專(zhuān)利名稱(chēng)：一種紫杉木霉菌株及其在制備木霉菌酯素中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種以南方紅豆杉內(nèi)生真菌紫杉木 霉菌株，及其在制備木霉菌酯素中的用途。
技術(shù)背景從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，是新藥創(chuàng)制的重要途徑。微生物是 自然界中天然產(chǎn)物的主要來(lái)源，植物內(nèi)生真菌作為其中的一個(gè)重要類(lèi)群，是 相對(duì)較新的研究領(lǐng)域。內(nèi)生真菌產(chǎn)生的豐富多樣的具多種生物活性的次生代 謝產(chǎn)物在現(xiàn)代醫(yī)藥和農(nóng)藥工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力，它們?cè)诳咕?、抗病毒?殺蟲(chóng)、抗腫瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。典型例子是產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)(Stierleefa/.， 1993)。另一方面從植物 內(nèi)生真菌也發(fā)現(xiàn)了許多新生物活性物質(zhì)，如從傳統(tǒng)藥用植物雷公藤分離到的 內(nèi)生真菌尺/7/y oc/acf/'e//asp.可產(chǎn)生3種新松胞菌素(cytochalasin)，對(duì)多種 人腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用(Wagenaarefa/,2000);從青蒿莖干中分離 的內(nèi)生真菌Co//etoWc/7i/A7 sp.能產(chǎn)生多種對(duì)病原真菌和植物病原細(xì)菌有良好 抑制作用的化合物，其MIC值一般在25~50 |jg/L (Lu ef a/., 2000)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種新的菌株一一紫杉木霉 (7>Vc/70cfem7a fax//)菌株，及其在制備具有抗腫瘤抗真菌活性的木霉菌酯素 (Trichodermisin)中的用途。本發(fā)明的紫杉木霉(77yc/ octem7a fax/7)菌株，保藏號(hào)CGMCC 1672; 在PDA固體培養(yǎng)基上20。C 72小時(shí)菌落直徑37 mm, 25。C時(shí)55 mm， 30。C時(shí) 71mm， 35。C時(shí)不生長(zhǎng)；在PDA上的最適溫度為30。C; 25。C光暗培養(yǎng)7 14 天，PDA、 MEA菌落邊緣形成大量白色皰狀突起，皰狀突起可愈合；瓶梗在
皰狀突起中的分生孢子梗上密集輪生，瓶梗安瓿形，頂部明顯變細(xì)；分生孢 子無(wú)色，光滑，橢圓形，1.7-2.0 (1.9)X2.2-2.5 (2.3) |jm。本發(fā)明的菌株是從南方紅豆杉分離得到的，它屬于真菌界(Fungi)，子 囊菌門(mén)(Ascomycota )，糞殼菌綱(Sordariomycetes ), 肉座菌亞綱(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，有絲分裂真菌肉座菌目(mitosporic Hypocreales)，木霉屬(7"廠/c/7ocfem a)。本發(fā)明的菌株在制備木霉菌酯素中的用途，其特征在于以人工發(fā)酵生 產(chǎn)的紫杉木霉的發(fā)酵液為原料，濃縮發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸 乙酯，得到化合物木霉菌酯素。本發(fā)明提供了一種新的紫杉木霉菌株，以該菌株制備的新化合物木霉菌 酯素具有抗腫瘤抗真菌活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物提供了天然藥物 化學(xué)研究基礎(chǔ)。


圖1之A-D為本發(fā)明的紫杉木霉菌株的形態(tài)特征照片，其中A為MEA 菌落形態(tài)；B為PDA菌落形態(tài)；C為分生孢子梗和瓶梗；D為分生孢子。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、紫杉木霉(7 ycA OGfem7a fax/7)菌株的分離培養(yǎng) 在實(shí)驗(yàn)室中按下列條件分離培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的紫杉木霉菌株。 