專利名稱：：一種18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白l1基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種人乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白基因，更具體地說，涉及一種18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因。
背景技術(shù)：
：全球每年有約50萬婦女患宮頸癌(KoutskyLA.etal.EpidemiolRev1988:10:122-163)，其中約27萬因?qū)m頸癌死亡(80%以上在發(fā)展中國家)，宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌的。宮頸癌發(fā)病與人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染有直接關(guān)系，采用靈敏的檢測方法，可以從幾乎100。/。的宮頸癌患者病變組織中檢測到高危HPV-DNA。雖然，目前已經(jīng)確定的HPV型超過100種，但在全世界范圍內(nèi)，約14%的宮頸癌患者由HPV-18感染引起。而且，由于HPV18與更具侵略性生長的癌有關(guān)并且在較溫和的癌前病變(即CINWI)中很少發(fā)現(xiàn)，因此，開發(fā)抗HPV18感染的疫苗變得尤其必要。乳頭狀瘤病毒是一種DNA病毒，有兩個(gè)后期基因病毒基因組的開放讀碼框架(ORF)，甩于編碼病毒衣殼蛋白，分布被命名為L1和L2。其中，Ll蛋白是較大的衣殼蛋白，分子量為55-60kDa，L2蛋白是較小的衣殼蛋白，在病毒殼粒中大多數(shù)L2蛋白在Ll蛋白內(nèi)部，而且Ll的ORF在不同乳頭狀瘤病毒之間是高度保守的，而L2蛋白在不同乳頭狀瘤病毒之間幾乎不保守，因此，開發(fā)宮頸癌疫苗時(shí)，針對衣殼蛋白U開發(fā)具有更好的針對性。同時(shí)，根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，Ll基因是一個(gè)好的免疫預(yù)防靶。在細(xì)菌中表達(dá)的L1蛋白或使用疫苗載體的Ll蛋白用于免疫，可保護(hù)動(dòng)物不受病毒感染。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)乳頭狀瘤病毒L1基因中或使用疫苗載體導(dǎo)致組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，該病毒樣顆粒己經(jīng)用于誘導(dǎo)與保護(hù)免受病毒侵襲有關(guān)的高效價(jià)病毒中和抗體應(yīng)答，因此，開發(fā)針對衣殼蛋白Ll的宮頸癌疫苗是可實(shí)現(xiàn)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種優(yōu)化的18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因，以用于開發(fā)宮頸癌疫苗。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種表達(dá)18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達(dá)載體。3本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種表達(dá)18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達(dá)菌株。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種表達(dá)18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第一個(gè)目的通過以下方法實(shí)現(xiàn)首先，對天然的HPV18L1基因進(jìn)行改造，對其所有的氨基酸全部采用使用頻率最高的密碼子，設(shè)計(jì)出一個(gè)全新的HPVDNA序列；然后，為了避免翻譯出來的mRNA的GC比例過高，mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響，避開一些常用的酶切位點(diǎn)，對最優(yōu)的密碼子頻率進(jìn)行修正，例如將天冬酰胺(Asn)最高頻率密碼子AAC修正為AAT;賴氨酸(Lys)最高頻率密碼子AAG修正為AAA;天冬氨酸(Asp)最高頻率密碼子GAT修正為GAC;苯丙氨酸(Phe)最高頻率密碼子TTT修正為TTC;酪氨酸(Tyr)最高頻率密碼子TAC修正為TAT，甘氨酸(Gly)最高頻率密碼子GGT修正為GGA，設(shè)計(jì)出兩個(gè)全新的HPVDNA序列，并合成經(jīng)過修正的全新的HPVDNA序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的通過以下方法實(shí)現(xiàn)將合成的L1基因與畢赤酵母表達(dá)載體連接，從而構(gòu)建HPV18L1基因的畢赤酵母表達(dá)載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的通過以下方法實(shí)現(xiàn)將獲得的上述畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌，從而構(gòu)建HPV18L1畢赤酵母表達(dá)菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明提供的HPV18L1蛋白為胞內(nèi)表達(dá)蛋白。