專利名稱：快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種鑒定病毒，特別是鑒別新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的檢測 方法。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種禽的急性、高度接觸性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。世界 動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定通報(bào)傳染病，我國亦將其定為一類動物 傳染病。
隨著高度集約化養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，ND的防治備受關(guān)注。ND的現(xiàn)場診斷主 要依靠發(fā)病史、臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)調(diào)査綜合判定，這給廣大獸 醫(yī)工作人員帶來了超負(fù)荷的工作，耗時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢?，F(xiàn)場診斷工作中急需快速 準(zhǔn)確的篩檢診斷方法，以利于現(xiàn)場疫情的確認(rèn)。因此，ND疫情現(xiàn)場快速確 認(rèn)，對于采取果斷有效的撲滅和防控措施十分關(guān)鍵。另外，近年來ND的流 行趨勢發(fā)生了變化，以發(fā)病率低、臨床癥狀不明顯、病理變化不典型、死亡 率低、蛋用雞產(chǎn)蛋量下降為特征的非典型新城疫，使得ND的防治變得更加 復(fù)雜和棘手，也為NDV的檢測提出了更高的要求。隨著新城疫弱毒疫苗的 廣泛應(yīng)用，單純對NDV檢測己不能滿足生產(chǎn)的需要。亟須建立一種快速區(qū) 分NDV強(qiáng)毒株和弱毒株的檢測技術(shù)，以便有針對性地采取相應(yīng)的防治措施。 OIE規(guī)定區(qū)分NDV毒力的經(jīng)典方法主要有雞胚平均致死時(shí)間(MDT)、腦 內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、靜脈致病指數(shù)(IVPI)測定等方法。這些方法報(bào)告結(jié) 果時(shí)間長，工作量大。所以，建立一種快速鑒定NDV并能鑒別其強(qiáng)、弱毒 株的檢測方法對于ND的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為人們提供一種能快速鑒定出樣本是否為新城疫病毒， 及鑒別其強(qiáng)、弱毒株的多重PCR快速檢測方法。
本發(fā)明技術(shù)方案是先用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA，同時(shí)，采用熱裂解法提取大腸桿菌DNA模板，然后對樣本基 因的cDNA和大腸桿菌DNA模板進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最 后經(jīng)電泳鑒定。
由于單個(gè)疑似病例樣本中的特征基因數(shù)量極少，本發(fā)明通過將樣本的 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再一次性同時(shí)對可能存在的新城疫病毒融合蛋白 (F)基因和一定存在的大腸桿菌質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的基因復(fù)制片段， 比較方便， 一次就能鑒定是否為新城疫病毒，以及屬于強(qiáng)、弱毒株作出判斷。 本發(fā)明較經(jīng)典的病毒分離、鑒定和毒力鑒別試驗(yàn)方法快速、準(zhǔn)確。
該檢測系統(tǒng)具有可監(jiān)測性。擴(kuò)增結(jié)果無任何條帶時(shí)，表明檢測系統(tǒng)無效； 擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)750bp、 570bp、 200bp、 395bp四條帶中的任一條帶時(shí)，表明檢 測系統(tǒng)有效。
擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)750bp、 570bp、 200bp、 395 bp或570bp、 200bp、 395 bp或 570bp、 200bp或570bp、 395bp時(shí)，表明結(jié)果為新城疫病毒。
擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)750bp、 570bp、 200bp或570bp、 200bp時(shí)，表明結(jié)果為新 城疫病毒強(qiáng)毒株。
擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)750bp、 570bp、 395bp或570bp、 395bp時(shí)，表明結(jié)果為新 城疫病毒弱毒株。
另外，本發(fā)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I、 II，對新城疫病毒融合蛋
白基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物 I : 5'- - 3，；弓|物II : 5，-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG] -3,。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I和IV，對新城疫病毒強(qiáng)毒株融合蛋白基因 進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I : 5，- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-
3';引物IV: 5'-[A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T]-3，。
進(jìn)行pcR擴(kuò)增時(shí)，采用引物m和n，對新城疫病毒弱毒株融合蛋白基因
進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物III: 5，-[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT]-3 ， ； 引物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A )TAAAG] - 3 ，。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I 、 II ，對大腸桿菌(YZU一DSL2)進(jìn)行擴(kuò) 增，所述引物1:5，- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3，； 引物II: 5 ， - [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A )TAAAG] - 3 ，。


圖l為凝膠成像系統(tǒng)照片。
具體實(shí)施例方式
一、引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank庫中已發(fā)表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因保守序列設(shè)
