專利名稱：：一種產(chǎn)角蛋白酶的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬微生物發(fā)酵菌株領(lǐng)域，特別是涉及一種產(chǎn)角蛋白酶的新型菌株及其應(yīng)用。技術(shù)背景角蛋白大量以脊椎動(dòng)物的皮膚、毛發(fā)、羽毛、羽莖、蹄、角、爪等結(jié)構(gòu)蛋白存在于自然界中，是一種抗性很強(qiáng)的硬性蛋白，其結(jié)構(gòu)通過(guò)分子間二硫鍵、氫鍵、鹽鍵和其它鍵作用后具有很高的穩(wěn)定性，在一般條件下不溶解于水、鹽、稀酸和稀堿，且不能被一般的蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)水解。角蛋白酶是一類能夠水解角蛋白的酶類，有些角蛋白同時(shí)對(duì)除角蛋白外的多種蛋白質(zhì)有水解作用。角蛋白酶能降解角蛋白的性質(zhì)，使其在飼料工業(yè)、食品工業(yè)、皮革加工、洗滌劑行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)及環(huán)境治理等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在詞料工業(yè)中，角蛋白酶可將羽毛、豬毛等廢棄物轉(zhuǎn)化為高營(yíng)養(yǎng)的飼料蛋白。羽毛中蛋白質(zhì)含量超過(guò)90%，氨基酸含量在70%以上，還含有常量元素、微量元素、維生素以及一些未知生長(zhǎng)因子，是動(dòng)物飼料中的優(yōu)良蛋白源，但該類蛋白中存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水鍵，交聯(lián)度大，不可溶，不能被常見(jiàn)蛋白酶所降解，因而它在動(dòng)物體內(nèi)難以被消化利用。在全世界，每年家禽加工業(yè)要產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)噸羽毛廢棄物，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。采用高溫、高壓的工藝條件將其軟化，加工成動(dòng)物飼料添加劑，是減少其污染環(huán)境的有效途徑，但耗能大，處理過(guò)程中蛋氨酸、賴氨酸及色氨酸等必需氨基酸被破壞，消化性差，營(yíng)養(yǎng)性不穩(wěn)定。利用角蛋白酶可有效地解決這一問(wèn)題，它的優(yōu)點(diǎn)在于更為經(jīng)濟(jì)，提高廢棄角蛋白的利用率，同時(shí)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好，而且無(wú)污染。我國(guó)的角蛋白資源極其豐富，尤其在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，大規(guī)模的家禽養(yǎng)殖產(chǎn)生了大量的角蛋白廢物，其中羽毛廢棄物產(chǎn)量最多，年產(chǎn)量達(dá)70多萬(wàn)噸。但是大部分沒(méi)有被充分利用，有的甚至造成局部的環(huán)境污染，其分泌物所含有的致病微生物也會(huì)對(duì)人類健康造成危害。隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，飼料資源，尤其實(shí)動(dòng)物性蛋白飼料資源的缺乏逐漸明顯起來(lái)，成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的制約因素。按照我國(guó)飼料工業(yè)的發(fā)展規(guī)劃，到2010年飼料蛋白的缺口將達(dá)到800萬(wàn)噸，羽毛廢棄物的有效開(kāi)發(fā)利用對(duì)我國(guó)這種蛋白資源極度匱乏的國(guó)家有著重要的意義。角蛋白酶可應(yīng)用于皮革加工，因?yàn)榻堑鞍酌改軌蛴行У厮饷抑械慕琴|(zhì)組織，使毛發(fā)得以從中拔出。在脫毛過(guò)程中，使用含角蛋白酶的生物脫毛助劑，不僅能降低脫毛廢液中BOD(生物需氧量)和TDS(溶解固體總量)，而且能大幅度地減少硫化物的用量甚至將其棄用，有效減少了脫毛廢液對(duì)環(huán)境的污染。角蛋白酶可應(yīng)用于食品工業(yè)，如可使角蛋白降解為氨基酸和短肽，作為營(yíng)養(yǎng)學(xué)藥物；用來(lái)生產(chǎn)魚(yú)露、肉胨等高營(yíng)養(yǎng)食品，或作為肉類嫩化劑。在醫(yī)藥上，可利用角蛋白酶使其降解產(chǎn)生L-胱氨酸，具有促進(jìn)傷口愈合、治療皮膚過(guò)敏、解毒、刺激血功能、促進(jìn)白血球生成、治療肝病和放射病等醫(yī)藥用途。酶促降解所得的可溶性角蛋白是一種表面活性物質(zhì)，具有良好的乳化性能，既可用作洗滌劑的活性物又可作為農(nóng)藥的乳化劑。另外，在美容保健上，角蛋白酶可溶解皮膚表層皮屑和黑斑，使皮膚柔軟、光滑，并能去除頭皮屑、軟化頭發(fā)和頭發(fā)等。角蛋白酶的研究工作已有幾十年的歷史，自然界中許多的微生物均能分泌角蛋白酶，能特異性地分解角蛋白。在眾多微生物中，最早發(fā)現(xiàn)能降解角蛋白的就是真菌。早在1899年Ward就發(fā)現(xiàn)馬爪甲團(tuán)囊菌(O"少取"ae,'"a)。到目前為止，發(fā)現(xiàn)具有降解角蛋白能力的真菌有18個(gè)屬(C72，aspo"',，y4，rgfflws,逾erwa"'c(,7Wc/jww，wvw/an'a,C/ac/cwparZ,,Fwsan'ww,Geomyces,C7/eo附asf"Afo"oc/z'c(y51，踏ro/Z^c/w附,iaec//om>)cg>s,5!toc/^Z)o^75",iStopw/isr/o/mhSe/^c/ow/ww,/V"/c/〃/ww,Z)orato附少cey)。