竞偷鞍踪|(zhì)成分的效果①單因素分析比較共酶解前后蛹?xì)ず拖墯ぜ?xì)粉體的脂肪含量(索氏抽提法測定)，見表1。
表1 共酶解前后脂肪含量變化比較

②單因素分析比較共酶解前后蛹?xì)ず拖墯ぜ?xì)粉體的蛋白質(zhì)含量(凱氏定氮法測定)，見表2。
表2 共酶解前后蛋白質(zhì)含量變化比較

2)化學(xué)法和生物法對蠶蛹皮殼難解離色素脫色效果比較將H2O2氧化-還原酶系(生物法)蛹?xì)っ撋匦Чc高錳酸鉀-亞硫酸氫鈉(化學(xué)法)的蛹?xì)っ撋匦ЧM(jìn)行比較，結(jié)果見表3。
表3 高錳酸鉀-亞硫酸氫鈉和H2O2氧化-還原酶系脫色素效果比較


5.米根霉發(fā)酵、固定化反應(yīng)器制備及甲殼素脫乙酰反應(yīng)1)確定米根霉發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件白色米根霉出發(fā)菌株購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心(菌株編號3038)，由本發(fā)明人反復(fù)馴化誘導(dǎo)為甲殼素脫乙酰酶高產(chǎn)菌株后，保藏編號CCTCC NO.M207054，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間為2007年4月24日，分類命名米根霉ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)。
米根霉細(xì)胞增殖過程白色米根霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)(復(fù)壯)7天，轉(zhuǎn)種于裝有300mlPDA液體培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，25℃，120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5天，再以5％的接種量，將此菌種培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至裝有6L液體PDA培養(yǎng)基的不銹鋼氣升式發(fā)酵罐中，28℃，100r/min好氧深層液體培養(yǎng)約5d，測甲殼素脫乙酰酶酶活達(dá)定值時，終止發(fā)酵，用管式菌體離心機(jī)收集菌體，加保護(hù)劑后凍干制成菌粉。
2)制備全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器①全細(xì)胞固定化將2％海藻酸鈉溶液與上述干菌粉按液∶固＝5∶1的比例充分混合，得混懸液約3L，室溫下以10ml/min的速度，通過針泵滴入0.2mol/Lde CaCL中，形成直徑約5.0-5.5mm的小珠，全部混懸液滴注完畢后，將形成的小珠裝入反應(yīng)器裝置。
②上流式生物反應(yīng)器制作制作圓柱狀不銹鋼上流式反應(yīng)器主體，內(nèi)徑50.8cm×高度584cm，工作容積10L；輔以底物流入、產(chǎn)物流出、菌培養(yǎng)基流加及惰性氣體加壓等功能通道。
3)脫乙酰反應(yīng)及效果評定本發(fā)明工藝路線所得甲殼素，用40℃溫水懸浮、充分混勻后，從底物入口緩慢流加于米根霉全細(xì)胞固定化反應(yīng)器中，進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，產(chǎn)物出口收集反應(yīng)液后，由閉路通道循環(huán)回流到反應(yīng)器，每一循環(huán)周期約60min。轉(zhuǎn)化反應(yīng)期間如反應(yīng)液黏度偏大，用惰性氣體加壓洗脫產(chǎn)物。反應(yīng)終止的時間點(diǎn)依對產(chǎn)物脫乙酰度的要求以及反應(yīng)器酶活強(qiáng)度而定。反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對脫乙酰度的影響見表4。
表4 固定化細(xì)胞脫乙酰反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對產(chǎn)物脫乙酰度的影響

實(shí)施例1蠶蛹甲殼素的制備a.預(yù)處理收集鮮家蠶蛹10kg，清洗除雜、充分瀝水后用絞肉機(jī)機(jī)械破皮處理，用壓榨法(液壓式或螺旋式壓榨機(jī))擠出內(nèi)容物(另行處理)，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍6h，結(jié)塊后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.所獲細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，在40℃恒溫下，于反應(yīng)釜內(nèi)將皮殼細(xì)粉體和粗酶液緩慢混合，進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，反應(yīng)時間18h，將大部分脂肪、蛋白質(zhì)溶解于反應(yīng)液中，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離，溶于反應(yīng)液中的蛋白和脂肪產(chǎn)物另法提取。
c.收集酶解反應(yīng)后的固體物料，加入少量稀堿(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更換堿液后按相同時間重復(fù)煎煮過程，共3次，徹底脫除少量殘余脂肪和蛋白質(zhì)，過濾，濾液另行處理。
