專利名稱：：具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，尤其是具有抑制水晶再結(jié)晶的活性和水核形成活性的蛋白質(zhì)及其制造方法、應(yīng)用。技術(shù)背景通常說水在o。c成為冰，但嚴格來講，已知有即使冷卻純水，在o。c也不開始凍結(jié)，即使在凝固點以下的溫度也不凍結(jié)的過冷現(xiàn)象。水的凍結(jié)是以如下過程進行的，即，當溫度為o。c以下時，存在于水中的某些物質(zhì)成為冰核，來生長結(jié)晶。如果可控制該凍結(jié)現(xiàn)象，就能應(yīng)用于以食品的冷凍保存技術(shù)、微生物或生物組織的保存技術(shù)等為代表的，人工降雨技術(shù)、冷熱輸送技術(shù)等各領(lǐng)域。作為與水的凍結(jié)有關(guān)系的物質(zhì)而被關(guān)注的是冰核蛋白質(zhì)(IceNuclearProtein;INP)和抗凍蛋白質(zhì)(Anti-FreezeProtein;AFP)。已知水核活性細菌是具有使即使在-20°C也不凍結(jié)的純水在-2~-4°C凍結(jié)的能力的細菌，作為水開始凍結(jié)時的核發(fā)揮作用，這樣的細菌是引起植物產(chǎn)生霜害的原因。作為該冰核活性細菌，已知有假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)的細菌(非專利文獻l、2)。水核蛋白質(zhì)是由這些水核活性細菌得到的具有冰核活性的蛋白質(zhì)。冰核蛋白質(zhì)大半來自微生物，也有人提出了在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用(專利文獻l-4)，但是，現(xiàn)狀是并沒太實用化。專利文獻1:日本特開平6-181729號專利文獻2:日本特許3028246號專利文獻3:日本特開平6-113712號專利文獻4:日本特許3090932號非專利文獻1:Appl.Microbiol.28，p456，(1974)非專利文獻2:Proc.4thInt.Cont.Plant.Path.Bact.P725,(1978)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的課題在于提供一種在安全性、活性、生產(chǎn)率、價格等方面良好，可在以食品為代表的廣闊領(lǐng)域使用的、具有水核形成活性的物質(zhì)。解決問題的手段發(fā)明人考慮到，由于從很多種類的生物物種中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白質(zhì)，因此，南極海中生存的磷蚱也許也含有這樣的蛋白質(zhì)，基于這樣的想法，開始了試驗，但是用公知的文獻中記載的方法，并沒能得到具有抗凍活性的物質(zhì)。通過鉆研提取方法，發(fā)現(xiàn)了具有抗凍活性的蛋白質(zhì)，進一步發(fā)現(xiàn)了具有冰核活性的蛋白質(zhì)。此外，也研究了磷奸以外的曱殼類，結(jié)果，通過采用同樣的提取方法，成功地得到具有類似的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。進而，發(fā)現(xiàn)這些具有冰核活性的蛋白質(zhì)具有抑制水晶再結(jié)晶的活性，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供(1)~(2)的抑制水晶再結(jié)晶的方法。(1)一種抑制冰晶再結(jié)晶的方法，其使用具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。(2)根據(jù)(1)的抑制水晶再結(jié)晶的方法，其中，具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)是來自曱殼類的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供具有(3)~(5)的冰核形成活性的蛋白質(zhì)。(3)—種來自曱殼類的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)(4)根據(jù)(3)的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，其中，來自曱殼類的蛋白質(zhì)是這樣的蛋白質(zhì)，即，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原下其分子量約為200000,在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。(5)根據(jù)(3)或(4)的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，其中，曱殼類是屬于蝦類、螯蝦類、蟹類、磷蝦類、蝦蛄類的任一類。本發(fā)明提供(6)(8)的含有具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)并具有冰核形成活性的曱殼類提取物。