從我國(guó)江西官山自然保護(hù)區(qū)采集南方紅豆杉(raxwsma/re/)樹(shù)皮及樹(shù)枝，將 采集的南方紅豆杉的樹(shù)皮及樹(shù)枝在5%次氯酸鈉表面消毒2min，無(wú)菌水漂洗 后置于無(wú)菌濾紙上吸干水，用無(wú)菌刀片去除外皮層，并將其切成1cm左右大 小組織片，將組織片移接在2%含100pg ，m^氨芐青霉素和鏈霉素的水瓊脂 平板上，24'C培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后，將菌絲頂端移接到PDA固體培養(yǎng)基上， 連續(xù)重復(fù)純化3次，獲得純培養(yǎng)。紫杉木霉菌株的形態(tài)特征見(jiàn)圖1。 經(jīng)測(cè)定，該菌株具有特異性序列如下TCGCGGGGAGGATGAGGACAAGCCCAGTAGGGT丌TCCCTTGTT AGGAGTGTCACTGGTGACCCTGCGCTCGACGGCTCTTTTTCGCGGAG AACAGTTGCCTACATGTCATAGGAATGTGTTAGCGTTTTGAAACATTTC AGGATAAATGGGAATAATAAAAGGAGAATTGAAGAGAAGTGGGCAGATA ATCAAGTGTCATGAAAATGGATATGAGGTGAGATGGTGGCAAATGAAG CTGCAGCGAGAAAACATACACCACCATTCGTTCCCATGCCAAAGGCCC 丌GAGTCGCCTC丌CTCCGTCGACGGCGTGCCTGGGTAAAAATCCTG GTAGCGATTCCTGGAAGGGGTCGCCATCGCCATGGTAAATGTGCGAA GCTCCAGTATTTCGTAAACTGAGGTTTG丌TCTGTTCCTGAACTTCCTA GAGTATGGCTTGGATCCAAGTCTTCCAGTAGCTCAACGGCGC。實(shí)施例2 、化合物木霉菌酯素的分離提取木霉菌菌株ZJUF0986發(fā)酵培養(yǎng)，濃縮發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，減壓回 收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素，該化合物為黃褐色液體。經(jīng)測(cè)定，其 結(jié)構(gòu)式為，EIMS確定分子量292，m/z(rel.int): (292[M+]，40)，277(75)，149 (25)， 107 (50), 91 (48), 43(100);紅外光譜(KBr)確定具有C=0(1735 cm-1), C-O畫(huà)C (1220,1080 cm—1) and C=C (977cm'1 );采用高分辨核磁共振儀(500MHz)測(cè) 定了該化合物的1H-NMR、 13C-NMR、 H-HCOSY、 HMBC、 HMQC、 DEPT (135)等二維相關(guān)譜,確定了化合物所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬。 新化合物木霉菌酯素的核磁共振圖譜數(shù)據(jù)為
No.1H-NMR13C-NMR1H-1HCOSY15.4175.12-140.335.57118.64-CH21.43d，1.93d,24.553.61d70.5H4a6-40.57-CH22.53m， 1.94m36.783.83d79.19-CH22,83d，3.12d47.910-65.611-CH21.96m28.012-CH30.72s5.9113-CH31.71s14.29Hi14-CH32.06s21.115-CH32.00s21.216-CH30.93s19.217-CH24.14dd60.518-171.119CH31.27m16.0新化合物木霉菌酯素的抗菌生物測(cè)定馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):馬鈴薯200g，葡 萄糖20g,瓊脂20g,水1000ml 。以植物病原真菌立枯絲核菌(尺/7/zoctoA /aso/aA7/')、灰葡萄孢(8ofAyf/'s c/'nerea)及根霉(R/ /zopus sp.)為指示菌株，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定新化合 物木霉菌酯素對(duì)指示菌的抑制作用。將木霉菌酯素配成不同濃度的藥液按一 定量分別加入到預(yù)先溶化的一定量的PDA固體培養(yǎng)基中，混勻制成一定濃度 的帶毒培養(yǎng)基，將帶毒培養(yǎng)基倒入直徑9 mm的培養(yǎng)皿中制成平板，同時(shí)用 無(wú)毒培養(yǎng)基作對(duì)照，各種濃度和對(duì)照重復(fù)3次。用打孔器打出菌絲塊放在平 板中央。在24'C培養(yǎng)至菌絲生長(zhǎng)接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)測(cè)定菌落直徑，每個(gè)菌落 十字交叉測(cè)量2次，計(jì)算出每種處理菌落平均直徑。按公式計(jì)算藥劑對(duì)菌絲 生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率，采用劑量對(duì)數(shù)-抑制率機(jī)率值法計(jì)算求得半抑制濃度 (IC50)。