d.濾渣水洗3遍后，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的采絨革蓋菌去菌體粗酶液進(jìn)行酶反應(yīng)，脫除原料中難解離的色素并陸續(xù)將H2O2轉(zhuǎn)化為無毒無害的CO2和H2O，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢離心(2500r/min)，將沉淀洗滌、干燥，得白色粉末狀甲殼素。
實(shí)施例2蠅蛆殼聚糖的制備a.預(yù)處理收集鮮蠅蛆10kg，清洗除雜、充分瀝水后用絞肉機(jī)機(jī)械破皮處理，用壓榨法(液壓式或螺旋式壓榨機(jī))擠出內(nèi)容物(另行處理)，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍6h，板結(jié)后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.所獲細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，在40℃恒溫下，于反應(yīng)釜內(nèi)將皮殼細(xì)粉體和粗酶液緩慢混合，進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，反應(yīng)時間18h，將大部分脂肪、蛋白質(zhì)溶解于反應(yīng)液中，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離，溶于反應(yīng)液中的蛋白和脂肪產(chǎn)物另法提取。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍，瀝干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的采絨革蓋菌去菌體粗酶液進(jìn)行酶法脫色，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢進(jìn)行離心(2500r/min)，將沉淀洗滌、干燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.將洗滌后的沉淀物按固∶液＝1∶4的配比量、或已干燥的甲殼素按固∶液＝1∶8的配比量，與40℃溫水混合為懸浮液，充分混勻后，定量循環(huán)流加于上流式米根霉全細(xì)胞固定化反應(yīng)器中，進(jìn)行脫乙酰基反應(yīng)，用電位滴定法動態(tài)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的DD值(脫乙酰度)，直至反應(yīng)液樣本的DD值＞85％、黏度低于100×10-3Pa·s時，終止反應(yīng)。
f.收集反應(yīng)產(chǎn)物，按1/3容積減壓濃縮后，真空或冷凍干燥，得高脫乙酰度、低黏度殼聚糖。
實(shí)施例3乳桿菌發(fā)酵制備甲殼低聚糖
a.預(yù)處理家蠶蛹10kg清洗除雜、破皮處理后，壓榨法擠出內(nèi)容物，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒溫下，于反應(yīng)釜內(nèi)緩慢混合，間歇攪拌，進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍，瀝干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的采絨革蓋菌去菌體粗酶液進(jìn)行酶法脫色，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢離心(2500r/min)，沉淀物洗滌、干燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.將甲殼素按固∶液＝1∶8的配比量，用40℃溫水重新懸浮，混勻后定量循環(huán)流加于上流式米根霉全細(xì)胞固定化反應(yīng)器中，進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，電位滴定法動態(tài)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的DD值(脫乙酰度)，直至反應(yīng)液樣本的DD值＞70％，終止反應(yīng)。
f.收集反應(yīng)液，定容定濃度后作為碳源及反應(yīng)底物，添加1％多價蛋白胨為氮源(可直接來自副產(chǎn)品蠶蛹蛋白及其水解產(chǎn)物)和少量無機(jī)鹽，按2％接種量接種本發(fā)明人誘導(dǎo)馴化、能夠以殼聚糖為營養(yǎng)物質(zhì)的乳桿菌，厭氧深層液體發(fā)酵，直至菌體生物量至少達(dá)到＞1.0×109cfu/ml后，終止發(fā)酵，用特制菌體分離機(jī)去除菌體，發(fā)酵液直接濃縮，真空或冷凍干燥，得固體半透明粉末狀、其中80％相對分子量＜3000的甲殼寡糖。