本發(fā)明提供的18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因是一種優(yōu)化過的Ll基因，具有以下優(yōu)點(diǎn)經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達(dá)目標(biāo)蛋白而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時(shí)，由于采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，因此成本低，產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。圖1是pPICZ-18Ll載體構(gòu)建示意圖。圖2是HPV18L1基因PCR擴(kuò)增圖。圖3是pPICZ-18Ll載體鑒定圖，其中，泳道1為經(jīng)BstBI+Kpnl雙酶切的pPICZaB;泳道2為BstBI+Kpnl雙酶切的pPICZ-18Ll。圖4是HPV18Ll表達(dá)Western-Blot鑒定結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)施例中DNA延伸和PCR擴(kuò)增，均采用購自Stratagene公司的熱啟動(dòng)Pfu酶。本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的pUC18質(zhì)粒購自捷瑞公司，pPICZaB質(zhì)粒購自Invitrogen公司。本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的HPV18L1的VLPs的兔多抗由上海普欣生物技術(shù)有限公司制備，MAB885鼠單抗購自CHEMICON公司，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自北京鼎國公司。本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的BALB/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。本發(fā)明的實(shí)施例中，純化步驟中使用的清洗緩沖液配方為100mMPBpH7.0，0.15MNaCl;破菌緩沖液200mMMOPS，pH7.0，0.4MNaCl，0,05%Tween-80;實(shí)施例1、HPV18的密碼子優(yōu)化的L1基因的設(shè)計(jì)與合成1.1、HPV18的密碼子優(yōu)化的L1基因的設(shè)計(jì)本發(fā)明涉及經(jīng)過畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的編碼18型人乳頭狀瘤病毒(HPV18)主要衣殼蛋白LI的DNA分子，通過密碼子最優(yōu)化和對最優(yōu)密碼子頻率進(jìn)行一定修正獲得三段DNA序列，其序列分別如SEQIDNO:l、2和3所示，具體如下首先，對天然的HPV18L1基因進(jìn)行改造，對其所有的氨基酸全部采用使用頻率最高的密碼子，設(shè)計(jì)出一個(gè)全新的HPVDNA序列，即SEQIDNO:l。然后，為了避免翻譯出來的mRNA的GC比例過高，mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響，并避開一些常用的酶切位點(diǎn)，對最優(yōu)的密碼子頻率進(jìn)行一定的修正，例如將天冬酰胺(Asn)最高頻率密碼子AAC修正為AAT，賴氨酸(Lys)最高頻率密碼子AAG修正為AAA，天冬氨酸(Asp)最高頻率密碼子GAT修正為GAC，苯丙氨酸(Phe)最高頻率密碼子TTT修正為TTC，酪氨酸(Tyr)最高頻率密碼子TAC修正為TAT，甘氨酸(Gly)最高頻率密碼子GGT修正為GGA，從而，設(shè)計(jì)出兩個(gè)全新的HPVDNA序列，其中SEQIDNO:2是SEQIDNO:l序列中修正天冬酰胺(Asn)，賴氨酸(Lys)，天冬氨酸(Asp)這三個(gè)密碼子所得的DNA序列；SEQIDNO:3是SEQIDNO:l序列中修正苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，甘氨酸(Gly)這三個(gè)密碼子所得的DNA序列。1.2、HPV18的密碼子優(yōu)化的Ll基因的合成合成如序列SEQIDNO:l所示的HPV18的密碼子優(yōu)化的Ll基因，其所需的引物組共有引物36個(gè)，分別為引物181,182,183,184，185.186,187,188，189,1810,1811,1812，1813,1814,1815,1816，1817.1818,1819,1820，1821，1822，1823，1824,1825，1826，1827，簡，1829,1830,1831,1832,1833,1834.1835,1836上述引物序列分別如SEQIDNO:4-39所示，其中每4條用下劃線相連的引物間形成一個(gè)互補(bǔ)群，可通過PCR構(gòu)建寡聚體片段，并進(jìn)而構(gòu)建密碼子優(yōu)化的HPV18的Ll基因。