(6)—種具有冰核形成活性的曱殼類提取物，其中，含有來自曱殼類的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)。(7)根據(jù)(6)的具有冰核形成活性的曱殼類提取物，其中，來自曱殼類的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)是這樣的蛋白質(zhì)，即，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原下其分子量約為200000,在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。(8)根據(jù)(6)或(7)的具有冰核形成活性的曱殼類提取物，其中，曱殼類是屬于蝦類、螯蝦類、蟹類、磷蝦類、蝦蛄類的任一類。本發(fā)明提供(9)~(12)的具有水核形成活性的曱殼類提取物的制造方法。(9)一種來自曱殼類的具有水核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，將壓榨甲殼類的肉和/或內(nèi)臟所得到的體液，或者殼、肉和/或內(nèi)臟的提取液直接或進一步精制后進行使用。(10)根據(jù)(9)的來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，通過精制，濃縮這樣的蛋白質(zhì)，即，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原下其分子量約為200000，在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。(11)根據(jù)(9)或(10)的來自曱殼類的具有水核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，用添加有表面活性劑的提取液，從曱殼類的殼、肉和/或內(nèi)臟進行提取。(12)根據(jù)(9)、(10)或(11)的來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，曱殼類是屬于蝦類、螯蝦類、蟹類、磷奸類、蝦蛄類的任一類。本發(fā)明提供(13)~(17)的通過抑制冰晶再結(jié)晶，來抑制食品凍結(jié)引起的質(zhì)量劣化的方法。(13)—種通過抑制冰晶再結(jié)晶來抑制食品凍結(jié)引起的質(zhì)量劣化的方法，其特征在于，添加具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。(14)根據(jù)(13)的方法，其中，作為具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，添加(3)至(5)中任一項所述的蛋白質(zhì)或(6)至(8)中任一項所述的曱殼類提取物。(15)根據(jù)(13)或(14)的方法，其中，食品是冷凍食品。(16)根據(jù)(13)、(14)或(15)的方法，其中，冷凍食品是使用雞蛋、d、麥粉或魚肉作為材料的食品。(17)根據(jù)(16)的方法，其中，冷凍食品是魚肉糜或無骨魚塊。本發(fā)明提供(18)(21)的含有具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)或具有冰核形成活性的曱殼類提取物的食品的質(zhì)量改良劑以及添加該質(zhì)量改良劑的食品。(18)—種食品的質(zhì)量改良劑，其特征在于，含有(1)至(5)中任一項所述的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)、(6)至(8)中任一項所述的具有冰核形成活性的曱殼類提」取物、或用(9)~(12)中任一項所述的方法制造的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。(19)一種質(zhì)量改良的食品，其特征在于，添加(18)的質(zhì)量改良劑。(20)根據(jù)(19)的食品，其中，食品是冷凍食品。(21)根據(jù)(19)或(20)的食品，其中，食品是使用雞蛋、小麥粉或魚肉作為材料的食品。發(fā)明效果本發(fā)明的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，由于是適于添加到食品中的來自曱殼類的蛋白質(zhì)，因此能夠添加于各種食品。對具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，有人提出利用不過冷、容易結(jié)冰這種性質(zhì)的用途，不過，對食品的應(yīng)用極其有限。但是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)具有抑制冰晶再結(jié)晶的活性，通過在制造工序中添加于經(jīng)冷凍工序的食品，可以抑制由于冷凍所引起的質(zhì)量劣化。圖l是表示實施例1的從磷蝦提取的蛋白質(zhì)的色譜圖像的圖。圖2是表示實施例1的SpeacrylS-200HR凝膠過濾柱色i普圖i象的圖。