實(shí)施例4羧甲基甲殼素的制備a.預(yù)處理鮮蠅蛆10kg清洗除雜、破皮處理后，壓榨法擠出內(nèi)容物，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒溫下于反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，時間18h，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍后瀝干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進(jìn)行酶法脫色，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢離心(3500r/min)，沉淀物洗滌、干燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.所獲甲殼素先加入10倍量的異丙醇中攪拌溶脹，瀝干后再加入甲殼素質(zhì)量約5倍的45％氫氧化鈉溶液，15℃以下持續(xù)浸泡3h，間歇攪拌，反應(yīng)結(jié)束后濾去剩余反應(yīng)液，得約相當(dāng)于甲殼素質(zhì)量3倍的堿性甲殼素膠體溶液；以1.2倍于甲殼素的質(zhì)量比例稱取固體氯乙酸，分次加入該膠體溶液中，每次間隔數(shù)分鐘，加畢，提升溫度至70℃，反應(yīng)3h，得可溶于水的羧甲基殼聚糖，加5倍蒸餾水溶解，冰醋酸調(diào)pH至7.0、抽濾后用70％乙醇洗滌、干燥，得白色粉末狀羧甲基殼聚糖。
實(shí)施例5蠶蛹油脂的提取a.預(yù)處理家蠶蛹30kg清洗除雜、破皮處理后，壓榨法擠出內(nèi)容物待用，皮殼烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒溫下于反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，時間18h，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離。
c.固體用于甲殼素提取。收集富含脂質(zhì)蛋白質(zhì)的分離液體，減壓濃縮至1/4容積，與先前擠壓出的內(nèi)容物混合，繼續(xù)濃縮至膏狀。
d.用浸出法進(jìn)行油脂提取將上述濃縮物移入浸出罐，裝罐量85％，采用逆流浸泡式浸出工藝，以6號抽提溶劑油為浸出溶劑、罐組式(共3個罐)浸出方式進(jìn)行油脂抽提，混合油放罐后，用98kPa蒸汽下壓、145kPa蒸汽上蒸，蒸脫蛹粕中殘留溶劑，檢測殘溶合格后，由出粕口排出脫脂蛹粕，繼續(xù)用于蛋白質(zhì)提取。
e.對浸出所得的混合油進(jìn)行蒸發(fā)、汽提，脫除混合油中的浸出溶劑以及易發(fā)揮組分，得蠶蛹毛油，控制毛油中溶劑殘留量＜0.05％，或閃點(diǎn)220℃。毛油可繼續(xù)精煉為精制蛹油。
實(shí)施例6蠅蛆蛋白的提取a.預(yù)處理蠅蛆20kg清洗除雜、破皮處理后，壓榨法擠出內(nèi)容物待用，皮殼烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍后，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細(xì)粉體。
b.細(xì)粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔凈溫水，以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒溫下于反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行共酶解脫脂脫蛋白反應(yīng)，時間18h，反應(yīng)終止后離心(2500r/min)進(jìn)行固、液分離。
c.固體用于甲殼素提取。收集富含脂質(zhì)蛋白質(zhì)的分離液體，減壓濃縮至1/4容積，與先前擠壓出的內(nèi)容物混合，繼續(xù)濃縮至膏狀。
d.將蛆膏用3倍量的石油醚浸沒，60℃浸取4次，每次1h，浸畢離心(3500r/min，20min)進(jìn)行固液分離。
e.分離的液態(tài)混合油用于蛆油提取。將固體沉淀的灰色脫脂蛆粕，加蒸餾水?dāng)嚢璩蓜驖{，用0.25％NaOH溶解蛋白質(zhì)，過濾去除固形物，濾液用HCL調(diào)pH至4.5，靜置3h，加入飽和硫酸銨溶液，靜置、離心，沉淀即為蛋白質(zhì)，將此漿狀蛋白沉淀裝入透析袋，透析除鹽后用活性炭脫色，95％乙醇抽提，真空干燥，得精制蛆蛋白粉。
權(quán)利要求
1.一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過干法或濕法破碎細(xì)粉化處理；將得到的細(xì)粉體經(jīng)來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進(jìn)行共酶解反應(yīng)，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質(zhì)；用兩步法脫色，即先以H2O2初步脫色，再用富含過氧化氫合成-還原酶系的粗酶液進(jìn)行酶法脫色并還原H2O2；收集脫色后物料，洗滌、干燥后制成甲殼素產(chǎn)品；通過米根霉全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器進(jìn)行循環(huán)脫乙酰反應(yīng)，得到不同DD值的殼聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于進(jìn)一步用產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行液體深層發(fā)酵殼聚糖，獲得具有高度水溶性的甲殼寡糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于進(jìn)一步將甲殼素加工為堿性甲殼素膠體溶液后，分別用環(huán)氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈處理，分別生成羥乙基甲殼素、羧甲基甲殼素或氰乙基甲殼素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述細(xì)粉化處理，是指如果是鮮蠶蛹或鮮蠅蛆，則清洗除雜、充分瀝水后先行機(jī)械破皮處理，用諸如液壓式或螺旋式壓榨機(jī)的壓榨法擠出內(nèi)容物，收集皮殼，烘干至水分＜10％，0℃以下預(yù)凍6小時，用離心式碰撞粉碎機(jī)將其粉碎至平均粒度為150-250μm的細(xì)粉體；若是干蛹或干蛆，則凈化后直接預(yù)凍、粉碎處理成細(xì)粉體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述微生物粗酶液，是指用不同出發(fā)菌株誘導(dǎo)馴化而得的高產(chǎn)脂肪酶活的產(chǎn)朊假絲酵母(保藏號CCTCC NO.M207053)、高產(chǎn)蛋白酶活的枯草芽孢桿菌(保藏號CCTCC NO.M207028)、高產(chǎn)H2O2及其氧化-還原酶系的采絨革蓋菌(保藏號CCTCC NO.M207024)，分別經(jīng)好氧液體深層發(fā)酵后，去除菌體而得到的胞外酶粗酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述共酶解反應(yīng)，是指將所獲細(xì)粉體以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃溫水浸泡30min，抑制雜菌及無關(guān)酶活，再加入與溫水容積等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液，在40℃恒溫下于反應(yīng)釜內(nèi)將皮殼粉混懸液和粗酶液緩慢混合，充分?jǐn)嚢?，進(jìn)行共酶解脫脂、脫蛋白反應(yīng)，反應(yīng)時間18小時，反應(yīng)終止后以2500r/min離心進(jìn)行固、液分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述兩步法脫色，是指先將酶解反應(yīng)后的固體物料，加入少量稀堿中浸泡、煎煮2h，更換堿液后重復(fù)3次，過濾收集濾渣，水洗3遍后，先用5％H2O2煮沸1小時，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，脫除原料中難解離色素并陸續(xù)將H2O2轉(zhuǎn)化為無毒無害的CO2和H2O，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間18h，反應(yīng)畢離心分離，將沉淀洗滌、干燥得白色粉末狀甲殼素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述脫乙酰反應(yīng)，是指將所得甲殼素用40℃溫水懸浮、充分混勻后，循環(huán)流加于米根霉(保藏號CCTCC NO.M207054)全細(xì)胞固定化反應(yīng)器中，進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，根據(jù)產(chǎn)品和用途對脫乙酰度的要求，用電位滴定法動態(tài)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的DD值，直至達(dá)到所要求的DD值標(biāo)準(zhǔn)，終止反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，按1/3容積濃縮后，真空或冷凍干燥，得殼聚糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中制取甲殼素/殼聚糖的方法，包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過干法或濕法破碎細(xì)粉化處理；將得到的細(xì)粉體經(jīng)來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進(jìn)行共酶解反應(yīng)，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質(zhì)；用兩步法脫色；收集脫色后物料，洗滌、干燥后制成甲殼素產(chǎn)品；通過米根霉全細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器進(jìn)行循環(huán)脫乙酰反應(yīng)，得到殼聚糖；用產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行液體深層發(fā)酵殼聚糖獲得高度水溶性的甲殼寡糖。本發(fā)明有益效果提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率、降低能耗，大幅減少酸、堿、氧化劑和其它有害化學(xué)品的使用量以及廢液、廢渣的排放，并能同時生產(chǎn)出附加值高的副產(chǎn)品，綜合利用資源，提高生產(chǎn)效益。
文檔編號C12R1/125GK101078023SQ200710107079
公開日2007年11月28日 申請日期2007年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月18日
發(fā)明者吳力克 申請人:重慶百奧帝克微生態(tài)科技有限公司 被以下專利引用 (2),