專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶催化/酶抑制生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：植物果實(shí)(如冬瓜子等)中所含有的短鏈生物堿具有胰蛋白酶抑制劑活性。有報(bào)道稱(chēng)，從冬瓜子中提取出來(lái)的這些特殊的生物堿成分，在生理?xiàng)l件下可表現(xiàn)出減肥功效。此外，冬瓜子還具有多種其它藥用功能，如用冬瓜子提取物治療血吸蟲(chóng)病等。故冬瓜子及其提取物被廣泛接受為一種保健佳品。但是，在測(cè)定冬瓜子提取物的胰蛋白酶抑制劑活性時(shí)，卻缺乏靈敏、簡(jiǎn)便的方法?，F(xiàn)有測(cè)定方法是用牛血清白蛋白作為胰蛋白酶的作用底物，然后加入抑制劑成分，根據(jù)抑制劑加入前后牛血清白蛋白量的變化來(lái)確定胰蛋白酶抑制劑的活性。現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是牛血清白蛋白中胰蛋白酶的作用位點(diǎn)是酰氨鍵，作用不徹底，反應(yīng)靈敏度差。BAPNA(苯甲酰-L-精氨酰對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽)檢測(cè)法是以BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，已應(yīng)用到胰蛋白酶活性檢驗(yàn)過(guò)程中。采用BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，來(lái)測(cè)定胰蛋白酶抑制劑活性，使各類(lèi)胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定更為簡(jiǎn)單、方便、靈敏。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)易、靈敏、高效的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法胰蛋白酶反應(yīng)體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應(yīng)10-15分鐘后，加入反應(yīng)終止液，而后測(cè)定反應(yīng)終溶液在410nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)抑制劑的加入量與吸光度值繪制出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性;其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應(yīng)體系中0.5—1.0ml。所述反應(yīng)溫度為36-38°C。所述的反應(yīng)終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1-0.2ml。所述BAPNA溶液為稱(chēng)取40mgBAPNA溶于1.0mL二甲基亞砜中，而后用37。C的tris-CaCl2溶液稀釋至100mL。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明釆用BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，保持適合的溫度和酸堿度，再加入用胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品配制的胰蛋白酶溶液，根據(jù)所加胰蛋白酶抑制劑提取液量的差異而得到的不同吸光度值，繪制抑制劑活性曲線，確定抑制劑活性。本發(fā)明以BAPM為胰蛋白酶的作用底物，胰蛋白酶作用于BAPNA中的脂鍵，且因?yàn)锽APNA是一小分子物質(zhì)，所以反應(yīng)徹底，可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。并且可使胰蛋白酶抑制劑的微量檢測(cè)成為可能。本發(fā)明儀器簡(jiǎn)單、操作方便、反應(yīng)靈敏度高，適用于各類(lèi)胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定。本發(fā)明根據(jù)胰蛋白酶抑制劑樣品液加入量及其相應(yīng)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值的差值U,-A2)繪制曲線，其中配置對(duì)照管的目的是為了消除反應(yīng)體系中非BAPNA胰蛋白酶分解產(chǎn)物對(duì)終反應(yīng)液吸光度值的影響。反應(yīng)體系中胰蛋白酶溶液最后加入，由于醋酸溶液的存在，反應(yīng)體系pH值處在5.0~5.5范圍內(nèi)，在此pH范圍內(nèi)胰蛋白酶自身分解，而對(duì)BAPNA不起分解作用，所以反應(yīng)體系中并沒(méi)有BAPNA胰蛋白酶分解產(chǎn)物的存在，反應(yīng)終溶液的吸光度值完全由非BAPNA胰蛋白酶分解產(chǎn)物因素決定。因而，對(duì)照管吸光度值與測(cè)定管所得吸光度值的差異，便是BAPNA胰蛋白酶分解產(chǎn)物在410nm波長(zhǎng)下的吸光度值。根據(jù)胰蛋白酶抑制劑樣品液加入量及其相應(yīng)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值的差值繪制曲線，由斜率進(jìn)而計(jì)算出所測(cè)定樣品的胰蛋白酶抑制劑活性。圖l為胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定坐標(biāo)曲線圖。具體實(shí)施例方式1)pH:8.1、0.05mol/Ltris-CaCl2溶液配制(三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液)用900mL蒸餾水中溶解6.05g三羥甲基氨基甲烷及2.94gCaCl2.H20于約，調(diào)節(jié)至pH為8.1并用蒸餾水稀釋至1.0L。2)BAPNA溶液的配制稱(chēng)取40mgBAPNA溶于1.0mL二甲基亞砜中，并用已預(yù)熱到37。C的tris-CaClr溶液稀釋至100mL。配制BAPNA溶液的燒杯必須保證完全干燥，并且須將BAPNA完全溶于二甲基亞砜后，再加入tris-CaCh溶液。3)胰蛋白酶溶液的配制稱(chēng)取4.Omg胰蛋白酶(不含鹽)溶于200mL0.001mol/L的HC1溶液；冬瓜子提取物溶于10mL0.001mol/L的HC1溶液4)醋酸溶液的配制取30mL濃度為36%的醋酸溶液稀釋至100mL。