計(jì)四條特異性引物(引物i、引物n、引物m、引物IV)，上述四條特異性引
物由寶生物(大連)有限公司合成。
另，GenBank中已報(bào)道新城疫病毒片段長度為570bp;新城疫病毒
強(qiáng)毒株片段長度為200bp;新城疫病毒弱毒株片段長度為395bp;指示帶
(大腸桿菌)片段長度為750 bp。
預(yù)期擴(kuò)增出的目的片段大小分為新城疫病毒:570bp;新城疫病毒強(qiáng)毒株: 200bp;新城疫病毒弱毒株395bp;指示帶(大腸桿菌)750bp。 新城疫病毒
引物I : 5， - [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3， 引物II: 5，畫[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG] - 3，
新城疫病毒強(qiáng)毒株
引物I : 5，- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3， 引物IV: 5，- [A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T] - 3，
新城疫病毒弱毒株
弓1物m: 5,-[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT] - 3 ，
引物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A )TAAAG] - 3 ，
大腸桿菌(指示菌)
引物I : 5， - [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3， 引物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A )TAAAG] - 3 ， 二、 多重RT-PCR:
1) 病毒的擴(kuò)增將新城疫病毒接種于10日齡非免疫雞胚的尿囊腔中，
36-72小時(shí)后收集死亡雞胚的尿囊液，并檢測其血凝價(jià)。
2) 病毒RNA的提取按照Trizol kit說明書提取新城疫病毒的RNA(注 在RNA沉淀時(shí)要加入糖元8-10(ig，它能夠和RNA共沉淀，用DEPC處理的 水進(jìn)行溶解。
具體步驟如下
① 20(^1被檢測液加入1 ml Trizol液后，劇烈搖勻，室溫放置5-10分鐘；
② 然后加入200|il氯仿，劇烈搖勻，室溫放置3-5分鐘；
③ 12， 000xg離心15分鐘；
吸取上清，加入糖元8-10嗎混勻2分鐘后加入異丙醇50(^1，混勻， 室溫放置IO分鐘；
⑤12， 000xg離心IO分鐘，去上清，可見沉淀，用75%乙醇洗滌，緩慢 混勻后靜置2分鐘；
7， 500xg離心5分鐘，完全去除乙醇，在超凈臺內(nèi)用風(fēng)吹5分鐘后加 入8|11 DEPC處理水溶解。
3) 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT):
A: RNA: 4^1 (最低限量2ng)
+ primer:_1 pi (弓I物I) (15(amol/L)
總體積 5|ll 經(jīng)70。C、 5min后，冰浴5min。
B : RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT) : ( ImProm-II Reverse Transcriptase Catalog#A3801 fromPromega)
① RT-buffer:
② dNTP(2.5iimol/L):
③ MgCl2(25mM):
④ RNasin(40u/iil): RT-E:
⑥ DEPC water:
⑦ A的混合液 總體積
然后25。C、 5min， 42°C 1-1.5小時(shí)反轉(zhuǎn)錄，
4,0 pl 4.0 (al 2.4 pi 1.0 pl 1.0 pl 2.6 |il 5.0 |il 20.0 pi
70°C、 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，
得cDNA'
4)采用熱裂解法提取大腸桿菌DNA模板
將大腸桿菌(YZU—DSL2)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)18h，取 細(xì)菌培養(yǎng)液0.5 ml，置于Eppendorf管中，2000 rpm離心20 min，用滅菌蒸 餾水洗滌兩次，最后用1 ml蒸餾水懸浮，隔水煮沸15 min， 8000 rpm離心 15min，取上清，即成DNA模板溶液。將DNA模板溶液用超純水作100倍 稀釋后，即成大腸桿菌(YZU—DSL2) DNA模板，備用。
:重PCR擴(kuò)增[Taq聚合酶為華美公司普通PCR擴(kuò)增酶]
5)
注:
① 10xPCRbuffer(含1.5mmol/LMg2+): 2.8 (il
② dNTP (2.5umol/L): 2.4 (il
③ 四條引物(每種引物終濃度為10pmol/L): 3.0 pi
④ Taq聚合酶 0.5^1
⑤ MgCl2(25mM): 0.5 pl
⑥ DMSO: 2.4 pl
⑦ cDNA模板 2.0 (il
⑧ 滅菌超純水 16.4 (il 總體積 30.0^1
加MgCl2視Taq聚合酶的活性而定
以30|il滅菌石蠟液體覆蓋。擴(kuò)增條件為9fC預(yù)變性5min; 94'C變性 30s， 54。C退火45s， 72。C延伸45s，共40個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min后4。C保 存。同時(shí)以水為陰性對照。
三、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10pl，點(diǎn)樣于15g/L瓊脂糖凝膠(含0.5pg/mL溴化乙錠)， 以1000bp Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子參照，以5V/cm的電場強(qiáng)度于1倍的TAE電 泳緩沖液中電泳1.5小時(shí)，紫外線鑒定，凝膠成像系統(tǒng)拍照如圖l所示。
圖1中，M. 125bpmarker; 1.新城疫病毒強(qiáng)毒株F48E8; 2.新城疫病 毒弱毒株Lasota; 3.傳染性支氣管炎病毒；4. H5亞型禽流感病毒。
四、 PCR產(chǎn)物的序列鑒定
利用DNA回收試劑盒(寶生物(大連)有限公司)從瓊脂糖凝膠中回 收PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆(pGEM-T vector)和DNA序列測定。DNA序列測定 由寶生物(大連)有限公司完成。
五、 總結(jié)
本試驗(yàn)利用四條引物，通過4.5小時(shí)，采用優(yōu)化的多重RT-PCR反應(yīng)系 統(tǒng)，成功地?cái)U(kuò)增出新城疫病毒及其強(qiáng)弱毒株的融合蛋白(F)基因特異性序 列，大腸桿菌(YZU—DSL2)指示條帶基因序列，PCR產(chǎn)物大小分別為新城
疫病毒570bp;新城疫病毒強(qiáng)毒株200bp;新城疫病毒弱毒株395bp;指
示帶(大腸桿菌)750 bp， DNA序列測定結(jié)果與GenBank中報(bào)道的基因序
列一致。<110>揚(yáng)州大學(xué)
<120>快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的PCR方法
<160>8
<210>1 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)新城疫病毒基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>1