具體構(gòu)建方法如下1.2.1、寡聚體片段構(gòu)建將引物互補(bǔ)對181，182，183和184的在5rC退火延伸IO個(gè)循環(huán)，獲得PCR擴(kuò)增用模板，接著，用相應(yīng)的兩側(cè)引物181和184進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收獲得大小約為200bp的目標(biāo)片段(片段A)。同時(shí)，采用上述相同的方法，分別使用引物互補(bǔ)群185，186，187和188;189，1810，1811和1812;1813，1814，1815和1816;1817，1818，1819和1820;1821,1822，1823和1824;1825，1826，1827和1828;1829，1830，1831和1832;1833，1834，1835，1M^制備獲得相應(yīng)的寡聚體片段B，C，D，E，F(xiàn)，G，H和I。1.2.2、全長的密碼子優(yōu)化的HPV18L1基因構(gòu)建分別將形成互補(bǔ)寡聚群的寡聚體(片段A，片段B，片段C和片段D;片段E，片段F,片段G，片段H和片段I)在5(TC退火延伸IO個(gè)循環(huán)，獲得PCR擴(kuò)增用模板，而后用相應(yīng)的兩側(cè)引物(前一片段用引物181和1816，后一片段用引物1817和1836)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，膠回收獲得大小分別約為750bp和950bp的2個(gè)DNA片段，分別命名為片段J和片段K。再將上步獲得的片段J和片段K在5rC退火延伸IO個(gè)循環(huán)，獲得PCR擴(kuò)增用模板，然后用引物al和a2作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物al和a2序列如下所示al:5，-ATAGAATTCATGTGTTTGTACACTAGAGT-3';a2:5，-ATTGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3，。將獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，膠回收目標(biāo)片段，獲得大小約為1.7kbp的片段，并將該片段測序，該片段的序列測序結(jié)果如SEQIDNO:1所示，根據(jù)測序結(jié)果顯示該片段即是全長的密碼子優(yōu)化的HPV18L1基因。獲得的HPV18L1基因兩端以EcoRl和Kpnl酶切位點(diǎn)裝入pUC18質(zhì)粒(捷瑞公司)中，命名為pUC-18Ll，并經(jīng)測序驗(yàn)證為正確。按照類似的方法獲得SEQIDNO:2和3所示的HPV18的密碼子優(yōu)化的Ll基因。為驗(yàn)證優(yōu)化序列的可行性，下面以實(shí)施例1制備獲得的HPV16L1基因優(yōu)化序列中的一個(gè)(SEQIDNO:l)為例，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并驗(yàn)證其表達(dá)。實(shí)施例2、HPV18L1基因的表達(dá)載體構(gòu)建將SEQIDNO:l的優(yōu)化序列克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中，構(gòu)建方法如圖1所示，具體步驟如下2.1、合成擴(kuò)增HPV18L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示正向引物5，-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3，；反向弓l物5,-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3，。其中，正向引物包括一個(gè)BstBI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；反向引物包括位于終止密碼子側(cè)翼的Kpnl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，所述酶切位點(diǎn)分別如引物序列中的下劃線所示。2.2、用上述引物對為引物，以實(shí)施例l獲得的pUC-18Ll'為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，證明獲得了全長密碼子優(yōu)化的HPV18Ll基因；將擴(kuò)增獲得的PCR片段，經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶BstBI和KpnI雙酶切消化，再與BstBI/Kpnl雙酶切消化的pPICZaB(Invitrogen公司)連接。再用連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株ToplO(捷瑞公司)的感受態(tài)細(xì)胞，鋪板于含25嗎/ml零霉素的LB瓊脂上。由于pPICZaB載體上攜帶有零霉素抗性基因，因此轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含零霉素的LB培養(yǎng)基上生長。分離已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單菌落，制備質(zhì)粒DNA，并經(jīng)限制性圖譜(結(jié)果如圖3所示)和核苷酸序列分析檢測HPV18L1基因和載體序列，鑒別出包含HPV18L1基因的正確構(gòu)建體，命名為pPICZ-18Ll'，由于構(gòu)建的質(zhì)粒的分泌信號(a-factorsignal)已經(jīng)被切去，因此，表達(dá)的HPV18L1蛋白應(yīng)該是胞內(nèi)表達(dá)蛋白。