圖3是在實施例2中確認本蛋白質(zhì)試樣1的分子量的、使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠的電泳照片。圖4是表示實施例3的本蛋白質(zhì)試樣1的冰核形成活性的測定結(jié)果的圖。圖5是表示實施例3的本蛋白質(zhì)試樣1的水核形成活性的溫度穩(wěn)定性的圖。圖6是表示實施例4的本蛋白質(zhì)試樣1的抑制水晶再結(jié)晶的活性的圖。圖7是實施例7的磷蝦熱水提取物的電泳的照片。圖8是表示實施例8的添加有本蛋白質(zhì)試樣1的無骨魚塊的鹽溶解性的圖。圖9是表示實施例8的添加有本蛋白質(zhì)試樣1的無骨魚塊的DMA生成量的圖。圖IO是表示實施例9的在雞蛋中添加有本蛋白質(zhì)試樣1時的凍結(jié)溫度曲線。圖ll是表示實施例IO的在肉糜中添加有本蛋白質(zhì)試樣1時的凍結(jié)解凍時的溫度歷程的圖。圖12是表示實施例10的在肉糜的加熱凝膠中添加有本蛋白質(zhì)試樣1時的凍結(jié)曲線的圖。具體實施方式在本發(fā)明中，具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)(以下，也記作冰核蛋白質(zhì))，是具有抑制水在凍結(jié)時過冷的作用的蛋白質(zhì)，已知其來自微生物。冰核形成活性引發(fā)水的凍結(jié)，使水的過冷狀態(tài)在比冰點高的溫度完成。一直應(yīng)用于人造雪等，也正在研究應(yīng)用于冷凍食品。由于在更高的溫度下冷凍會節(jié)省能源，或者根據(jù)可以抑制過冷這種性質(zhì)，提出了液態(tài)食品的冷凍濃縮、冷凍干燥等預想的用途。但是，對于這些用途，在蛋白質(zhì)來自微生物的情形中，可能由于安全性等擔憂而并沒有進行利用。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，水核蛋白質(zhì)不是僅簡單地抑制過冷，還具有抑制冰晶再結(jié)晶的活性。凍結(jié)的水因溫度上升而少量溶化時，溶化的水再次在殘存的冰晶的周圍凍凝，因此，存在這樣的現(xiàn)象，即，冰晶的大小不斷生長增大，或者小的水晶彼此相結(jié)合而形成大的結(jié)晶。該現(xiàn)象被稱作水晶的再結(jié)晶化。所說的抑制冰晶再結(jié)晶的活性，是指抑制這種再結(jié)晶化的活性。即，將小的冰晶抑制在小的狀態(tài)的活性。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，冰核蛋白質(zhì)具有抑制這樣的冰晶的生長或結(jié)合，將冰晶保持在小的狀態(tài)的性質(zhì)。由于該性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，不僅可以抑制在冷凍食品等的凍結(jié)之時的食品質(zhì)量劣化，還可抑制冷凍保存中溫度變化所引起的食品質(zhì)量劣化，可提高冰核蛋白質(zhì)的利用價值，擴大其應(yīng)用范圍。在本發(fā)明中，抑制冰晶再結(jié)晶的活性的有無，通過用顯賴t鏡觀察水晶、觀察微小水晶數(shù)的方法來測定。即，將溶解于30%蔗糖溶液的具有抑制冰晶再結(jié)晶的活性的本蛋白質(zhì)試樣2pl，滴加在蓋玻片上，進一步在其上放上蓋玻片夾住，放在可控制溫度的光學顯微鏡(奧林巴斯公司制造的BH2型顯微鏡，林克曼公司制造的LK6oo溫度控制裝置)的載物臺上，以o.rc/秒的速度反復進行冷卻、加熱，使冷卻載物臺內(nèi)的溫度依次為20°C、-30°C、20°C、-30°C、20°C、-30°C、-10°C，然后，在-10。C保持30分鐘，將具有10.0135pm2的面積的水晶作為微小水晶，數(shù)出其個數(shù)。如果不添加具有抑制水晶再結(jié)晶的活性的物質(zhì)，則冰晶生長得較大，微小冰晶減少，而如果有抑制冰晶再結(jié)晶的活性，則微小冰晶數(shù)增多。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，曱殼類的提取物具有冰核形成活性。從安全性的角度考慮，來自微生物的冰核蛋白質(zhì)經(jīng)常不太敢使用，但是曱殼類本身是食品，本發(fā)明的水核蛋白質(zhì)可放心地用于食品。壓榨曱殼類的肉、內(nèi)臟等所得到的體液，或肉、內(nèi)臟、殼的利用水等溶劑所得到的提取液，具有這種冰核形成活性。該活性，如實施例所示，在090。C左右的溫度是穩(wěn)定的，所以可以廣泛應(yīng)用于食品。在本發(fā)明中，冰核形成活性以通過蛋白質(zhì)的添加而使水的凍結(jié)溫度上升的程度來評價。具體地，向10ml的自來水中加入100^1的蛋白質(zhì)溶液，在設(shè)定于5。C的冷卻恒溫槽中溫育IO分鐘，然后，以0.3。C/分鐘的速度降低溫度，測定凍結(jié)溫度(過冷溫度)。凍結(jié)溫度越高，評^f介冰核形成活性越高。在本發(fā)明中，所說的曱殼類是指節(jié)肢動物大顎亞門曱殼綱，進一步指分類于頭奸亞綱(Cepharocarida)、槳足亞綱(Remipedia)、鰓'足亞綱(Branchiopoda)、顎足亞綱(Maxillopoda)、軟曱亞綱(Malacostraca)的動物?？