ta(c/t)acctc(a/g)t c(t/c)cagac(a/t)gg
<20>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)新城疫病毒基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>2
ccaccagc(t/c)a (g/a)att(g/a )taaag
<210〉3 <211>20 <212〉DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>根據(jù)新城疫病毒強(qiáng)毒株基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>3
ta(c/t)acctc(a/g)t c(t/c)cagac(a/t)gg
<210>4 <211〉20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)新城疫病毒強(qiáng)毒株基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400〉4
a(c/t)(a/g)gc(a/ g)ccta taaa(g/c)cgt(t/c)t
<210>5 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220〉
<223>根據(jù)新城疫病毒弱毒株基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>5
gg(g/a)ggga(g/a)ac aggg(g/a/t)cgact
<210>6 <211>20 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<223>根據(jù)新城疫病毒弱毒株基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>6
ccaccagc(t/c)a (g/a)att(g/a )taaag
<210>7 <211〉20 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉根據(jù)大腸桿菌(指示菌)基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400〉7
ta(c/t)acctc(a/g)t c(t/c)cagac(a/t)gg
<210〉8 <211>20 <212〉DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)大腸桿菌(指示菌)基因組DNA片段設(shè)計(jì) <400>8
ccaccagc(t/c)a (g/a)att(g/a )taaag
權(quán)利要求
1、快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的PCR方法，其特征在于先用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)，采用熱裂解法提取大腸桿菌DNA模板，然后對樣本基因的cDNA和大腸桿菌DNA模板進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后經(jīng)電泳鑒定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的 PCR方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I、 II，對新城疫病毒融合蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物1:5，- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3，； 引物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG] -3,。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的 PCR方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I和IV，對新城疫病毒 強(qiáng)毒株融合蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I : 5,- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3，； 引物IV: 5，- [A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T] - 3，。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的pcr方法，其特征在于進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，采用引物m和n，對新城疫病毒 弱毒株融合蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物III: 5'畫[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT] - 3，； 弓l物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG] - 3，。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的 PCR方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用引物I、 II，對大腸桿菌(yzu—DSL2)進(jìn)行擴(kuò)增， 所述引物1:5，- [TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG] - 3，； 引物II: 5，- [CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A )TAAAG] - 3 ，。
全文摘要
快速鑒定新城疫病毒并能鑒別其強(qiáng)、弱毒株的PCR方法，涉及一種鑒定病毒，特別是鑒別新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的檢測方法。先用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)，采用熱裂解法提取大腸桿菌DNA模板，然后對樣本基因的cDNA和大腸桿菌DNA模板進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后經(jīng)電泳鑒定。本發(fā)明形成大量的基因復(fù)制片段，比較方便，一次就能鑒定是否為新城疫病毒，以及屬于強(qiáng)、弱毒株作出判斷。本發(fā)明較經(jīng)典的病毒分離、鑒定和毒力鑒別試驗(yàn)方法快速、準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/70GK101182588SQ20071019121
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者林 孫, 磊 張, 殷月蘭, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 顧志強(qiáng), 黃金林 申請人:揚(yáng)州大學(xué)