專利名稱：以活性藍4為配基的尼龍親和膜的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬尼龍親和膜領(lǐng)域，特別是涉及一種以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的 制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一類巰基蛋白酶，廣泛存在于番木瓜(Carica papaya)的 根、莖、葉和果實內(nèi)，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)，如啤 酒的澄清和肉質(zhì)的嫩化以及皮革、紡織、日化和制藥工業(yè)。木瓜蛋白酶的純化大部分是采 用沉淀法，但是這種方法仍然混有其他的蛋白酶，不能達到制藥工業(yè)的需求。目前，分離純化木瓜蛋白酶的方法包括粗分離和精制分離，其中粗分離包括鹽析法、 等電點沉淀法、有機溶劑分級分離法等，精制分離包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層 析、疏水層析以及共價層析等。盡管這些方法都有一定的優(yōu)點，但都存在操作繁瑣、樣品 活性回收率低、純化效果不理想等缺點，尤其是從大體積的稀溶液中提取少量的生物活性 物質(zhì)時。親和膜色譜技術(shù)的應(yīng)用可使蛋白質(zhì)純化倍數(shù)提高，而且具有選擇特異性好、壓降小、 耗時短、生物大分子在分離過程中變性幾率小、允許較快的加料速度、可以重復(fù)利用有效 降低成本等特點，與柱親和色譜相比，更易實現(xiàn)規(guī)?；兓蛛x。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用先進的親和膜色譜技術(shù)快速提純木瓜蛋白酶的方法，該 方法快速、簡便、分離量大、提取的酶活性好，純度高，適用于規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的一種以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，包括下列步驟(1) 活化后的尼龍膜，浸入殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)后，80-90。C烘干，用lvol.。/。醋酸和 去離子水沖，進行尼龍膜的改性；(2) 經(jīng)殼聚糖改性后的尼龍膜浸入Reactive Blue 4染料溶液中，保溫30-50min后，加入 質(zhì)量分數(shù)為15% 20%NaCl溶液，55。C 60。C恒溫振蕩反應(yīng)30-40min，然后升高水浴溫度， 加入Na2C03溶液，65。C 80。C繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)4-5h，分別用熱的去離子水，甲醇溶液， 2mol/LNaCl溶液，尿素溶液和去離子水充分洗滌，得以Reactive Blue 4為配基的尼龍親 和膜。所述的尼龍膜活化是指尼龍膜在25-30。C lmol/LHCl中水解后，用甲醛進行活化； 所述殼聚糖溶液是指質(zhì)量分數(shù)為2%的殼聚糖溶液(以Wol.n/。醋酸溶解)；所述的Reactive Blue 4染料溶液濃度為5mg/mL 15mg/ mL，優(yōu)選8mg/ mL 12mg/mL;所述的Na2C03溶液是指質(zhì)量分數(shù)為15。/。 20。/。Na2C03溶液； 所述的甲醇溶液是指體積分數(shù)為10%甲醇溶液； 所述的尿素溶液是指6 mol/L尿素溶液。本發(fā)明的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，包括步驟-(1) Tris—HCl緩沖液中的木瓜粉，上樣于以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜，Tris 一HC1緩沖液沖洗后，用NaSCN溶液洗脫，得到木瓜蛋白酶；(2) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。所述的Tris—HCl緩沖液是0.05mol/L lmol/LpH 8.0 8.5的Tris—HCl緩沖液，優(yōu)選 0.05 mol/L pH 8.5的Tris—HCl緩沖液；所述的木瓜粉溶液是10.0 15.0 mg/mL的木瓜粉溶液；所述的NaSCN溶液是指1 mol/L pH 6.0的NaSCN溶液。 本發(fā)明的有益效果(1) 本發(fā)明的方法操作簡單，耗時較少，純化倍數(shù)和酶活性較高；(2) 樣品來源方便，便于大規(guī)模提取純化。


圖1是利用尼龍親和膜從木瓜粉中分離純化木瓜蛋白酶的吸附洗脫曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。實施例1尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進行改性，具體步驟如下(1) 尼龍膜先在25t！ lmol/LHCl中水解24h，然后用甲醛進行活化。10張水解的尼龍 膜浸入20mL甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2 mL磷酸(85wt.%)，于6(TC反應(yīng)7 h， 40-50。C熱水水洗多次。(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜，浸入10 mL質(zhì)量分數(shù)為2%的殼聚糖溶液(以lvoLn/o醋 酸溶解)，室溫反應(yīng)lh，然后轉(zhuǎn)入8(TC烘箱，lh后取出，分別用lvo"/。醋酸和去離子水洗去未反應(yīng)的殼聚糖。尼龍膜上的殼聚糖含量可按茚三酮的方法進行測試。實施例2以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備，具體步驟如下 上述經(jīng)殼聚糖改性后的尼龍膜浸入濃度為lOmg/mL的Reactive Blue 4染料溶液中， 6(TC保溫40min后，加入質(zhì)量分數(shù)為20% NaCl溶液，恒溫振蕩反應(yīng)30min，然后升高水 浴溫度至8(TC，加入質(zhì)量分數(shù)為25。/。Na2C03溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)4h，分別用熱的去 離子水，體積分數(shù)為10%的甲醇溶液，2mol/LNaCl溶液，6 mol/L尿素溶液和去離子水 充分洗滌，直到洗滌液呈無色為止，得到以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜，保存于 雙蒸水中。