梢耘e出尤其是水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)上經(jīng)常用作食用的蝦目(十足目)中所含有的奸、螯奸、蟹、磷奸目的磷奸、南極磷奸、奸蛄目的奸蛄等。對本發(fā)明的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)進行精制、濃縮，可以采用用于將蛋白質(zhì)進行提取、分離、濃縮的常用的方法。即，將存在于曱殼類的所有組織進行破碎得到懸濁液，離心分離得到的懸濁液，去除不溶性物質(zhì)。此時，通過使用表面活性劑(陰離子系、非離子系、兩性離子系、陽離子系、高分子表面活性劑等)，促進可溶化，增加提取性。非離子系的表面活性劑特別適宜。得到的上清液'可用如下所示的通常方法來分離.濃縮蛋白質(zhì)。作為利用鹽析的方法，有利用硫酸銨分級分離的分離.濃縮方法。作為利用有機溶劑的分離.濃縮方法，有使用丙酮、乙醇、丙醇、曱醇的方法。使用鹽酸、硫酸、三氯醋酸的酸沉淀法。使用水溶性聚合物(聚乙二醇、右旋糖酐的分離.濃縮方法。利用超濾(膜濃縮)的分離.濃縮方法?？梢杂秒x子交換色譜載體、疏水色鐠載體、羥磷灰石色譜載體、反相色譜載體和凝膠過濾色譜載體來分別吸附'分離。此外，也可以加熱處理上清液使其他的蛋白質(zhì)熱變性而沉淀。另外，得到的分離物也可以用冷凍干燥或噴霧干燥等進行粉末化。具體地，在肉、內(nèi)臟、殼中的任一種中都含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)，因此，將這些原料的冷凍品、生品或干燥品用均化器粉碎后，加入水進行懸濁，在約50。C放30分鐘，進行提取。對該提取物進行離心分離處理(15000G3分鐘)，則得到作為上清液的冰核蛋白質(zhì)溶液。提取溫度優(yōu)選為080°C，特別優(yōu)選為060。C左右。這是因為如果增高溫度，提取效率反而有降低的傾向。即使是該粗提取液也具有水核活性，因此，可以直接使用。在濃縮、精制時，以濃縮、精制這樣的蛋白質(zhì)為指標，所述蛋白質(zhì)是"利用十二烷基^J臾鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法進行分子量測定，在非還原條件下分子量約為200000，在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2表示的蛋白質(zhì)"，可以組合上述蛋白質(zhì)的精制、濃縮方法來進行。本發(fā)明的冰核蛋白質(zhì)，因為具有抑制冰晶再結(jié)晶的活性，因此，可以用于抑制制造工序中包含凍結(jié)工序的食品或者冷凍食品等因凍結(jié)而引起的質(zhì)量劣化。尤其可以抑制冷凍耐性低的食品，例如以雞蛋、魚肉、小麥粉等為原料的食品的質(zhì)量劣化。在魚肉的肉糜、肉末中，要抑制TMAO(氧化三曱胺)在冷凍保存中被分解成DMA(二曱胺)和曱醛。已知甲醛是冷凍變性的原因。冷凍魚肉在冷凍中，反復進行冰晶的再結(jié)晶化，產(chǎn)生冷凍濃縮，因此，認為TMAO的分解被促進，通過本發(fā)明的冰核蛋白質(zhì)抑制冰晶再結(jié)晶的活性，該冷凍濃縮被抑制，結(jié)果，TMAO的分解被抑制。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有冰核形成活性、抑制冰晶再結(jié)晶的活性，所以，通過添加于食品，可以抑制凍結(jié)引起的食品的劣化。對食品的添加量因食品的種類、使用目的而異，但相對于食品的總重量，在實施例1的本蛋白質(zhì)試樣1程度的純度的情形中，優(yōu)選添加0.00001%~10%,更優(yōu)選添加0.001%~0.1%左右。以下，記載了本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并不限于這些實施例。實施例1<從南極磷蝦(整體)提取.精制具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)>對冷凍南極磷壞80g,使用420ml的含有50mM碳酸氬銨(pH7.9)、lmMPMSF的提取液，用均化器進行懸濁。向該懸濁液中加入Triton-XlOO(sigma公司制造)使其為0.1%,在冰浴下攪拌1小時。然后，對該懸濁液在10000xg的條件下進行30分鐘的離心分離，對得到的上清液進行硫酸銨分級分離。即，對添加35~65%飽和硫西吏銨而得到的沉淀，在10000xg的條件下進行30分鐘的離心分離，并回收。對該沉淀添加含有1M硫酸銨、50mM碳酸氬銨(pH7.9)(A液)的溶液^f吏其懸濁。對該懸濁液在10000xg的條件下進行20分鐘的離心，將得到的上清液供于用上述A液的緩沖液平衡的2.6cmx20cm(106ml)的疏水柱色譜(TOYOPEARLPhenyl650M東曹公司)，使用50mM碳酸氬銨(pH7.9)(B溶液)用線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。結(jié)果，得到圖1所示的色譜的A峰的級分。