盡管禾中類很多，但由于這些真菌大多屬于皮膚真菌，存在致病性，而沒(méi)有太多的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。許多放線菌也能降解角蛋白，但多為鏈霉菌屬(S加j^ww;;c^)，如弗氏鏈霉菌(5^印tow^cm/raWae)，密旋鏈霉菌(Sf邵/om戸5^a"謹(jǐn))，微白黃鏈霉菌(S/邵to附戸sfl/Wi/q/7m^s)，熱紫鏈霉菌SD8(Sfr^j!7to附少ce51決enwov/o/acet^SD8)禾口未生鏈霉菌(S^eptomycesgram/"q/^c/ew")。可降解羽毛角蛋白的細(xì)菌包括芽孢桿菌(&"7/"s)，溶桿菌a"o6a"w)和細(xì)桿菌(Mfcrato"en'"m)等。角蛋白降解的特性廣泛存在于微生物世界中。但是只有少數(shù)幾種達(dá)到研究開(kāi)發(fā)的經(jīng)濟(jì)要求。芽孢桿菌(■Bad/Zw)特別是地衣芽孢桿菌(B"cd//^/^c/2em/on^)和枯草芽孢桿菌(Sacd/Z^^^rifc)產(chǎn)生的角蛋白酶由于其高效降解羽毛的特性而被廣泛地研究。1992年Lin等(ApplEnvironMicrobiol,58:3271-3275)從地衣芽孢桿菌PWD-1菌株降解羽毛的培養(yǎng)液中提取到角蛋白酶，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，該酶的分子量約為33kD，酶在pH5-12范圍都很穩(wěn)定，反應(yīng)最適溫度為5(TC，比活性為5990U/mg酶蛋白，但該角蛋白酶不能降解未高溫蒸煮過(guò)的羽毛，耐熱性差，且會(huì)自我催化裂解。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，19(4):60-65，1997對(duì)弗氏鏈霉菌S-221進(jìn)行了一系列的研究，他們用自行設(shè)計(jì)并改良的C2液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液的最后酶活達(dá)66.2ug/mL，該酶有效作用pH為7-10，在7(TC下處理0.5小時(shí)，其酶活維持在70%左右。角蛋白的微生物降解與利用的重大意義，越來(lái)越引起了人們的廣泛興趣。國(guó)外一些學(xué)者的研究工作，已涉及角蛋白酶高級(jí)結(jié)構(gòu)、活性表達(dá)分子基礎(chǔ)以及酶工程等分子生物學(xué)上的研究，主要集中在地衣芽孢桿菌的角蛋白酶基因，已測(cè)出其編碼序列而且己成功地克隆和表達(dá)。而國(guó)內(nèi)對(duì)角蛋白酶的研究還大多停留在產(chǎn)角蛋白酶菌的分離、篩選、角蛋白酶的分離純化及理化性質(zhì)的研究，以及角蛋白酶的作用機(jī)理的初步研究。而且，研究的對(duì)象也及其有限，主要集中于弗氏鏈霉菌的研究，對(duì)于細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生角蛋白酶的研究較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生角蛋白酶的新型細(xì)菌及其應(yīng)用，來(lái)源于含角蛋白的羽毛為原料的篩選，與其它降解角蛋白的菌株相比，本發(fā)明的菌株不僅可用于羽毛角蛋白的降解，還可應(yīng)用于其它多種角蛋白廢棄物的降解，菌株的發(fā)酵條件溫和，應(yīng)用方便，且該菌所產(chǎn)角蛋白酶的酶活較高，并較穩(wěn)定。根據(jù)Blast及聚類結(jié)果(圖3)，該菌與Sfe"wra;/wwwwwwa/topM/a(嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌)具有最大同源性，相似性為98%，因此命名為嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Sfe"o/哪/20wowas膨/啤M/a)DHHJ。本發(fā)明的嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(5^"o加//wwomwmo/topMZfl)DHHJ，己于2007年10月25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2231，其16SrRNA序列見(jiàn)表1。表1嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌DHHJ的16SrRNA序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGTAGGCCTAACACATG50CAAGTCGAACGGTAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCG100GACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAG150GGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATC200TTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCG250GGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAT300CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG350TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGG400GTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCA450GCCGGCTAATACCTGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGC500TAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCG550GAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGA600AAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGT650GTGGTAGAGGGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATC700AGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTG750AGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC800GCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATC850GAAGCTAACGCGTTAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGTTGCAAGACTGAAA'900CTCAAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAAT950TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTC訓(xùn)CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCT1050GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA1100ACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACC1150GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCC1200CTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGC1250AAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTG1300GAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATC1350AGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA1400CACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGG1450GCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGATTGGGGTGAAGTCAAACAAGGTTGC1500CGTATCGGAAGGTGCCGGCTGGATCACCTCCTT1533本發(fā)明提供的產(chǎn)角蛋白酶的嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌DHHJ的形態(tài)特征如下該菌菌落圓形，凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，呈淡黃色半透明狀；呼吸類型為好氧呼吸，在有氧的條件下生長(zhǎng)良好，不運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色呈陰性，電鏡觀察菌體無(wú)鞭毛，桿狀，無(wú)其它特殊結(jié)構(gòu)，為無(wú)芽孢的短桿菌，菌體大小為0.30.6x0.81.5^un(見(jiàn)圖1)。提取菌株的DNA然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，之后的測(cè)序工作由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)定菌株的16SrRNA全序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析(菌株的16SrRNA全序列見(jiàn)表1)。根據(jù)該菌株的16SrRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性高的已知菌株的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，用MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(version3)進(jìn)行分析，得到圖3所示的種系進(jìn)化樹(shù)。本發(fā)明的菌種的保存用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(w/v%):牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉0.5g(pH7.4-7.6)，40°C130rpm培養(yǎng)過(guò)夜，添加凍存緩沖液(磷酸二氫鉀0.0627g，磷酸氫二鉀0.0177g，檸檬酸鈉0.0588g，七水合硫酸鎂0.02645g，甘油10mL，加水定容至100mL);發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v%):葡萄糖lg，羽毛粉2.5g，干酪素0.2g，KC10.0373g，NaCl0.0294g，磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀0.4:0.03，吐溫800.4g(pH7.5)。將該菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)得其角蛋白酶的最高酶活為最大值達(dá)49.3U/mL，其粗酶液酶反應(yīng)的最適作用pH為7.5，最適作用溫度為4(TC，裝液量25mL/250mL，發(fā)酵時(shí)間72h，在pH6.5—8.0，4(TC以下酶活較穩(wěn)定。