實(shí)施例3、HPV18L1基因的表達(dá)菌株構(gòu)建和表達(dá)3.1、HPV18L1基因的表達(dá)菌株構(gòu)建用SacI限制性內(nèi)切酶單酶切pPICZ-18Ll，質(zhì)粒使其線性化，對空質(zhì)粒pPICZaB進(jìn)行同樣的酶切作為陰性對照。酶切反應(yīng)液加入無水乙醇，獲得DNA沉淀，用少量雙蒸水溶解線性化的pPICZ-18Ll'片段，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X-33(Invitrogen公司)，電轉(zhuǎn)化條件為DNA片段5微克，電壓1500伏，電阻25歐姆，電擊時(shí)間為5毫秒。電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪板于含200ug/ml零霉素(Zeocin)的YPDS瓊脂上，由于pPICZaB載體上攜帶有零霉素抗性基因，因此轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠在含零霉素的YPDS瓊脂上生長。分離已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單菌落，即為HPV18L1的畢赤酵母表達(dá)菌株。3.2、HPV18L1畢赤酵母表達(dá)菌株的表達(dá)將獲得的HPV18L1畢赤酵母表達(dá)菌株接種至含1000ug/ml、1500ug/ml零霉素抗性平板上。高濃度抗性平板上獲得的克隆，分別用4mlYPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，24hr后換成BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)基因表達(dá)，表達(dá)48hr后離心收獲菌體。取一部分菌體破菌處理，破菌上清用West-Blotting鑒定，結(jié)果如圖4所示，根據(jù)該圖結(jié)果，破菌上清中有HPV18L1蛋白表達(dá)。雖然在本發(fā)明的實(shí)施例2和3中，使用的是SEQIDN0:1序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，使用SEQIDN0:2和3序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，以獲得相似的結(jié)果是顯而易見的，因此，屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；而且，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，構(gòu)建相似的序列并利用該構(gòu)建的序列，使用畢赤酵母進(jìn)行克隆和表達(dá)以獲得相似甚至更優(yōu)的結(jié)果，也是顯而易見的，因此，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例4、HPV18L1蛋白檢測以純化的HPV18L1的VLPs做標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，以誘導(dǎo)前菌體做陰性對照，采用ELISA夾心法檢測HPV18L1基因在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)量，具體步驟如下用包被液2000倍稀釋HPV18Ll的VLPs的兔多抗，向酶標(biāo)板的凹孔中各加入O.lmL稀釋后的兔多抗，于4。C過夜后，移去包被液，并用0.3mLPBST洗滌凹孔，然后用0.3mL封閉液于37"C保溫2小時(shí)，進(jìn)行封閉。用稀釋液以對倍稀釋的方式，將純化的HPV18Ll的VLPs從濃度2pg/mL梯度稀釋到0.0625ng/mL，同時(shí)將獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清分別稀釋200倍，然后分別向凹孔中加入0.1mL梯度稀釋后不同濃度的HPV18Ll的VLPs溶液或稀釋后的破菌上清，于37'C保溫1小時(shí)后，移去抗原液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；然后用稀釋緩沖液將MAB885鼠單抗(購自CHEMICON公司)1000倍稀釋后加入到凹孔中，每孔各0.1mL，37'C保溫1小時(shí)后，移去單抗溶液后，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；再向凹孔中加入用稀釋緩沖液5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG各O.lmL，在37'C保溫0.5小時(shí)后，移去酶標(biāo)液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔后，向凹孔中各加入O.lmLDAB顯色液，室溫下作用20分鐘后，向每個(gè)凹孔中加入0.05mL2MH2S04終止液以終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測定OD45Q值。利用梯度稀釋的HPV18L1的VLPs的OD45。