進一步將該級分放入透析膜，在其周圍涂滿聚乙二醇6000(和光純藥工業(yè)抹式會社制造)，在4。C下靜置約3小時，濃縮約10倍。接著，將其在10mM碳酸氫銨(pH7.9)溶液中于4。C透析一晚。透析后，供于用同溶液預先平衡的1.6cmx60cm的SephacrylS-200HR凝膠過濾柱色語。得到圖2所示的色語的箭頭所示峰的級分。將該級分;^文入透析膜，用蒸餾水進行透析，然后，將其冷凍干燥。通過該精制方法，從80g的冷凍南極磷蝦中得到80mg的蛋白質(zhì)(本蛋白質(zhì)試樣1)。實施例2<本蛋白質(zhì)試樣1的分子量等性質(zhì)確認>通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定本蛋白質(zhì)試樣1的分子量。使用10%丙烯酰胺凝膠，采用含有0.1。/。SDS、25mM三羥曱基氨基曱烷、192mM甘氨酸(pH8.6)的緩沖液，以12mA進行約2小時的電泳，然后，用CBBR-250來對蛋白質(zhì)進行染色。結(jié)果顯示出，該蛋白質(zhì)具有由約86kDa或90kDa的單體構(gòu)成的約200kDa的亞單位結(jié)構(gòu)(圖3;最左列表示分子量標記，從左邊數(shù)第2列表示200kDa的亞單位，第3列表示86kDa或90kDa的單體)。糖鏈的確認是，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠在室溫下于7.5%的醋酸溶液中浸漬約1小時。接著，移入0.2%過碘酸中，在4。C下溫育45分鐘。進一步，移入希夫試劑(和光純藥工業(yè)(林))中，冷凍45分鐘。然后，除去希夫試劑，用10%醋酸洗滌。結(jié)果，86kDa、90kDa、200kDa的帶顯色，表示這些蛋白質(zhì)帶有糖(圖3;從右邊數(shù)第2列)。脂質(zhì)的確認是，通過NileBlueA(耐爾藍A)來檢測。NileBlueA溶液是通過將0.25g溶解于100ml的蒸餾水中，然后加入lml濃^ii酸，之后煮沸2小時，用過濾器過濾來制成的。向該溶液中移入電泳后的凝膠，在50。C溫育30分鐘。然后，移入5°/。醋酸溶液中，在50。C溫育2天，進一步，在這之后在0.5%鹽酸溶液中溫育5分鐘，用蒸餾水洗滌。結(jié)果，86kDa、90kDa、200kDa的帶顯色，表示這些蛋白質(zhì)結(jié)合了脂肪酸(圖3;最右列)。<氨基酸序列分析>對本蛋白質(zhì)試樣l的N末端氨基酸序列進行分析。即，與分子量的確認方法同樣地進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印裝置轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上。切下本蛋白質(zhì)試樣1的帶，用氨基酸測序儀(ABI公司制造的473A型氨基酸測序儀)來分析其N末端氨基酸序列。從其結(jié)果可知，本蛋白質(zhì)試樣的N末端的氨基酸序列如序列表的序列號1和2所示。另外，這也顯示出，在本蛋白質(zhì)試樣l中，存在具有類似的氨基酸序列的同等型(isoform)。實施例3<冰核形成活性的測定>對上述本蛋白質(zhì)試樣1,用以下方法測定水核形成活性。向10ml的自來水中加入100^1的蛋白質(zhì)溶液，在設(shè)定為5。C的冷卻恒溫槽中溫育IO分鐘，然后，以0.3。C/分鐘的速度降低溫度，測定凍結(jié)溫度(過冷溫度)。結(jié)果，如圖4所示，蛋白質(zhì)濃度在0200|ig/ml的范圍內(nèi)，過冷溫度濃度依賴性地升高，在lOOpg/ml的濃度，升高至-8。C。作為對照的自來水的過冷卻溫度是-13。C。因而，顯示出本蛋白質(zhì)試樣1是具有使過冷溫度升高的冰核形成活性的蛋白質(zhì)。<冰核形成活性的溫度穩(wěn)定性>對本蛋白質(zhì)試樣1的溫度穩(wěn)定性進行試驗。將試樣溶解于50mM碳酸氬銨水溶液(pH7.9)(蛋白質(zhì)濃度7.5mg/ml)，在0卯。C中分別保持1小時，然后，測定冰核形成活性。結(jié)果顯示出，對于在0。C保持的試樣的活性，冰核形成活性保持90106%，是熱穩(wěn)定的。實施例4<抑制水晶再結(jié)晶的活性的測定>作為本蛋白質(zhì)試樣l的抑制冰晶再結(jié)晶的活性，用顯微鏡觀察冰晶，觀察微小冰晶數(shù)。即，將溶解于30%蔗糖溶液的本蛋白質(zhì)試樣2^11，滴加在蓋玻片上，進一步，在其上放上蓋玻片夾住，放在光學顯微鏡(奧林巴斯公司制造的BH2型)的載物臺上，利用溫度控制裝置(林克曼公司制造的LK600),以0.1°C/秒的速度反復進行冷卻、加熱，使冷卻載物臺內(nèi)的溫度依次為20°C、-30°C、20°C、-30°C、20°C、-30°C、-10°C,然后，在-10。C保持30分鐘，數(shù)出具有10.0135pm2的面積的冰晶作為微小冰晶。結(jié)果，如圖6所示，雖然本蛋白質(zhì)試樣1不具有抗凍活性，但是在濃度2.2xl(T1()2.2xlO-2mg/ml的范圍內(nèi)，確認有與魚類抗凍蛋白質(zhì)(A/F蛋白質(zhì)公司(A/FProteinInc.)AFPTypeIII)幾乎同樣的抑制冰晶再結(jié)晶的活性。