實施例3以干酪素為底物的紫外分光光度法酶活的表征，具體步驟如下取O.lmL的酶液，加入0.7mL 0.05 mol/L Tris—HCl緩沖液(pH 8.0)，再加入0.2mL 的木瓜蛋白酶激活劑(上述緩沖液內(nèi)含0.5 mol/L的L一cysteine和0.02 mol/L的EDTA， pH8.0) 35'C保溫恒定，加入同樣預(yù)熱的1% (W/V)酪蛋白溶液(上述緩沖液配制)lmL， 35。C反應(yīng)15mim，加入3mL5。/。三氯乙酸(TCA)溶液終止反應(yīng)(對照組實驗先加TCA后 加底物)。靜置，8000轉(zhuǎn)/分離心20min，取濾液于280nm波長下比色。實施例4利用尼龍親和膜從木瓜粉溶液中分離純化木瓜蛋白酶，具體步驟如下 15張尼龍親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩沖液和洗脫液，首先以0.05 mol/LpH為8.5的Tris—HCl緩沖液平衡15 min，流速為1.0 mL/min，隨后以蠕動泵送入 35 mL的10 mg/mL的木瓜粉溶液通過膜橋，然后以0.05 mol/LpH 8.5的Tris—HCl緩沖液 洗去未吸附上的蛋白質(zhì)；最后以l mol/L的NaSCN的洗脫液(pH6.0)進行洗脫，得到目 標蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶。
權(quán)利要求
1. 一種以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，包括下列步驟(1)活化后的尼龍膜，浸入殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)后，80-90℃烘干，用1vol.％醋酸和去離子水沖，進行尼龍膜的改性；(2)經(jīng)殼聚糖改性后的尼龍膜浸入Reactive Blue 4染料溶液中，保溫30-50min后，加入質(zhì)量分數(shù)為15％～20％NaCl溶液，55℃～60℃恒溫振蕩反應(yīng)30-40min，然后升高水浴溫度，加入Na2CO3溶液，65℃～80℃繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)4-5h，分別用熱的去離子水、甲醇溶液、NaCl溶液、尿素溶液和去離子水充分洗滌，得以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述的尼龍膜活化是指尼龍膜在25-30°C 1 mol/LHCl中水解后，用甲醛進行活化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述殼聚糖溶液是以lvol.M醋酸溶解的質(zhì)量分數(shù)為2%的殼聚糖溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述的Reactive Blue 4染料溶液濃度為5mg/mL 15mg/ mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述的Reactive Blue 4染料溶液濃度為8mg/ mL 12mg/ mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述的Na2C03溶液是指質(zhì)量分數(shù)為15% 20%Na2CO3溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法，其特征在于 所述的洗滌是分別用熱的去離子水、體積分數(shù)為10n/。甲醇溶液、2mol/LNaCl溶液、6mol/L 尿素溶液和去離子水充分洗滌。
8. 以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，包括步驟(1) Tris—HC1緩沖液中的木瓜粉，上樣于以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜，Tris 一HC1緩沖液沖洗后，用NaSCN溶液洗脫，得到木瓜蛋白酶；(2) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，其特征在于所 述的Tris—HCl緩沖液是0.05M lMpH 8.0 8.5的Tris—HCl緩沖液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，其特征在于 所述的Tris—HCl緩沖液是0.05 M pH 8.5的Tris—HCl緩沖液。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，其特征在于 所述的木瓜粉溶液是10.0 15.0 mg/mL的木瓜粉溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的應(yīng)用，其特征在于 所述的NaSCN溶液是指1 mol/LpH 6.0的NaSCN溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及以Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜的制備方法及應(yīng)用，制備活化后的尼龍膜經(jīng)殼聚糖改性；改性后的尼龍膜浸入Reactive Blue 4染料，保溫后加入NaCl溶液反應(yīng)，升溫后加入Na₂CO₃溶液，繼續(xù)反應(yīng)，分別用熱的去離子水、甲醇溶液、NaCl溶液、尿素溶液和去離子水洗滌，得Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜；應(yīng)用木瓜粉上樣于Reactive Blue 4為配基的尼龍親和膜，Tris-HCl緩沖液沖洗，用NaSCN溶液洗脫，得木瓜蛋白酶；測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。該方法快速、簡便、分離量大、提取的酶活性好、純度高，適用于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C12N9/50GK101259405SQ200710172239
公開日2008年9月10日 申請日期2007年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者朱利民, 聶華麗, 蘇賽男, 陳天翔 申請人:東華大學(xué)