生長(zhǎng)速率法測(cè)定表明，化合物木霉菌酯素對(duì)立枯絲核菌的半抑制濃度IC50 為1.1ljg/ml，對(duì)灰葡萄孢的IC5o為2.0ijg/ml，對(duì)根霉的1〇50為17.1 |jg/ml。新化合物木霉菌酯素的抗腫瘤生物測(cè)定以對(duì)鹵蟲(chóng)(/\ntem/'a sa//>7a)的細(xì)胞毒試驗(yàn)測(cè)定新化合物木霉菌酯素的抗 腫瘤活性。鹵蟲(chóng)卵在pH 8.5的人工海水中28°C培養(yǎng)孵化24hr。將人工海水 以1:1的比例與系列濃度的木霉菌酯素溶液混合加入到試管中，每處理3個(gè) 重復(fù)，同時(shí)以蒸餾水、鬼臼毒素分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。在每個(gè)試管 中加入10只正常的鹵蟲(chóng)，培養(yǎng)24hr后觀察及記錄各處理的鹵蟲(chóng)死亡數(shù)，計(jì) 算校正死亡率，采用劑量對(duì)數(shù)-死亡率機(jī)率值法計(jì)算求得半抑制濃度(LC50)。細(xì)胞毒試驗(yàn)測(cè)定表明，化合物木霉菌酯素對(duì)鹵蟲(chóng)的LCw為1.3 |jg/ml。
權(quán)利要求
1、一種紫杉木霉菌株，保藏號(hào)CGMCC1672；在PDA固體培養(yǎng)基上20℃72小時(shí)菌落直徑37mm，25℃時(shí)55mm，30℃時(shí)71mm，35℃時(shí)不生長(zhǎng)；在PDA上的最適溫度為30℃；25℃光暗培養(yǎng)7～14天，PDA、MEA菌落邊緣形成大量白色皰狀突起，皰狀突起可愈合；瓶梗在皰狀突起中的分生孢子梗上密集輪生，瓶梗安瓿形，頂部明顯變細(xì)；分生孢子無(wú)色，光滑，橢圓形，1.7-2.0(1.9)×2.2-2.5(2.3)μm。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉木霉菌株，其特征在于該菌株具有特異性序列如下TCGCGGGGAGGATGAGGACAAGCCCAGTAGGGTTTTCCCTTGTT AGGAGTGTCACTGGTGACCCTGCGCTCGACGGCTCTTTTTCGCGGAG AACAG丌GCCTACATGTCATAGGAATGTGTTAGCGTTTTGAAACATTTC AGGATAAATGGGAATAATAAAAGGAGAATTGAAGAGAAGTGGGCAGATA ATCAAGTGTCATGAAAATGGATATGAGGTGAGATGGTGGCAAATGAAG CTGCAGCGAGAAAACATACACCACCATTCGTTCCCATGCCAAAGGCCC TTGAGTCGCCTCTTCTCCGTCGACGGCGTGCCTGGGTAAAAATCCTG GTAGCGATTCCTGGAAGGGGTCGCCATCGCCATGGTAAATGTGCGAA GCTCCAGTATTTCGTAAACTGAGGTTTGTTTCTGTTCCTGAACTTCCTA GAGTATGGCTTGGATCCAAGTC丌CCAGTAGCTCAACGGCGC。
3、 一種以權(quán)利要求1或2所述的紫杉木霉菌株在制備木霉菌酯素中的用途，其特征在于以人工發(fā)酵生產(chǎn)的紫杉木霉的發(fā)酵液為原料，濃縮發(fā)酵液 用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素； 所述的化合物木霉菌酯素，具有以下結(jié)構(gòu)-<formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以南方紅豆杉內(nèi)生真菌紫杉木霉菌株，及其在制備木霉菌酯素中的用途。木霉菌酯素具有抗腫瘤抗真菌活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物提供了天然藥物化學(xué)研究基礎(chǔ)。本發(fā)明菌株，保藏號(hào)CGMCC1672；25℃光暗培養(yǎng)7～14天，PDA、MEA菌落邊緣形成大量白色皰狀突起，皰狀突起可愈合；瓶梗在皰狀突起中的分生孢子梗上密集輪生，瓶梗安瓿形，頂部明顯變細(xì)；分生孢子無(wú)色，光滑，橢圓形，1.7-2.0(1.9)×2.2-2.5(2.3)μm。
文檔編號(hào)C12R1/885GK101113414SQ20071010625
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者林福星, 章初龍, 陳紹瑗 申請(qǐng)人:建德市大洋化工有限公司