這里，針對其他的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)是否具有這樣的抑制水晶再結(jié)晶的活性，進行了試驗。使用冰核活性細菌即"菌體破碎物黃單胞菌屬制造(和光純藥工業(yè))"作為樣品，進行同樣的實驗。如圖6所示，來自細菌的冰核形成蛋白質(zhì)也確認有抑制冰晶再結(jié)晶的活性。此前，還沒有凈艮告說具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)具有再結(jié)晶抑制活性，但推測冰核形成蛋白質(zhì)在形成冰核時，產(chǎn)生多個冰核，從而，限制了各個冰晶的大小，對最終的冰晶的大小產(chǎn)生了影響。該冰核形成蛋白質(zhì)具有抑制冰晶再結(jié)晶的活性的這種結(jié)果，是新的認識。實施例5<從南極磷蝦的各部位得到的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)的精制>為了確認在磷奸的什么部位上較多地含有上述具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，將其分為眼球、身體的肉、肝胰臟、殼，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行確認，結(jié)果確認在哪個部位上都存在。因為確認尤其在殼中較多地含有，因此，從南極磷奸的殼中，用與實施例1相同的方法進行精制，結(jié)果，從10g的殼中得到20mg的蛋白質(zhì)。實施例6<來自曱殼類的蛋白質(zhì)的水核形成活性的測定〉對來自磷蝦以外的曱殼類的蛋白質(zhì)的冰核形成活性進行觀察。通過與實施例1同樣的方法，乂人阿^立斯力。蟹(Paralithodescamtschaticus)、雪蟹(Chionoecetesopilio)、克氏原螯奸(Procambarusclarkii)的殼精制蛋白質(zhì)，進行觀察，結(jié)果確認具有冰核形成活性(表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*1:蛋白質(zhì)濃度是lmg/ml*2:蛋白質(zhì)濃度是0.1mg/ml實施例7<從南極磷壞熱水提取具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)>用均化器粉碎冷凍南極磷奸15g之后，加入水15g進行懸濁，在不同的溫度條件下(50°C、80°C、100°C)下溫育30分鐘，制作出提取物。接著，對得到的提取物進行離心分離處理(15000G的條件下離心3分鐘)，對得到的提取液進行SDS-丙烯酰胺電泳分析。圖7顯示電泳結(jié)果。另外，道A中上樣的是5(TC提取物，道B中上樣的是50。C提取物的離心上清液，道C中上樣的是80°C提取物，道D中上樣的是8(TC提取物的上清液，道E中上樣的是IO(TC提取物，道F中上樣的是100。C提取物的上清液。如圖7所示，80。C以上的提取中幾乎看不到目的蛋白質(zhì)。另一方面，5(TC提取物的離心上清液中含有大量的目的物，可以有效地提取。實施例8<對食品的應(yīng)用1:水產(chǎn)品-添加于明太無骨魚塊->從在三陸沖捕獲的鮮魚即明太魚上取下肉，用3mm目的絞碎機制成碎肉。取500g碎肉，加入水50g、砂糖50g，進一步加入本蛋白質(zhì)試樣1使其分別為0~0.1%,用臺式攪拌器攪拌25秒鐘。將其用作無骨魚塊樣本。接著，將各在-25i:下凍結(jié)一晚后，在-l(TC下保存2周的樣本，用于測定作為保存性評價指標的鹽溶解性、TMAO分解度。鹽溶解性的測定向無骨魚塊3g中加入0.1MKC120mMTris-HCl(pH7.5)溶液27ml,進行均化(10000rpmx30秒鐘3次)，然后，進行5000rpmx10分鐘的離心分離，得到沉淀物，進一步向該沉淀物中加入與上述相同的溶液27ml,進行攪拌。再次進行5000rpmxl0分鐘的離心分離，對得到的沉淀物加入0.5MKC120mMTris-HCl(pH7.5)溶液27ml進行攪拌，加入1MATP30(xl在水冷藏下保存一晚。然后攪拌，用雙縮脲法測定其懸濁溶液的蛋白質(zhì)濃度和容量。進一步對懸濁溶液進行7000rpmx15分鐘的離心分離，用雙縮脲法測定得到的上清液的蛋白質(zhì)濃度，并測定容量。通過以上測定，從所述的上清液中的蛋白質(zhì)量與懸濁液中的蛋白質(zhì)量之比來算出鹽溶解性。結(jié)果，如圖8所示，鹽溶解性隨著本蛋白質(zhì)試樣1的添加量的增加而增加，通過添加本蛋白質(zhì)試樣l，顯示出抑制冷凍保存時的明太無骨魚塊的質(zhì)量劣化的傾向。TMAO的分解反應(yīng)的測定對無骨魚塊樣本10g加入蒸餾水10ml、10%三氯醋酸(TCA)10ml，進行均化(12000rpmx2分鐘)。然后，進行離心分離(7500x20分鐘)，得到上清液。向沉淀物中加入5ml的5。/。TCA溶液充分攪拌，進行離心分離，得到上清液。該操作進行2次，將至此得到的上清液加入50ml的容量瓶中，進一步用5。/。TCA溶液定容，將其作為TCA提取液。將TCA提取液lml和蒸餾水3ml進行混合，添加銅-銨試劑0.4ml、5%二石克化石友-苯溶液，在40。C溫育5分鐘。