角蛋白酶的酶活測(cè)定方法如下參考Gradisar(GradisarH.，KernS.,FriedrichJ.,KeratinaseofDoratomycemicrosporus.Appl.Microbio.Biotech.,2000，53(2):196-200)，并在此基礎(chǔ)上稍作修改。將發(fā)酵液過(guò)濾離心，取lmL上清液，加入2.0mL0.05mol/LTris-HCl(pH-7.8)緩沖溶液，然后加入10mg羽毛粉，在4(TC恒溫水浴鍋中反應(yīng)lh后(定時(shí)取出用力振蕩)，加入2.0mL10。/o三氯乙酸TCA終止反應(yīng)。4。C9000rpm離心15min，取上清液于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。反應(yīng)前即加TCA處理用作對(duì)照。本發(fā)明的菌株可應(yīng)用于降解多種角蛋白廢棄物，對(duì)不同角蛋白底物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌DHHJ產(chǎn)生的酶可同時(shí)降解a角蛋白(牛角、羊角、指甲、羊蹄角)和P角蛋白(雞毛、鴿毛、牛毛、羊毛、頭發(fā))這兩種角蛋白(圖4)，降解范圍廣泛，且?guī)缀鯇?duì)實(shí)驗(yàn)選用的底物都有很高的降解作用，除了羊毛的酶活值稍低些，其余的底物材料降解效果都較好(羊角的酶活和雞毛、鴿毛的幾乎相等，其次是牛角和牛毛，然后是指甲和羊蹄角)，這在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以降解角蛋白的各種菌株是少見(jiàn)的。本發(fā)明的有益效果(1)為多種含角蛋白的廢棄物的降解提供了一種優(yōu)良菌種，擴(kuò)展了角蛋白廢棄物的生物降解范圍；(2)此菌的降解條件溫和(溫度條件和pH比較適中)，所產(chǎn)角蛋白酶活性高，穩(wěn)定性也較好。圖1是菌株的透射電鏡形態(tài)特征(x5000);圖2是菌株16SrRNA基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖3是菌株16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；圖4是不同角蛋白作底物時(shí)的酶活。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1(1)將從市場(chǎng)收集的大量羽毛埋于室外較濕潤(rùn)的土壤中富集培養(yǎng)，直至羽毛有明顯的降解，期間保持充足的水分。取上述腐爛雞毛lg于富集培養(yǎng)基l(牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉0.5g，pH7.4—7.6，100mL)中，于28。C、120轉(zhuǎn)/min恒溫培養(yǎng)48h。再取其培養(yǎng)液2mL轉(zhuǎn)入富集培養(yǎng)基2(可溶性淀粉2g，羽毛粉a2g，氯化鈉0.5g,pH7.4—7.6,100mL)中，28°C，120r/min進(jìn)一步富集培養(yǎng)48h。取終富集液100pL涂布于磷酸消解蛋白培養(yǎng)基(可溶性淀粉2g，磷酸消化蛋白2.5g，瓊脂粉2g，氯化鈉0.5g，pH7.4—7.6，100mL)平板，篩選出生長(zhǎng)的單菌落，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)作為對(duì)照。將初篩得到的菌種分別點(diǎn)接于磷酸消解蛋白培養(yǎng)基平板和羽毛粉平板培養(yǎng)基(可溶性淀粉2g，羽毛粉b2g，瓊脂粉2g，氯化鈉0.5g，pH7.4—7.6，100mL)平板，于33。C下恒溫培養(yǎng)48h，對(duì)照觀察兩平板上的菌種生長(zhǎng)，選定有效菌株。再將這些有效菌株涂布于磷酸消解蛋白培養(yǎng)基平板，重復(fù)幾次做進(jìn)一步的分離純化。其中，羽毛粉的處理方法羽毛粉a用洗滌劑清洗雞毛，清水洗凈后，分別以0.05%氫氧化鈉溶液和0.05%鹽酸溶液煮沸30分鐘，再以清水充分洗凈，于80'C烘干48h，用粉碎機(jī)將其分別粉碎后，過(guò)60目篩；羽毛粉b用洗滌劑清洗雞毛，清水洗凈后于滅菌鍋內(nèi)高壓蒸煮lh,再以清水充分洗凈，于8(TC烘干48h，用粉碎機(jī)將其分別粉碎后，過(guò)100目篩。(2)該菌株接種于含滅菌處理過(guò)的完整羽毛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(氯化鈉0.4g，磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀0.4:0.03，pH7.5，100mL)中，4tTC、120r/min進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，2天后即可見(jiàn)羽毛有明顯脫落，發(fā)酵5天后羽毛已完全脫落，羽梗也有一定程度的降解。經(jīng)6天發(fā)酵后降解率可達(dá)86.6%，發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量最大也可達(dá)23.88mg/mL。這表明此菌株具有較強(qiáng)降解羽毛角蛋白的能力。(3)16SrRNA測(cè)定首先按下列方法提取菌株K1的DNA:a)取lmL細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000r/min離心10分鐘，去上清液；b)立即加入600pL預(yù)熱的提取緩沖液，混勻后，65。