的檢測結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線換算獲得HPV18Ll蛋白的發(fā)酵表達(dá)量，結(jié)果如表l所示，其中用已測定濃度的純化目的蛋白原液稀釋一系列濃度，例如2pg/mL，1pg/mL，0.5嗎/mL，0.25ng/mL，0.125ng/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過ELISA檢測，用濃度做縱坐標(biāo)，對應(yīng)OD450檢測值做橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程。發(fā)酵破菌液上清稀釋一系列倍數(shù)，例如50，100，200,400倍。測出的OD450值通過標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程求得對應(yīng)濃度(單位為嗎/mL)，再乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為Hg/mL)。由于破菌液是由菌泥濕重破菌緩沖液-l:5配制的，所以發(fā)酵菌泥的目的蛋白表達(dá)量(單位為pg/g菌泥)為5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為iag/mL)。再乘以發(fā)酵液菌體密度(單位為g菌泥/L發(fā)酵液)，則為發(fā)酵目的蛋白表達(dá)量濃度(單位為pg/L發(fā)酵液)。發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(pg/mL)-稀釋倍數(shù)X標(biāo)準(zhǔn)目的蛋白濃度(pg/mL)XOD45o(發(fā)酵破菌液上清)/OD45G(標(biāo)準(zhǔn)目的蛋白濃度)；發(fā)酵目的蛋白表達(dá)量濃度(pg/L發(fā)酵液)=5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(嗎/mL)X發(fā)酵液菌體密度(g菌泥/L發(fā)酵液)。表l、VLPs發(fā)酵表達(dá)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l的結(jié)果可見，本發(fā)明的HPV16L1蛋白基因的優(yōu)化序列，不僅能夠在畢赤酵母中表達(dá)HPV16L1蛋白，而且表達(dá)量較高，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。實(shí)施例5、HPV18L1蛋白純化將實(shí)施例3中制備的菌體破菌離心后，取破菌上清經(jīng)過層析方法純化，得到自組裝成病毒樣顆粒的L1蛋白，具體步驟如下將表達(dá)HPV18L1VLP的畢赤酵母細(xì)胞，按l:3加入清洗緩沖液混合，充分混勻，于8000rpm，離心5min，收集細(xì)胞，重復(fù)以上操作二遍。將清洗后的細(xì)胞按h5加入破菌緩沖液混合，充分混勻后，高壓破碎以上細(xì)胞懸液，并重復(fù)操作，使90%的細(xì)胞破碎。將高壓破碎的破菌液，于9000rpm,30min，l(TC離心分離，收集離心上清。將經(jīng)過離心澄清的破菌上清通過POROS50HS(AppliedBiosystems公司)層析柱進(jìn)行初純，洗脫方式為100%緩沖液A(0.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)至100。/o的緩沖液B(1.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)的線性梯度洗脫，收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE，Westem-blot檢測。將含有HPV18L1蛋白的洗脫組分合并后，使用CHT(BIO-RADTypeII)層析柱精純，洗脫方式為100%緩沖液A(20mMPB，0.6MNaCl，50mMMOPSpH76.5，0.05%Tween-80)至100。/。的緩沖液B(200mMPB,0.6MNaCl，pH6.5,0.05%Tween-80)的線性梯度洗脫。收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE，Western-blot檢測，將含有HPV18L1VLP的組分合并，即為最后的純化樣品，其純度>90%。實(shí)施例6、HPV18L1疫苗制備參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中的方法，將實(shí)施例5中純化獲得的Ll蛋白，吸附鋁佐劑，制備獲得具有極高的免疫原性的HPV18L1疫苗。實(shí)施例7、HPV18L1基因表達(dá)產(chǎn)物免疫原性的測定選取68周齡的SPF級BALB/c小鼠，分為4組，每組6只小鼠。第1組小鼠用0.1mL含有鋁佐劑的緩沖液(0.32M氯化鈉,0.35mM硼酸鈉，0.01%吐溫-80，O.OIM組氨酸，pH6.5)進(jìn)行免疫(作為陰性對照組)，其它3組分別用O.lmL濃度為5ng/mL、0.5嗎/mL、0.05pg/mL的吸附鋁佐劑的VLP(作為檢測組)，分別于第O、7、21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后兩周采血。將采集得到的血液于37。C放置2h后，4000g離心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20。C存放，并檢測鼠血清的轉(zhuǎn)陽率和滴度，具體方法如下用包被液稀釋純化的畢赤酵母表達(dá)的HPV18L1至lpg/mL，向酶標(biāo)板每個(gè)凹孔中各加0.1mL，4"C過夜。移去包被液，用0.3mLPBST洗滌凹孔。