然后，反復振動，進行離心分離(3500x5分鐘)，將得到的上清液移入加入了約0.2g無水疏酸鈉的試管中，測定該溶液在440nm的吸光值。生成的DMA量用下式表示。DMA量(mM)=(440nm測定值)+1.3x2x50+1000+(樣本重量)xl000由TMAO的分解所產(chǎn)生的DMA的生成量，如圖9所示，隨著本蛋白質(zhì)試樣1的添加量而降低。通過添加本蛋白質(zhì)試樣1,生成與TMAO的分解所產(chǎn)生的DMA等量的曱醛。抑制DMA的生成量，意味著抑制曱醛的生成，表示抑制曱醛在冷凍保存時引起的明太無骨魚塊的冷凍變性。實施例9<對食品的應(yīng)用2:雞蛋的生的整蛋>向雞蛋的生的整蛋30ml中添加以蛋白質(zhì)濃度計0.56mg的本蛋白質(zhì)試樣1。接著，將整蛋;^文入偏氯乙烯性的包裝(吳羽綸(夕k乂、口>)DB56R)中，在-2(TC保存一天。在凍結(jié)時，測定其溫度歷程(圖10)。另外，凍結(jié)后，在室溫下解凍，在沸水中加熱，制成凝膠。結(jié)果，過冷溫度在對照中為-irc，而如果添加本制品，則上升至-8.56。C。另外，從解凍后的整蛋來看，對照品具有很爽快的流動性，而添加本制品的整蛋具有幾乎與未凍結(jié)時一樣的粘性。當用掃描型電子顯微鏡觀察加熱凝膠截面時，本制品添加品的凝膠的網(wǎng)絡(luò)致密。通過添加本制品，可以提高凍結(jié)整蛋的質(zhì)量。實施例10<對食品的應(yīng)用3:肉糜>向明太魚冷凍肉糜30g中添加以蛋白質(zhì)濃度計0.56mg的本蛋白質(zhì)試樣1，用食品切割機混合。接著，將該肉糜放入偏氯乙烯性的包裝(吳羽綸DB56R)中，在-20。C保存一晚后，解凍。在凍結(jié)解凍時，記錄溫度歷程(圖11)。另外，解凍之后，裝入包裝中在沸水中加熱30分鐘。結(jié)果，從凍結(jié)溫度來看，對照品在-9。C附近產(chǎn)生過冷，而如果添加本制品，則在-3。C附近開始凍結(jié)，不進一步產(chǎn)生過冷。另外，在室溫(25°C)下的解凍中，含有本制品的肉糜遲了約l小時30分鐘才開始解凍。另外，從這些肉糜的加熱凝膠的凍結(jié)曲線(圖12)來看，最大冰晶生成帶(-1°C~-5°C)的通過時間中，添加本制品的則早通過約IO分鐘。工業(yè)上的應(yīng)用性本發(fā)明的蛋白質(zhì)在甲殼類的殼中較多地含有，所述曱殼類的殼除了用作膳食、曱殼質(zhì)、殼聚糖的原料以外，其大半多被廢棄，因此可以大量制備，并且能夠廉價地生產(chǎn)。另外，因為是來自食品的蛋白質(zhì)，所以容易應(yīng)用于對食品的添加。本發(fā)明的蛋白質(zhì)由于具有抗凍活性和抑制冰晶再結(jié)晶的活性，因此，能夠廣泛應(yīng)用于冷凍食品等的質(zhì)量保持等目的。序列表自由文字序列號1N末端氨基酸序列序列號2N末端氨基酸序列[配列表]<110>日本水產(chǎn)纟朱式會社<120>具有水核形成活性的蛋白質(zhì)<130>YCT-1257<141>2007-03-13<150>JP2006-67758<151>2006-03-13<160>2<210>1<211>20<212>PRT<213>南才及石粦奸(Euphausiaceasp.)<400>DYDVAHEQQDVNAFLTKITG(—字母符號)AspTyrAspValAlaHisGluGinGinAspValAsnAlaPheLeuThrLyslieThrGly(三字母符號)<210>2<211>18<212>PRT<213>南才及石岸奸(Euphausiaceasp.)<400>SDPKFQQDINTRLXNVYE(—字母符號)SerAspProLysPheGinGinAsplieAsnThrArgLeuXaaAsnValTyrGlu(三字母符號)權(quán)利要求1.一種抑制冰晶再結(jié)晶的方法，其特征在于，使用具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制冰晶再結(jié)晶的方法，其中，具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)是來自曱殼類的蛋白質(zhì)。3.—種具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，其來自甲殼類。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)，其中，來自曱殼類的蛋白質(zhì)是下述這樣的蛋白質(zhì)利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原條件下其分子量約為200000,在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，其中，曱殼類是屬于奸類、螯蚱類、蟹類、磷奸類、奸蛄類中的任一類。6.