C溫浴lh;c)冰浴冷卻(5分鐘)，加入600pL酚/氯仿(1:1)溶液，顛倒混勻后，靜置10min，然后12000r/min離心6min;d)上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中，加入等體積氯仿，靜置5min，12000r/min離心5min;e)取上清液，加入等體積異丙醇，沉淀DNA;f)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500pLTE或重蒸水中，-20°C保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)引物為BSF8/20(5、一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3、)禾口BSR1541/20(5'一AAGGAGGTGATCCAGCCG—3、)。在冰上建立反應(yīng)體系，加入10x擴(kuò)增緩沖液lOpL，物各50pmo1，4種dNTP混合物各200pmol/L，模板DNA0.12嗎，TaqDNA聚合酶2.5U，Mg2+1.5mmol/L，加雙或三蒸水至100nL。94。C預(yù)變性5min;94。C變性60sec;55。C復(fù)性30sec;72。C延伸90sec;32個(gè)循環(huán)，72。C下延伸為雙鏈10min。最后將系統(tǒng)穩(wěn)定在4。C。取3pL的PCR產(chǎn)物，在1%的瓊脂糖凝膠100V下電泳30min，電極緩沖液為0.5xTAE，然后用溴化乙錠(EB)染色檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物(結(jié)果見(jiàn)圖2)。序列的常規(guī)分析使用DNAMAN、DNASTAR等軟件進(jìn)行。序列同源性搜索使用Blast在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進(jìn)行。并應(yīng)用MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(version3)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，GenBank中的相近序列用clustalW程序進(jìn)行多序列匹配排列(multiplealignments)分析，最后形成一個(gè)多重序列匹配排列陣，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用Kimura2-parameter法，系統(tǒng)樹(shù)各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法(Bootstrap)1000次重復(fù)檢測(cè)，DNA序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值，Q^^o6ac^7'wwva/vara附做為外群，得到圖3所示的種系進(jìn)化樹(shù)。(4)頭發(fā)、羊毛、牛毛與羽毛粉b同樣處理；牛角、羊角、羊蹄角和人指甲先用洗滌劑清洗，然后烘干至恒重，用刀切成屑，再用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。將經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基在40。C下，9000r/min離心15min，取上清，即粗酶液，以不同來(lái)源角蛋白粉做底物測(cè)定發(fā)酵液上清中的酶活力，酶活結(jié)果見(jiàn)圖4。本發(fā)明所述嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌DHHJ的16SrRNA序列見(jiàn)表1。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)角蛋白酶的菌株，其特征在于，該菌株是嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJCGMCCNo.2231，其16SrRNA序列為<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2.—種產(chǎn)角蛋白酶的嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(5fem^o/^omo"osma/to;/n7/fl)DHHJ應(yīng)用于降解軟質(zhì)角蛋白雞毛、鴿子毛、牛毛、羊毛、頭發(fā)和硬質(zhì)角蛋白牛角、羊角、羊蹄角、指甲廢棄物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述角蛋白酶的酶活測(cè)定方法是將發(fā)酵液過(guò)濾離心，取lmL上清液，加入2.0mL0.05mol/LTris-HClpH=7.8緩沖溶液，然后加入10mg羽毛粉，在4(TC恒溫水浴鍋中反應(yīng)lh并定時(shí)取出用力振蕩后，加入2.0mL10Q/。三氯乙酸TCA終止反應(yīng)，4°C9000rpm離心15min，取上清液于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，反應(yīng)前即加TCA處理用作對(duì)照。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)角蛋白酶的菌株及其應(yīng)用，該菌株是嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJCGMCCNo.2231，應(yīng)用于降解軟質(zhì)角蛋白雞毛、鴿子毛、牛毛、羊毛、頭發(fā)和硬質(zhì)角蛋白牛角、羊角、羊蹄角、指甲廢棄物。與其它降解角蛋白的菌株相比，本發(fā)明的菌株發(fā)酵條件溫和，應(yīng)用方便，所產(chǎn)角蛋白酶的酶活較高，且較穩(wěn)定。文檔編號(hào)C12N9/52GK101580807SQ200710171939公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者周美華,啟張,曹張軍,晶王,麗陳,魏冬凱申請(qǐng)人:東華大學(xué)