用0.3mL封閉液(5%脫脂奶粉+PBST)于37'C保溫2小時(shí)。每凹孔加入用稀釋緩沖液(2X脫脂奶粉+PBST)以l:400稀釋的被檢血清(免疫過HPV18L1和鋁佐劑的鼠血清和只免疫鋁佐劑的鼠血清)各O.lmL，于37"C保溫1小時(shí)后移去血清液，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔。然后向每凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG各O.lmL，37。C保溫0.5小時(shí)后移去酶標(biāo)液，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；然后向凹孔中加入O.lmLDAB顯色液，室溫避光作用20分鐘后加2MH2SO40.05mL終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測定OD450值，OD450值如表2所示。表2、OD450讀數(shù)鼠1鼠2鼠3鼠4鼠5鼠65ug免疫組1.2311.2081.2291.208l駕l掘0.5ug免疫組1.1501.2441.2271.1581.2521.1710.05ug免疫組1.4240.3571.1821.1011.1642.448鋁佐劑組0.0870.2040.1550.1130.1430.100Cutoff值0.263Cutoff值為陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)抗體的OD45o值的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，0D45Q值大于Cut0ff值的小鼠判定為陽性，0D45Q值小于Cut0ff值的小鼠判定為陰性。三個(gè)檢測組的轉(zhuǎn)陽率結(jié)果如表3所示。表3、轉(zhuǎn)陽率結(jié)果5ug/mL免疫組0.5ug/mL免疫組0.05ug/mL免疫組轉(zhuǎn)陽率100%100%100%7.2、血清滴度的測定用包被液稀釋純化的HPV18Ll至lng/mL，取0.1mL加于酶標(biāo)板的各凹孔中，4。C過夜；移去包被液，用0.3mLPBST洗滌上述凹孔，再用0.3mL封閉液(5X脫脂奶粉+PBST)于1137°C，保溫封閉2小時(shí)。將被檢血清(免疫過HPV18Ll的鼠血清)用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)采用對倍稀釋方式，從l:500稀釋度一直稀釋到1:32000，陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)以l:IOOOO稀釋，每個(gè)凹孔分別加入O.lmL稀釋后血清(被檢血清或陰性對照血清)，37'C保溫1小時(shí)。移去血清液，用0.3mL洗滌液洗漆凹孔。每個(gè)凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG0.1mL，37'C保溫0.5小時(shí)。移去酶標(biāo)液后，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔，并向凹孔中加入O.lmLDAB顯色液，于室溫作用20分鐘后，加入2MH2SO40.05mL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)比色儀測定00450值。采用終點(diǎn)滴度法計(jì)算血清的滴度值，其結(jié)果如表4所示。表4、滴度測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明提供的18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因是一種優(yōu)化過的Ll基因，具有以下優(yōu)點(diǎn)經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達(dá)目標(biāo)蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時(shí)，本發(fā)明提供的18型人乳頭狀瘤病毒疫苗，能夠自組裝形成VLPs結(jié)構(gòu)，純化的VLPs吸附佐劑后，通過血清轉(zhuǎn)陽率和血清滴度的測定，說明該疫苗能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性，而且由于采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，因此該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)成本低，產(chǎn)量高，產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。序列表〈110〉上?