—種具有水核形成活性的曱殼類提取物，其特征在于，含有來自曱殼類的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有水核形成活性的甲殼類提取物，其中，來自甲殼類的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)是下述這樣的蛋白質(zhì)利用十二烷基石危酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原條件下其分子量約為200000，在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，其中，曱殼類是屬于蝦類、螯蝦類、蟹類、磷蝦類、蝦蛄類中的任一類。9.一種來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，將壓榨曱殼類的肉和/或內(nèi)臟所得到的體液，或者殼、肉和/或內(nèi)臟的提取液直接或進一步精制后進行使用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，通過精制，濃縮下述這樣的蛋白質(zhì)利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定分子量，在非還原條件下其分子量約為200000,在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸用序列號1或2來表示。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，用添加有表面活性劑的提取液，從曱殼類的殼、肉和/或內(nèi)臟進行提取。12.根據(jù)權(quán)利要求9、10或11所述的來自曱殼類的具有冰核形成活性的曱殼類提取物的制造方法，其特征在于，曱殼類是屬于蝦類、螯蝦類、蟹類、磷蝦類、蝦蛄類中的任一類。13.—種通過抑制冰晶再結(jié)晶來抑制食品的凍結(jié)引起的質(zhì)量劣化的方法，其特征在于，添加具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，作為具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，添加權(quán)利要求3至5中任一項所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求6至8中任一項所述的曱殼類提取物。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，食品是冷凍食品。16.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15所述的方法，其中，冷凍食品是使用雞蛋、小麥粉或魚肉作為材料的食品。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，冷凍食品是魚肉糜或無骨魚塊。18.—種食品的質(zhì)量改良劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1至5中任一項所述的具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求6至8中任一項所述的具有水核形成活性的曱殼類提取物、或用權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法制造的具有水核形成活性的蛋白質(zhì)。19.一種質(zhì)量改良的食品，其特征在于，添加權(quán)利要求18所述的質(zhì)量改良劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的食品，其中，食品是冷凍食品。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的食品，其中，食品是使用雞蛋、小麥粉或魚肉作為材料的食品。全文摘要本發(fā)明提供一種具有冰核形成活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是來自甲殼類的蛋白質(zhì)，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺電泳法測定其分子量，在非還原條件下其分子量約為200000，在還原的情形中，顯示出約86000的帶和約90000的帶，N末端氨基酸如序列號1或2所示。該蛋白質(zhì)在甲殼類的殼中較多地含有，所述甲殼類的殼除了用作膳食、甲殼質(zhì)、殼聚糖的原料以外，其大半多被廢棄，因此該蛋白質(zhì)可以大量制備，并且能夠廉價地生產(chǎn)。另外，因為是來自食品的蛋白質(zhì)，所以容易應(yīng)用于對食品的添加。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有冰核形成活性、抑制冰晶再結(jié)晶的活性，因此，能夠廣泛應(yīng)用于冷凍食品等的質(zhì)量保持等目的。文檔編號A23L1/10GK101400696SQ20078000873公開日2009年4月1日申請日期2007年3月13日優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日發(fā)明者久保田光俊,岡本直子,千葉智,西澤聰子,鈴木賢一申請人:日本水產(chǎn)株式會社