測(cè)定方法首先，吸取不同量的胰蛋白酶抑制劑提取液加入事先準(zhǔn)備好的試管中(參見(jiàn)表1),以蒸餾水稀釋至2.0mL,順序加入5.0mL預(yù)熱至37。C的BAPNA溶液，2.0mL胰蛋白酶溶液，并嚴(yán)格于IO分鐘后加入1.0mL醋酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液搖勻，于410nra波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ),(參見(jiàn)表3)。表l測(cè)定管中反應(yīng)物的加入組分和含量<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表格橫列代表試管序號(hào)；表格縱列代表試管內(nèi)所加的溶液A.蒸餾水B.胰蛋白酶抑制劑樣品液C.預(yù)熱至37'C的BAPNA溶液D.胰蛋白酶溶液E.醋酸溶液，體積單位(mL)。其次，配制對(duì)照樣品液，取相應(yīng)胰蛋白酶抑制劑樣品液和蒸餾水共2.0mL(參見(jiàn)表2)，加入5.0mLBAPNA溶液并在水洛鍋中37。C恒溫反應(yīng)10分鐘，再順序加入l.OmL醋酸溶液，2.0mL胰蛋白酶液，于410nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ),(參見(jiàn)表3)。表_2對(duì)照管中反應(yīng)物的加入組分和含量<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由曲線斜率計(jì)算樣品的胰蛋白酶抑制劑活性值，因樣品吸光度值隨樣品加入量的增大而減小，故胰蛋白酶抑制劑活性值取斜率絕對(duì)值為0.0826。實(shí)施例2與實(shí)施例l不同之處在于胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法胰蛋白酶反應(yīng)體系反應(yīng)時(shí)間為12分鐘后，反應(yīng)溫度為38'C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應(yīng)體系中1.0ml。所述的反應(yīng)終止液為醋酸溶液，其加入量為0.2ml。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法胰蛋白酶反應(yīng)體系反應(yīng)時(shí)間為15分鐘后，反應(yīng)溫度為38"C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應(yīng)體系中G.8ml。所述的反應(yīng)終止液為醋酸溶液，其加入量為0.15ral。實(shí)施例3與實(shí)施例l不同之處在于胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法胰蛋白酶反應(yīng)體系反應(yīng)時(shí)間為14分鐘后，反應(yīng)溫度為36'C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應(yīng)體系中0.6ml。所述的反應(yīng)終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1ml。權(quán)利要求1.一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法，其特征在于胰蛋白酶反應(yīng)體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應(yīng)10-15分鐘后，加入反應(yīng)終止液，而后測(cè)定反應(yīng)終溶液在410nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)抑制劑的加入量與吸光度值繪制出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性；其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應(yīng)體系中0.5-1.0ml。2.按權(quán)利要求1所述的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述反應(yīng)溫度為36-38°C。3.按權(quán)利要求1所述的的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的反應(yīng)終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1-0.2ml。4.按權(quán)利要求1所述的的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述BAPNA溶液為稱(chēng)取40mgBAPNA溶于1.0mL二甲基亞砜中，而后用37。C的tris-CaCh溶液稀釋至100mL。全文摘要本發(fā)明涉及酶催化/酶抑制生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測(cè)方法。檢測(cè)具體過(guò)程主要為在胰蛋白酶反應(yīng)體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應(yīng)10-15分鐘后，加入反應(yīng)終止液，而后測(cè)定反應(yīng)終溶液在410nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)抑制劑的加入量與吸光度值繪制出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性；其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應(yīng)體系中0.5-1.0ml。本發(fā)明使用儀器簡(jiǎn)單、操作方便、反應(yīng)靈敏度高，適用于各類(lèi)胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定。文檔編號(hào)C12Q1/37GK101191142SQ20071015911公開(kāi)日2008年6月4日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者史榮久,穎張,張忠澤,慧徐,慧李,李啟平,楊偉超,韓斯琴申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所