；萆锕こ逃邢薰?lt;120〉一種18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因〈130〉P5071079<160>39〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉1707〈212〉DNA<213>畢赤酵母<400>1atgtgtttgtacac;tagagttttgattttgcactaccatttgttgcctttgtacggtcca60ttgtaccaccctcaaccattgcctttgcattccattttggtttacatggttcacattatc120atttgtggtcattacattattttgttcttgagaaacgttaacgttttcccaatcttcttg180caaatggctttgtggagaccttctgacaacactgtttacttgccacctccatccgttgct240agagttgttaacactgatgactacgttactagaacttctattttctaccacgctggttcc300tctagattgttgactgttggtaacccttactttagagttccagctggtggtggtaacaag360caagstattcctaaggtttccgcttaccaatacagagttttcagagttcaattgccagac420cctaacaagtttggtttgccagatacttctatttacaaccctgagactcaaagattggtt480tgggcttgtgctggtgttgaaattggt卿ggtcaaccattgggtgttggUtgtccggt540catcctttctacaacaagttggacgatactgagtcttcccacgctgctacttctaacgtt600tccgaagacgttagagataacgtttctgttgactacaagcaaactcaattgtgtattttg660ggttgtgctccagctattggtgagcattgggcta鄉(xiāng)gtactgcttgtaagtccagacct720ttgtctcaaggtgattgtccacctttggaattgaagaacactgttttggaggacggtgat780atggttgacactggttacggtgctatggatttctccactttgcaagacactaagtgtgaa840gttccattggatatttgtcaatctatttgtaagtaccctgactacttgcaaatgtccgct90013gatccatacggtgactctatgttcttttgtttgagaagagagcaattgttcgctagacac%0ttttggaacagsgctggtactatgggtgatactgttcctcaatccttgtacattaagggt1020actggtatgagagcttctccaggttcctgtgtttactctccttccccatctggttccatt1080gttacttctgactcccaattgttcaacaagccttactggttgcataaggctcaaggtcac1140aacaacggtgtttgttggcataaccaattgtttgttactgttgttgatactactagatcc1200actaacttgactatttgtgcttccactcaatctccagttcctggtcaatacgacgctact1260aagttcaagcaatactcc已gacacgttgaagsgtacgatttgcaattcatcttccaattg1320tgtactattactttgactgctgacgttatgtcttacattcattccatgaactcttccatt1380ttggaagattggaactttggtgttccacctccacctactacttctttggttgacacttac1440agattcgttcaMccgttgctattacttgtcaaaaggatgctgctccagctgagaacaag1500gacccttacgataagttgsagttttggaacgttgacttgasggaaaagttctctttggat1560ttggsccaatacccattgggtagaaagtttttggttcaagctggtttgagaagaaagcct1620actattggtccaagaaagagatccgctccttctgctactacttcctctaagccagctaag1680agagttagagttagagctagaaagtaa1707〈210〉2〈211〉1707〈212〉DNA<213〉畢赤酵母<400〉2atgtgtttgtacactgigagttttgattttgcsttaccatttgttgccattgtacggtccaGOttgtaccatccacaaccattgccattgcattctattttggtttacatggttcatattatt120atttgtggtcattacattattttgtttttgagaaatgttaatgtttttccaatttttttg180caaatggctttgtggagsccatctgacaatactgtttacttgccaccaccatctgttgct240agagttgtta已tactgacgactacgttactagaacttctattttttaccatgctggttct300tctagattgttgactgttggtaatccatactttagagttccagctggtggtggtaataaa360caagacattccaaaagtttctgcttaccaatacagagtttttagagttcaattgccagac420ccaaataaatttggtttgccagacacttcttgggcttgtgctggtgttgaaattggt卿catccattttac犯ta犯ttggacgacacttctgaagacgttagagacaatgtttctgttggttgtgcixcagctattggtgaacattggttgtctcaaggtgactgtccaccattggaaatggttgacactggttacggtgctatggacgttccattggacatttgtcaatctatttgtgacccatacggtgactctatgtttttttgtttttggaatagagctggtactatgggtgacactggtatgagagcttctccaggttcttgtgttacttctgactctc犯ttgtttaata犯aataatggtgtttgttggcat犯tcaattgactaatttgactatttgtgcttctactcaaaa3ttt3犯c^t3ctct￡tgax:atgttg犯tgtactattactttgactgctgacgttatgttggaagactggaattttggtgttccaccaagatttgttcaatctgttgctattacttgtgacccatacgacaaattgaaattttggaatttggacc犯tacccattgggtagaaaatttactattggtcc犯gaaaaagatctgctccaa^gtta^geigtt3g3gct3g犯犯taa〈210〉3〈211〉1707〈212〉DNAatttacaatccagaaactcaaagattggtt480ggtcaaccattgggtgttggtttgtctggt540gaatcttctcatgctgctacttctaatgtt600gactacaaaca犯ctc犯ttgtgtattttg660gctaaaggtactgcttgtaaatctagacca720ttgaaaaatactgttttggaagacggtgac780ttttctactttgcaagacactaaatgtg犯840aaatacccagactacttgcaaatgtctgct900ttgagaagagaacaattgtttgctagacat960actgttccacaatctttgtacattaaaggt1020gtttactctccatctccatctggttctatt1080ccatactggttgcataaagctc犯ggtcat1140tttgttactgttgttgacactactagatct1200tctccagttccaggtc犯tacgacgctact1260gaatacgacttgcaatttatttttcaattg1320tcttacattcattctatgaattcttctatt1380ccaccaactacttctttggttgacacttac1440caa已a(bǔ)agacgctgctcc已gctgaaaataaa1500gttg3cttg3犯g3犯3attttctttggac1560ttggttc犯gctggtttgagaagaaa^cca1620tctgctactacttcttctaaaccagctaaa16801707〈213〉畢赤酵母<400〉3atgtgtttgtatactagagttttgattttgcattatcatttgttgccattgtatggaccaGOttgtatcatccacaaccattgccattgcattctattttggtttatatggttcatattatt120atttgtggacattatattattttgttcttgagaaacgttaacgttttcccaattttcttg180caaatggctttgtggagaccatctgataacactgtttatttgccaccsccatctgttgct240agagttgttaacactgatgattatgttactagaacttcta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的畢赤酵母表達(dá)載體；C、構(gòu)建HPV18L1畢赤酵母表達(dá)菌株。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體具有權(quán)利要求1一3中任一項(xiàng)所述基因序列。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述畢赤酵母表達(dá)載體為pPICZaB。11、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)菌株的構(gòu)建包括將構(gòu)建好的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達(dá)菌株的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了一種18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因以及表達(dá)該基因的畢赤酵母表達(dá)菌株。本發(fā)明提供的L1蛋白的基因序列為畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化，并對最優(yōu)的密碼子頻率進(jìn)行一定的修正的表達(dá)L1蛋白的基因序列。本發(fā)明提供的18型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因是一種優(yōu)化過的L1基因，具有以下優(yōu)點(diǎn)經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達(dá)目標(biāo)蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時(shí)，而且由于采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，因此成本低，產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。文檔編號C12N1/19GK101440372SQ20071017093公開日2009年5月27日申請日期2007年11月23日優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日發(fā)明者克吳,張夢華,張高峽,瓊沈,袁靖宇,雷建強(qiáng)申請人:上海惠生生物工程有限公司